《基于聚合酶基因序列的HIV-1耐药突变分析技术规范（征求意见稿）》标准文本

1基于聚合酶基因序列的HIV-1耐药突变分析技术规范核酸提取、基因扩增、序列测定、耐药分析、结果解释、质量控制以及生物安全本文件适用于全国各级各类开展基于聚合酶基因序列的人免疫缺陷病毒1型基因型耐药检测的实验GB/T30989高通量基因测序技术GB/T34265Sanger法测序技术WS293艾滋病和艾滋病病毒感染诊断3.13.23.33.43.5基因型耐药检测genotypicdrugr通过分析HIV-1基因序列，确定其中是否存在导致耐药3.6逆转录聚合酶链反应reversetranscription-polymerasechainreaction;23.73.83.9高通量基因测序high-throughputg3.103.11对检测过程的质量进行评估，以判断其是否满足预期的质量标准或要3.12质控品qualitycontrol3.13指基因序列中某个位点的碱基无法确定，可能是多个碱基中的一种。3.143.153.16指测序数据中,对质量值为30的碱基识别准确率为99.9%,或3.174缩略语HIV-1：人免疫缺陷病毒1型（humanimmunoPCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaRT-PCR:逆转录聚合酶链反应（reversetranscription-polymerasechainreacRT：逆转录酶（reversetranscriptionpolym常用的样本是血浆，也可使用血清、干血斑、全血或外5.2样本采集、处理和保存按照WS293-2019和GB19489的规定执行。应避5.2.1血清采集静脉血，使用促凝剂，分离血清，-705.2.2血浆5.2.3全血5.2.5干血斑6.1提取方法根据样本和核酸类型，选择适宜的方法提取和纯化样本中的病毒核酸，严格按照说明书操作。6.2低病毒载量血浆样本的处理6.3质量评估4可检测核酸浓度和纯度评估核酸质量，能满扩增的目标区域一般应包括蛋白酶区第10至第93位密码子和逆转录酶区第41至第238位密码子，及整合酶区第51至第263位密码子。根据扩增片段两端的碱基序列设计特异性引物。可参7.3扩增体系和程序应按照试剂盒说明书或实验室自建方法的标准操7,4质量控制确认扩增片段大小。阳性对照扩增出大小正确的目的片段、阴性对照无扩增产物，说明扩增成功。8.1测序方法采用切胶纯化或其他方法纯化扩增产物，使用Sanger法对扩增产物直8.2测序区域8.3序列质量评价根据测序色谱图评价测序质量，合格的序列碱基峰的质量分数应≥20，且长度≥500b59.1.2高通量测序9.2耐药突变判读将拼接编辑好的序列提交给特定的HIV耐药分析数据库或者软件，通过与参考序列比对，判读耐药9.3耐药程度判读通过HIV耐药分析数据库判断突变对药物耐受性的影响以及耐药程度。参9.4结果复核9.4.1耐药突变复核9.4.2耐药程度复核10.2结果解释611.2使用室内质控品制备含耐药突变或不含耐药突变的、不同病毒载量的阳性质控品，以及不含HIV的阴性质控品，与待测样本同步检测，根据质控品的检测结果，判断检测是否在控，对失控结果及时11.3能力验证可定期参加省级及以上专业机构组织的HIV耐药检测室间质量评价HIV-1基因型耐药检测应在市级卫生主管部门备案的生物安7HIV-1pol基因区常用扩增引物PR-RT基因PCR5,-TGAARGAITGYACTGARAGRCAGGCTAAT-3,5,-ACTGARAGRCAGGCTAATTTTTTAG-3,5,-TAGGGARAATYTGGCCTTCC-3,5,-ATCCCTGCATAAATCTGACTTGC-3,5,-CTTTARCTTCCCTCARATCACTCT-3,5,-CTTCTGTATGTCATTGACAGTCC-3,5,-AGTCCTATTGARACTGTRCCAG-3,5,-TACTAGGTATGGTAAATGCAGT-3,5,-TTTYTCTTCTGTCAATGGCCA-3,5,-CAGTACTGGATGTGGGRGAYG-3,注：适合HIV-1不同亚型毒株PR-RPR-RT基因5,-CTGCCAGTTCTAGCTCTGCTTC-3,5,-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3,5,-TTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3,PCR5,-CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG-3,RTAS-qian5,-GCCAACAGCCCCACCA-3,5,-GGACCTACACCTGTCAAC-3,5,-CCTAGTATAAACAATGAGACAC-3,5,-GCTGGGTGTGGTATTCC-3,5,-GTTCTAGCTCTGCTTC-3,8PR-RT基因扩5,-CTGCCAATTCTAATTCTGCTTC-3,5,-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3,5,-TGGAAATGTGGAAAAGAAGGAC-3,PCR5,-CTGTATTTCAGCTATCAAGTCTTTTGATGGG-3,5,-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3,5,-GGACCTACACCTGTCAAC-3,5,-CCTAGTATAAACAATGAGACAC-3,5,-GCTGGGTGTGGTATTCC-3,5,-CTGCCAATTCTAATTCTGCTTC-3,5,-GGRATYATTCARGCACAACCAG-3,5,-GCATTAGGRATYATTCARGCAC-3,5,-TGGGATRTGTACTTCYGARCTTA-3,5,-TCTAYCTGKCATGGGTRCCAGCAC-3,–5214-5192PCR5,-CATCCTGTCTACYTGCCACAC-3,–5088-50685,-TCTAYCTGKCATGGGTRCCAGCAC-3,5,-CATCCTGTCTACYTGCCACAC-3,5,-GGVATTCCCTACAATCCCCAAAG-3,5,-GAATACTGCCATTTGTACTGCTG-3,–5088-506895,-TTGGAGGAAATGAACAAGTAGATAAATTAGT-3,5,-AATCCTCATCCTGTCTACTTGCCACACAATC-3,5,-TTTTAGATGGAATAGATAAGGCYCAAGA-3,PCR5,-GCCACACAATCATCACCTGCCATCTGTTTT-3,5,-TTTTAGATGGAATAGATAAGGCYCAAGA-3,5,-GCCACACAATCATCACCTGCCATCTGTTTT-3,5,-TAAGACAGCAGTACAAATGGCAG-3,5,-GCTGTCCCTGTAATAAACCCG-3,4919-4899包括序列清理、拼接和混合碱基判断，以及序列处理过程中的质量对测序片段两端较为集中的模糊碱基和碱基信号可信度较低的区域进行剪将高质量序列与HIV-1标准参考株(HXB2)或其他参基于变异检测中的突变结果，将每个位点最高频率的碱基按照HIV-1参考基因组上的位置排列，获将比对到HIV-1测序区域的序列提取出来，根据序列之间重叠区域对序列片段进行拼接、延伸，最D.1斯坦福大学HIV耐药分析数据库（HD.2法国国家艾滋病研究署（ANRS）HIV耐药D.3中国艾滋病病毒基因序列数据平台耐药分析数据库（提供在线耐药分析工具，提交HIV基因序列，判断首选HIV感染者的全血制备干血斑阳性对照，也可用HIV阴性人全血稀释HIV对上述技术指标应至少检测3次，准确鉴定HIV-1基常规方法采集全血、血浆或收获病毒培养上清液，用HIV阴性的人全血或血浆稀释成特定的病毒载满足较长时间（一年）使用的量；血浆样本分装，干血斑样本置于含干燥剂的密封袋中，-70℃保进行RT-PCR时，应增加由去离子水代替模根据待检人群的抗病毒治疗史及使用的药物，选择含有在待检人群中预计流行率最高的耐药突变验室分区不严格、或人员操作经验不足等，可增加使用阴性对照的数量，如每50份待检样本使用2~3份[3]StanfordUniversityHIVDrugResistanedition.Geneva:WorldHealthOrganiz