免疫学检测与防治2014传阅 学习资料

一、免疫学检测技术（二）二、免疫学防治本次课教学内容P197第二十一章免疫学检测及其应用教学要求：1、掌握体外抗原抗体反应的特点及影响因素；凝集反应、沉淀反应与免疫标记技术的原理和方法2、熟悉淋巴细胞的分离、鉴定及T细胞功能测定。3、了解B细胞功能测定；免疫学检测方法的应用。第一节抗原抗体反应的特点及影响因素第二节检测抗原抗体的体外试验第三节免疫细胞功能的检测本章教学内容BLOODTYPETEST抗原抗体反应：是指抗原和抗体之间所发生的特异性结合反应。可发生于体内（invivo），也可发生于体外（invitro）。简介

在体内（invivo），抗原抗体反应是体液免疫的基础Ag与Ab在体内结合可发生中和作用、调理吞噬、溶菌效应等

在体外（invitro）,Ag与Ab在体外结合，可出现凝集、沉淀、补体参与的溶血等反应。临床上一般多采用血清作试验。所以体外的抗原抗体反应又称为血清学反应。体外抗原抗体反应的特点和影响因素1．高度特异性：结构基础：由抗原表位与Ab

的CDR互补结合所决定。

----如抗白喉毒素只能与白喉毒素结合，不能与破伤风毒素结合。是一切血清学反应的基础。

----临床上通过检测Ag或Ab可以诊断或辅助诊断疾病。

一、体外抗原抗体反应的特点

Ag+AbAg-Ab

非共价结合，保持动态平衡，在一定条件下是可逆的。Ag-Ab复合物的解离程度，除受环境条件（温度、PH、离子强度）影响之外，通常主要取决于Ag-Ab的亲和力。2.可逆性亲和力（affinity)：抗体分子上一个抗原结合部位与相应抗原表位之间的互补结合的强度

抗原和抗体之间发生可见反应需遵循一定的量比关系，只有当二者的浓度比例适当时，才出现可见反应。3．适宜的抗原抗体浓度和比例前带后带等价带

网格学说(latticetheory)cross-linking4.阶段性反应阶段特点①特异结合阶段发生特异结合，但不出现可见反应;反应快，仅需几秒至几分。②可见反应阶段可见的反应（凝集、沉淀、溶解细胞等），复合物受环境因素(pH、电解质、温度)的影响；反应慢，常需数分钟至数小时。在血清学反应中，两阶段往往不能严格分开。

适量电解质的存在，可使抗原抗体结合后呈现明显的沉淀或凝集等反应现象。无电解质存在，不出现可见反应现象。如果电解质浓度过高，会出现盐析现象。常用含生理盐水(8.5g/L,0.9%NaCl)的溶液作为抗原和抗体的稀释剂。1.电解质二、影响抗原抗体反应的因素

抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行，pH过高或过低，均可直接影响抗原抗体的反应性。血清学反应一般在pH6～8进行。补体结合反应及溶解反应最适为pH7.2～7.4。2.酸碱度（pH）一定范围内，温度升高可增加抗原与抗体分子碰撞的机会，加快二者结合速度。不宜过高过低，保持适当。

血清学反应一般以15～40℃为宜，最适为37℃。3.温度

总之,血清学反应影响因素较多，因此必须十分注意实验条件的选择和稳定，必须做好严格的实验对照

(例如，阳性对照positivecontrol、阴性对照negativecontrol、标准品对照standardcontrol等)，只有这样才能保证结果准确。4.其它：震摇混匀等三、免疫学检测技术的类型第2节检测抗原和抗体的体外试验在一定条件下（温度、PH、离子强度适宜），抗原与相应抗体在体外可发生特异性结合，出现可检测或观测的现象。第2节检测抗原和抗体的体外试验1、定性检测2、定量检测一、概述据Ag性质、出现的现象、参与反应成分不同分：二、检测抗原和抗体的体外试验类型（三）免疫标记技术（一）凝集反应（二）沉淀反应（一）凝集反应（Agglutinationreactions）

颗粒性抗原（细菌、细胞或表面包被抗原的颗粒）与相应抗体在适当条件下特异性结合，出现肉眼可见的凝集团块的现象。

适宜的温度、酸碱度、电解质等颗粒性抗原直接与相应抗体反应出现的凝集现象，如红细胞凝集或细菌凝集。包括玻片凝集和试管凝集两种检测方法。1、直接凝集反应玻片法：试管法：定性试验半定量试验，肥达氏反应ABO血型鉴定、细菌鉴定（一）凝集反应（Agglutinationreactions）将可溶性抗原或抗体先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与相应抗体或抗原进行反应出现的凝集现象。2、间接凝集反应正向间接凝集：反向间接凝集：抗体致敏颗粒，测抗原抗原致敏颗粒，测抗体RBC，乳胶颗粒，活性炭（一）凝集反应（Agglutinationreactions）（二）沉淀反应（Precipiationreactions）

可溶性抗原（毒素、组织浸液及血清中的蛋白等）与相应抗体在适当条件下特异性结合，出现肉眼可见的沉淀物。

原理和方法1、单向琼脂扩散应用：Ig和补体C3的定量测定AFP或其他可溶性抗原测定抗原扩散、沉淀环的直径与抗原含量成正相关Ab+琼脂制板打孔AgNSAgAg加样观察（含量）（二）沉淀反应（Precipitationreactions）（二）沉淀反应（Precipitationreactions）原理和方法2、双向琼脂扩散应用：①检测可溶性抗原或抗体②测定稀释免疫血清的效价（半定量）③对复杂的抗原或抗体成分进行纯度鉴定（三）免疫标记技术（immunolabelingtechniques）免疫标记技术是将抗原抗体反应与标记技术相结合，以检测抗原或抗体的一类试验方法。常用标记物：酶、荧光素、放射性核素、化学发光物质及胶体金等特点：敏感性高，定性、定量、定位1、酶免疫测定法酶免疫组化技术：酶联免疫吸附试验(ELISA)：测定可溶性抗原/抗体测定细胞表面或组织中的抗原Enzymelinkedimmunosorbentassay辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）将已知抗原或抗体吸附于固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤液将游离成分洗去；然后由酶标试剂作用于底物显色，通过酶标仪测定有色产物光密度值（OD）对抗原抗体作定性定量检测。方法：①双抗体夹心法：图ELISA原理：检测抗原②间接法：图检测抗体③生物素-亲和素系统—ELISA2、免疫荧光技术方法：应用：直接法和间接法标记物：异硫氰酸荧光素（FITC）图藻红蛋白（PE）传染病诊断、测定CD分子、自身免疫病诊断每检查一种抗原，须制备相应的荧光抗体一抗荧光素标记的二抗3、放射免疫测定法（RIA）应用：标记物：放射性核素131I和125I用于微量物质（激素、药物）测定，达pg/ml缺点：放射性核素污染设备条件要求高4、化学发光免疫技术5、免疫胶体金技术图

(Immunologicalcolloidalgoldsignature,ICS)主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。6、免疫印迹技术：可定性及定量分析蛋白质图

FLASH第3节免疫细胞及其功能检测（peripheralbloodmononuclearcells,PBMC）第3节免疫细胞及其功能检测（一）外周血单个核细胞的分离一、免疫细胞的分离及数量测定FLASHPBMC：包括淋巴细胞和单核细胞Ficoll分离液法人静脉血2ml/试管，抗凝每管加Hank’s液2ml，混匀是一种单次、差速、密度梯度离心的分离法。该法分离的单个核细胞纯度可达95%，其中淋巴细胞约占90%~95%原理及方法：

根据表面标志分离。将抗细胞表面标志的抗体结合于固相载体结果：使具有相应表面标志的淋巴细胞与细胞悬液中其他细胞分开。CD4抗CD41．免疫吸附分离法（二）淋巴细胞及其亚群的分离原理：根据表面标志分离。磁珠表面包被免疫物质后称免疫磁珠，可显示免疫活性和磁性2．免疫磁珠分离法原理：根据表面标志分离。T细胞—CD3、CD4、CD8

，B细胞—mIgD、mIgM3．免疫荧光法与流式细胞术原理淋巴细胞DNA合成增加蛋白合成增加淋巴母细胞刺激物细胞变大细胞浆增多胞质空泡核仁明显核染色质疏松二、免疫细胞的功能测定（一）淋巴细胞增殖或转化试验淋巴细胞转化的刺激物非特异性刺激物：

PHA----------T细胞

ConA----------T细胞

PWM----------T、B细胞

特异性刺激物：

异种抗原同种组织抗原

方法②3H-TdR掺入法③MTT法①形态计数法（四）细胞毒试验：（六）细胞因子检测：ELISPOTCTL、NK（二）迟发型超敏反应（DTH）检测：（三）抗体形成细胞测定：溶血空斑试验图（五）吞噬功能测定：2、简述体外Ag-Ab反应的特点及影响因素。3、常用的免疫标记技术有哪些？4、ELISA的双抗夹心法的原理及基本操作步骤5、简述T淋巴细胞增殖试验的基本原理。1、名词：

凝集反应，沉淀反应，ELISA思考题*双抗体夹心法：免疫教研室免疫检测与防治免疫教研室免疫检测与防治溶血空斑溶血空斑试验：空斑数

=抗体生成细胞数空斑大小

=产生的抗体多少一个斑点表示一个分泌相应细胞因子的细胞教学要求：1、掌握人工主动免疫/人工被动免疫的概念、主要制剂；免疫治疗的概念。2、熟悉疫苗的基本要求；计划免疫的含义；免疫治疗的基本手段。3、了解新型疫苗，疫苗的应用；免疫治疗的发展前景、生物应答调节剂的概念。P209第二十二章免疫学防治

第1节免疫预防一、概述：始于接种“人痘”预防天花，死亡率从20％～30％降至1％～2％。是根据特异性免疫原理来预防疾病的方法。EdwardJenner接种“牛痘”成功，人类消灭了天花。免疫教研室免疫检测与防治

自然免疫适应性免疫的获得方式：人工免疫自然主动免疫自然被动免疫人工主动免疫人工被动免疫是根据适应性免疫原理，将疫苗、抗体、细胞因子等生物制品应用于人体，使其获得适应性免疫，以预防某些疾病的方法。

二、人工主动免疫：概念：用（疫苗等）抗原物质接种机体，使之主动产生适应性免疫应答，从而预防或治疗疾病的措施。疫苗：疫苗的要求：国际上将细菌性制剂、病毒性制剂、类毒素等统称为疫苗。安全、有效、实用

（一）传统疫苗1、灭活疫苗（死疫苗）：两种疫苗特性比较

表选用免疫原性强的病原体，经人工大量培养后，用理化方法灭活制成。2、减毒活疫苗：将病原体在培养基或动物细胞中反复传代，使其失去或降低毒力，但保留免疫原性。即由减毒或无毒的活病原微生物制成。

3、类毒素：细菌的外毒素经0.3%～0.4%甲醛处理，失去毒性而保留了免疫原性，接种后能诱导机体产生抗毒素。1、亚单位疫苗：（二）新型疫苗2、结合疫苗：3、合成肽疫苗：4、基因工程疫苗：保留有效免疫原成分，HBsAgTI-Ag（如荚膜多糖）+载体→TD-AgDNA疫苗，重组载体疫苗，转基因植物疫苗

（三）疫苗的应用1、抗感染和计划免疫我国计划免疫程序表2、抗肿瘤3、计划生育4、防治免疫病理损伤EB病毒疫苗，人乳头瘤病毒疫苗抗HCG，抗ZP3是根据某些特定传染病的疫情监测和人群免疫状况分析，有计划地用疫苗进行免疫接种，预防相应传染病，最终控制乃至消灭相应传染病的重要措施。

三、人工被动免疫：概念：给人体注射含有特异性抗体或细胞因子的制剂，使之被动获得免疫应答，以治疗或紧急预防疾病的措施。人工主动免疫和人工被动免疫特点比较

第2节免疫治疗一、概述免疫增强疗法免疫抑制疗法特异性免疫治疗非特异性免疫治疗主动免疫治疗被动免疫治疗免疫治疗的基本策略是从分子、细胞和整体水平干预或调整机体的免疫功能。是指利用免疫学原理，针对疾病发生机制，人为地干预或调整机体的免疫功能，达到治疗疾病目的所采取的措施。

二、常用制剂：（一）抗原类：1、抗感染免疫血清微生物抗原疫苗、瘤苗（二）抗体类：导向治疗(放射性核素、化疗药物、毒素)

2、抗淋巴细胞丙种球蛋白(ALG）3、抗肿瘤抗体制剂4、抗细胞因子抗体移植排斥、某些自身免疫病的治疗抗TNF-α治疗类风关等慢性炎症pAbmAb5、抗细胞表面分子的单抗抗毒素血清、人Ig制剂抗CD20治疗B淋巴细胞瘤

（三）细胞因子：1、造血干细胞移植骨髓移植、脐血转输：淋巴因子激活的杀伤细胞2、过继免疫疗法LAK：肿瘤浸润性淋巴细胞TIL（四）免疫细胞类：：细胞因子诱导的杀伤细胞CIK3、细胞疫苗：肿瘤细胞疫苗，DC疫苗

（五）生物应答调节剂：1、卡介苗、短小棒杆菌、多糖成分

BRM，具有促进或调节免疫功能的制剂，通常对免疫功能正常者无影响，对免疫功能异常特别是免疫功能低下者有促进和调节作用2、胸腺肽、转移因子、免疫核糖核酸环磷酰胺；环孢菌素A、FK-