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35DB35/T1992—2021番鸭细小病毒和鹅细小病毒双重实时荧光定量PCR鉴别诊断技术Diagnostictechniqueofduplexreal-timefluorescentPCRforthedetectionofmuscovyduckparvovirusandgooseparvovirus福建省市场监督管理局发布I 8 91NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运3.13.2融解（解链）温度meltingtemp核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为核酸的解链温度，并在PCR反应体系中加入过量双链嵌合荧光染料，荧光染料非特异性地掺入脱氧核糖核酸通过重新加热扩增产物（反应温度逐渐升高使结合了荧光染料分子的双链DNA解离或“融解”链DNA，荧光强度发生显著变化，形成一幅融解曲线图。由于上述两个特异性片段的Tm值不同，造成不同的PCR产物融解曲线特性不一样（出现峰值所对应的温度不同），通过分析扩增后融解曲线，可单、直接地判断实时荧光定量PCR反应产物的目的基因片2）：5.6Tris-盐酸饱和酚（pH7.6）。5.7酚-氯仿-异戊醇混合液（25：24：1在一灭菌棕色瓶中按25：24：15.13MDPV和GPV双重实时荧光定量PCR检测用上、下游引物序织匀浆，反复冻融3次，经2000r/min离心20min，取上清液分装，于-20℃冻存待检。离心管中，振荡器上充分振荡30s，然后将样品悬液转入新的1.5mL灭菌离心管中，于-20℃冻存待3按下列步骤完成DNA的提取，也可选择市售商品化DNA提取试剂盒或全自动核酸抽提仪及配套核酸）；d)加等量的酚-氯仿-异戊醇（25:2），水溶解沉淀，-20℃保存备用。在检测区使用荧光定量PCR试剂盒配制MDPV和GPV双重实时荧光定量PCR检测反应体系n管（n为第三阶段，融解60℃~95℃,在扩增反应结束后，添加融解步骤，生成融解曲线。试验结束后读取检测结果，Ct值的阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的8.2质控标准48.3结果描述及判定50.01mol/L（pH7.2）磷酸盐缓冲液磷酸二氢钠水溶液（NaH2PO4•H2O）27.磷酸氢二钠水溶液（Na2HPO4•12H2O）71.6MDPV和GPV双重实时荧光定量PCR鉴别检测方法所用引物见表B.1。5'-TAATGGTGGCAGGAATG7MDPV和GPV双重实时荧光定量PCR鉴别检测反应体系组分见表C.1。SYBRGreen荧光定量PCR酶混合物（aSYBRGreen荧光定量PCR试剂盒内提供，内含DNA聚合酶，脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucl），8

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