微生物检验理论课 11临床常见病毒检验1 学习资料

1临床常见病毒检验一南方医院医学检验系李海侠23000BC，埃及孟非思壁画中长老患小儿麻痹症。3病毒virus病毒是一类比较原始的、有生命特征的、能够自我复制和严格细胞内寄生的非细胞生物。引起SARS的冠状病毒基本结构及电镜图4病毒是一种病原体，它们几乎能感染所有的细胞型生物并产生病害。据初步统计，人类的60-70%的传染病系病毒感染所引起。从常见的感冒、麻疹、腮腺炎、脊髓灰质炎、狂犬病、肝炎、各种脑炎，到流行性出血热、老年性痴呆、爱滋病（AIDS）、SARS以及许多癌症。病毒与恶性肿瘤和多种慢性疾病的发生密切相关。病毒virus5病毒基本特征个体微小，可通过除菌滤器，大多数病毒必须用电镜才能看见；仅具有一种类型的核酸，或DNA或RNA；严格的活细胞（真核或原核细胞）内复制增殖；具有受体连结蛋白(receptorbindingprotein)，与敏感细胞表面的病毒受体连结，进而感染细胞。6病毒引起疾病的特点传播性病死率持续感染肿瘤的形成关系7病毒的基本性状病毒的大小与形态(SizeandShape)病毒体（virion）完整的成熟病毒颗粒，具有典型的形态结构，并有感染性。8测量单位为纳米（nm,1/1000μm）18nm-30nm小型病毒（HAV）80nm-160nm中型病毒（influenzavirus）200nm-300nm大型病毒（痘病毒最大300nm）9病毒的结构和组成壳粒衣壳核心（核样物）核衣壳包膜包膜病毒包膜子粒10Viralcore

（病毒的核心）Theviralnucleicacidgenome,Inthecenterofthevirion,

Function:

Controltheviralheredityandvariation,responsiblefortheinfectivityThegenomeofaviruscanbe

eitherDNAorRNA11ViralCapsid(病毒的衣壳）Theproteinshell,orcoat,thatenclosesthenucleicacidgenome.

Functions:

a.Protecttheviralnucleicacid.b.Participateintheviralinfection.c.Sharetheantigenicity12Nucleocapsid(核衣壳）Thecoreofavirusparticleconsistingofthegenomeplusthecapsid13

核衣壳的对称形式

SymmetryofNucleocapsid螺旋对称型（HelicalSymmetry）二十面体立体对称型（IcosahedralSymmetry

）复合对称型（ComplexSymmetry

）14RNACapsomere(壳粒)1516五邻体六邻体1718Envelope(包膜）Alipid-containingmembranethatsurroundssomeviralparticlesItisacquiredduringviralmaturationbyabuddingprocessthroughacellularmembraneNotallviruseshavetheenvelope,andvirusescanbedividedinto2kinds:

envelopedvirus

and

nakedvirus19Peplomere（包膜子粒）

orspike（刺突）包膜中含有双层脂质、多糖和蛋白质，其中蛋白质具有病毒特异性，常与多糖构成糖蛋白亚单位，嵌合在脂质层，表面呈棘状突起，称“剌突(Spike)或包膜子粒(Peplomere)”。20Functionsofenvelope

A.Antigenicity

somevirusespossessneuraminidase

B.Infectivity

C.Resistance

21核心：核酸→基因组genome→决定病毒遗传、变异和复制壳粒capsomere→衣壳capsid→保护、介导、抗原性包膜envelope，包膜子粒peplomere（刺突spike）→保护、介导、抗原性

22病毒的培养和增殖（CultureandReplicationofViruses）23一、病毒的培养：用活细胞动物（Animals）接种鸡胚（Embryonatedeggs）接种细胞培养（Organandtissueculture）

Organculture Cellculture:原代细胞传代细胞 二倍体细胞2425常用的细胞培养26细胞病变(Cytopathiceffect,CPE)大多数病毒属融细胞型感染，病毒在敏感细胞内增殖出现CPE，表现为细胞内颗粒增多、聚集团缩和融合，有的可形成包涵体，最后出现细胞溶解、脱落、死亡等。不同病毒的CPE特征不同。有包膜的病毒，不出现CPE或所致病变轻微不易察觉。包涵体（InclusionBodies）27正常细胞28CPE29细胞病变(Cytopathiceffect,CPE)包涵体（InclusionBodies）细胞感染病毒后,出现于细胞浆内或细胞核内的特殊结构称为包涵体。包涵体呈圆形或不规则小体,大小不一,数量不等。多数位于细胞浆内,嗜酸性(如狂犬病毒与痘苗病毒),少数位于核内,嗜碱性;有的同时有浆内和核内包涵体(如麻疹病毒)。包涵体可作为病毒性疾病诊断的依据之一。30狂犬病毒包涵体（Negribody）31巨细胞病毒包涵体32病毒数量和感染性测定

蚀斑实验病毒感染单层细胞后，产生的局限性病灶，称蚀斑，蚀斑是由一个感染性病毒体复制形成的，称蚀斑形成单位，病毒悬液中的感染性病毒量以每毫升的蚀斑形成单位PFU（plaqueformingunits）来表示。33ID50或TCID50

病毒感染鸡胚、动物或细胞后，引起50%发生死亡或病变的最小量。34病毒的增殖活细胞敏感细胞复制(replication)病毒复制周期病毒基因为模板，籍DNA多聚酶或RNA多聚酶等，使细胞转为复制病毒的基因组，转录、转译出相应的病毒蛋白，最终释放出子代病毒。35吸附和穿入adsorptionandpenetration脱壳uncoating生物合成biosynthesis组装成熟与释放assemblyandrelease363738标本的采集、运送和处理标本采集标本采集必须无菌操作及时送检血清学检查的标本39病毒感染的实验诊断诊断原则特异敏感快速简便40病毒感染的快速诊断病毒感染需要早期及时诊断，以便及时治疗和预防，而病毒的分离培养通常需要较长时间才能获得结果，尽快从患者身上采集的标本中通过测定病毒的特异标志成分，如特殊形态、特异的抗原成分及病毒的核酸，早期确认病毒的感染，是病毒学诊断的重大发展。41一、形态学检查光学显微镜电子显微镜检查

电镜直接检查：“秋季泻”患儿粪便中的轮状病毒，甲肝患者粪便中的甲肝病毒，疱疹病毒引起的疱疹水泡液，乙肝患者的血清

免疫电镜检查：在含病毒的标本中，加入特异抗体，经Ag－Ab反应，使标本中的病毒颗粒聚集成块，再经复染观察42二、病毒抗原检测病毒抗原是病毒特异性的标志，通过免疫学技术检测标本中特异性抗原存在，可以早期诊断病毒感染。用于病毒抗原检查的抗体，最好是单克隆抗体，具有良好的特异性。43免疫荧光技术（直接和间接荧光法）：适合用于病毒型别少，细胞培养难以成功的病毒，如流感病毒、副流感病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、腺病毒等酶免疫技术（酶免疫组化和ELISA法）：如检测乙肝病毒的表面抗原，HIV感染病人的P24抗体等其他技术：固相放射免疫技术、发光免疫分析技术、胶体金标记的免疫层析技术等44三、早期抗体检测IgM型特异抗体检测：检测病毒感染机体后产生的早期特异性抗体，如测定特异性IgM可以快速明确诊断各种病毒引起的新生儿先天性感染，测定甲肝病毒感染后的抗甲肝病毒IgM抗体可以明确诊断甲肝。免疫印迹试验：HIV感染的确认试验。45四、病毒核酸检测

病毒的核酸携带了病毒的全部遗传信息，检测病毒特异基因可以确认是否有病毒的存在。斑点杂交法固相杂交技术原位分子杂交技术Southern印迹和Northern印迹法PCR技术病毒核酸的直接检测46风疹病毒（rubellavirus）儿童是主要易感者呼吸道飞沫传播局部淋巴节增殖后经病毒血症散播全身可垂直传播导致胎儿先天性感染病后可获得终身免疫力47生物学特性呈不规则球形，直径50-70nm单正链RNA，有包膜包膜刺突有血凝性核衣壳为二十面立体对称只有一个血清型人是其唯一自然宿主48微生物学检验一、病毒分离培养采集咽拭子、外周血单核细胞、新生儿血浆或尿液，接种Vero细胞，观察CPE、电镜检查病毒颗粒或用抗体检测病毒抗原确证方法耗时长，不敏感，不作为常规方法49

总抗体效价

IgG检测

二、免疫学检测

IgM检测常采用血凝抑制试验、中和试验或补体结合法来测定总效价

胎儿绒毛膜中的病毒抗原

50微生物学检验三、分子生物学检测PCR、核酸杂交等检测羊水或绒毛尿囊膜中病毒的RNA。方法快速，灵敏度高，特异性强，适于RV的快速和早期诊断。51疱疹病毒疱疹病毒：病毒体呈球形，外被包膜，衣壳二十面体立体对称，直径120～300nm，病毒基因组为双链线性DNA。现已发现100余种，广泛分布于动物与人类中。人类疱疹病毒：与人类有关的疱疹病毒已发现有8种，分别为单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、水痘-带状疱疹病毒、EB病毒、人巨细胞病毒、人疱疹病毒型6型、人疱疹病毒型7型和人疱疹病毒型8型。52人类疱疹病毒共同特点：1.病毒体呈球形，外被包膜，衣壳二十面体立体对称，病毒基因组为双链线性DNA。2.除EBV、HHV-6、HHV-7、HHV-8型外，均能在人二倍体细胞增殖，并产生明显的细胞病变，形成多核巨细胞。3.可引起多种感染类型，包括显性感染、潜伏感染、整合感染和先天性感染。53单纯疱疹病毒

生物学性状

单纯疱疹病毒（HSV）是一种DNA病毒HSV属α疱疹病毒亚科，单纯疱疹病毒属，可分为HSV-1和HSV-2两个亚型HSV-1型主要引起生殖器以外的部位感染-2型主要引起生殖器部位皮肤粘膜的感染54传播途径：

HSV-1主要通过直接接触传播，HSV-2主要通过性传播。潜伏部位：HSV-1常潜伏在三叉神经节，HSV-2主要潜伏在骶神经节。55临床意义HSV-1感染：口咽部疱疹疱疹性角膜结膜炎皮肤感染（如疱疹性湿疹）散发性脑炎HSV-2感染：生殖器疱疹子宫颈癌56生物学特性HSV增殖周期短，产生组织培养细胞的裂解性感染，在敏感的神经节中建立潜伏感染。

HSV-1和HSV-2的基因组DNA有40%左右的序列同源，同源性是两型病毒血清学抗原交叉反应的分子基础。57微生物学检验直接检查

1.直接显微镜检测：收集细胞材料制备涂片，检查多核巨细胞，胞质气球样变等。2.直接抗原检测：应用单克隆抗体对感染组织进行免疫荧光染色或免疫组化染色。3.病毒核酸检测：采用DNA杂交或PCR法直接检测标本中的HSVDNA。58微生物学检验病毒分离和鉴定1.是HSV感染实验室诊断最为可靠的方法。2.常用原代人胚细胞和人二倍体细胞分离HSV。3.采用HSV特异性的单克隆抗体进行免疫组化染色，可对HSV分离株进行鉴定和分型。59血清学检测

常用的检测方法是ELISA。双份血清HSV抗体阳转，可诊断为原发感染。

微生物学检验60人巨细胞病毒

（Humancytomegalovirus，HCMV）分类：HCMV属于β疱疹病毒亚科，巨细胞病毒属成员。传播途径：接触传播、垂直传播、输血和器官移植传播。潜伏部位：中性粒细胞内。61临床意义多数为无症状的隐性感染者先天性感染围生期感染青少年时期感染免疫功能缺陷个体的感染62巨细胞病毒感染产后婴儿63生物学