自然发情母牛冷冻胚胎移植技术规范

B43DB1302唐山市质量技术监督局发布DB1302/T249—2008本标准由唐山市质量技术监督局提出。本标准由遵化市畜牧水产局起草。本标准主要起草人：李爱民柳岩刘晓芳李晓光肖爱民闻联国孝敬芝李莉任广莲。DB1302/T249—2008自然发情母牛冷冻胚胎移植技术规范本标准规定了细管冷冻胚胎移植中受体牛的选择、排卵时间及移植时间确定、黄体质量判定、胚胎解冻技术、胚胎移植技术等。本标准适用于唐山地区奶牛一步法解冻细管冷冻胚胎对自然发情母牛移植。2受体牛选择2.1健康状况良好，无遗传性和传染性疾病。2.2体重在350kg以上，中等膘情。2.3青年牛连续正常发情三次以上。经产牛在三胎以内，产后连续正常发情两次以上。2.4无难产、助产、胎衣不下史。2.5移植前60d内不得注射任何疫苗，不能使用激素类和驱虫类药物。3受体牛的发情鉴定3.1外部观察鉴定3.1.1发情前期母牛不安、食欲减退、吼叫和爬跨其它母牛，外阴肿胀，流透明细长粘液，频尿、摆尾，但不接受其它牛爬跨，经产牛产奶量下降。3.1.2发情中期外阴肿胀，粘膜潮红，流透明粗长粘液，愿意接受其它牛爬跨，呆立。持续时间4h-6h。3.1.3发情后期流粗、短、混浊粘液，不接受其它牛爬跨，外阴肿胀开始消退，食欲及产奶量恢复正常。3.2直肠检查鉴定子宫颈松软，左侧或右侧卵巢有卵泡发育。3.3阴道检查鉴定用阴道开张器插入阴道，借助光源，观察阴道粘膜潮红，子宫颈松弛，子宫颈口有多量透明粘液流4排卵时间确定4.1外部观察发情结束后8h-12h排卵。4.2直肠检查原卵泡发育部位变为凹陷或卵巢整体变形。4.3排卵时间约为1h-2h。5移植时间及部位确定5.1由排卵时间向后推7d即为移植时间。5.2移植部位为排卵侧子宫角小弯处。6黄体质量判定6.1体积DB1302/T249—2008母牛排卵后7d的黄体直径可以达到1cm-1.5cm，总体积占整个卵巢的1/2-1/3。6.2形状正常黄体上端有一凹陷俗称“火山口”，与卵巢实质部分界限明显，部分突出于卵巢表面。6.3质感凹凸不平，呈“肉”样感觉，光滑有弹性。7移植前准备7.1器械准备7.1.1移植枪、细管剪、大镊子、器材盘全部用75%酒精消毒。7.1.2移植枪、细管剪酒精消毒自然挥发后再用火焰消毒。7.1.3移植枪火焰消毒后待温度降至室温时放入一次性软外套内备用。7.1.4准备四层10cm2-15cm2无菌纱布一块。7.2受体牛的准备7.2.1六柱栏保定7.2.2外阴部消毒a)肛门、尾根、外阴先用0.05%高锰酸钾水冲洗。b)肛门、尾根、外阴再用温开水冲洗。c)将外阴粘膜用75%酒精消毒。d)将外阴粘膜用75%酒精消毒后用0.9%生理盐水冲洗干净。7.3人员准备7.3.1需移植人员和助手各一人。7.3.2移植人员应穿好工作服，术前手臂消毒，剪短磨光指甲。8冷冻胚胎的解冻8.1解冻槽中放入35℃-38℃温水。8.2由助手将放有胚胎细管的漏斗提至距液氮罐口5cm-10cm处。8.3用镊子挟出所需的胚胎细管。8.4再由助手将放有胚胎细管的漏斗放回原位。8.5取出的胚胎细管在空气中晃动5s-8s后用准备好的无菌纱布擦去细管表面的结霜，并迅速放入水中晃动20s-30s。8.6取出解冻好的胚胎细管再用无菌纱布擦去其表面残存的水珠。8.7用左手捏住解冻好的胚胎细管棉塞端，使其另一端向上，右手拇指和食指配合轻轻弹动细管中上端，待细管内解冻液与保存液完全融合后即为解冻完毕。8.8核对胚胎细管外壁的标识内容。9胚胎细管装入移植枪9.1装入卡苏式移植枪9.1.1将枪芯插入胚胎细管棉塞端1mm-2mm后将枪芯连同细管一起向后退，退至细管前端与枪前端差1mm-2cm位置。9.1.2用细管剪剪开细管前端。9.1.3套上一次性硬外套，使细管前端与硬外套前端金属头紧密结合。9.1.4套上软外套。9.1.5枪头向上轻轻推动枪芯使细管内的液体流至枪头不能流出。9.2装入节段式移植枪3DB1302/T249—20089.2.1将移植枪前段装入软外套中。9.2.2用细管剪剪开细管压口端。9.2.3装入移植枪前段使细管开口端与枪头紧密结合。9.2.4枪芯插入细管棉塞端1mm-2mm。9.2.5推动移植枪后段（枪芯不动）与枪前段结合拧紧。9.2.6将整个移植枪装入软外套内。10移植操作10.1助手将牛尾拉向一侧，露出肛门和阴门。10.2肛门部涂擦润滑剂。10.3移植枪入阴道10.3.1用左手拇指和食指将受体牛阴门拨开。10.3.2右手将带有软外套的移植枪轻轻插入阴道深部。10.3.3再用左手轻拉软外套，使移植枪前段由软外套中拖出，至软外套全部拉出阴道为止。10.4移植枪入子宫左手入直肠并掏出宿粪，握住子宫颈，左右手配合使枪过子宫颈并迅速达到黄体侧子宫角小弯处。10.5移植10.5.1枪头达到移植部位后迅速推动移植枪芯，将细管内容物连同胚胎一起推入子宫角内。10.5.2将胚胎推出后轻轻转动移植枪1-2圈。10.5.3抽出移植枪。10.5.4将子宫角摆正到生理位置。10.5.5解除保定。如实填写表1受体牛发情登记记录表和表2受体牛移植情况记录表。表1受体牛发情登记记录表镇（乡）村年月日体重