DB53-T1064.1-2021-绿孔雀检疫技术第1部分：禽副黏病毒实验室检测技术规范-云南省

ICS11.220CCSB4153云南省地方标准DB53/T1064.1—2021绿孔雀检疫技术第1部分：禽副黏病毒实验室检测技术规范QuarantinetechniqueforPavomuticus—Part1:Technicalspecificationsforlaboratoryexaminationofavianparamyxoviruses云南省市场监督管理局发布DB53/T1064.1—2021目  次前言...................................................................................................................................................................III引言.......................................................................................................................................................................I12范围.................................................................................................................................................................1规范性引用文件.............................................................................................................................................13术语和定义.....................................................................................................................................................14缩略语.............................................................................................................................................................256总则.................................................................................................................................................................2仪器设备和试剂.............................................................................................................................................26.1实验室设备.............................................................................................................................................2试剂.........................................................................................................................................................36.27样品.................................................................................................................................................................37.1采样要求与原则.....................................................................................................................................37.2采集工具.................................................................................................................................................37.3样品类型与采样方法.............................................................................................................................3采样登记表的填写.................................................................................................................................4样品的保存和运输.................................................................................................................................489试验步骤.........................................................................................................................................................48.1鸡胚接种（病毒分离）.........................................................................................................................4病毒血凝（HA）试验和血凝抑制（HI）试验....................................................................................4禽副黏病毒L和M基因的RT-PCR扩增..............................................................................................58.4新城疫病毒F基因的RT-PCR扩增及测序分析..................................................................................6试验数据处理.................................................................................................................................................79.1HA试验结果判定....................................................................................................................................79.2HI试验结果判定....................................................................................................................................79.3L和M基因扩增结果判定......................................................................................................................79.4F基因扩增结果及毒力判定..................................................................................................................7附录A（规范性）试剂配制........................................................................................................................8附录B（规范性）采样记录表..................................................................................................................10附录C（规范性）RT-PCR引物.................................................................................................................11IDB53/T1064.1—2021前  言本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件DB53/T1064《绿孔雀检疫技术》的第1部分。DB53/T1064已经发布了以下部分：——第1部分：禽副黏病毒实验室检测技术规范；——第2部分：禽流感病毒实验室检测技术规范；——第3部分：羽虱实验室检测技术规范；——第4部分：消化道线虫实验室检测技术规范。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由云南省林业与草原局、云南省市场监督管理局共同提出。本文件由云南省林业标准化技术委员会（YNTC02）归口。本文件主要起草单位：云南农业大学、云南省标准化研究院。本文件主要起草人：陈培富、黄艳梅、胡世享、杨敏、卓娜、李宁、钱丽敏、邹丰才、何依蓉、杨建发。IIIDB53/T1064.1—2021引  言绿孔雀（Pavomuticus）在我国仅分布于云南，是国家Ⅰ级重点保护野生动物，也是全球濒危物种，并已列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)和《世界自然保护联盟濒危物种红色名录》。为切实贯彻《中华人民共和国野生动物保护法》和《中华人民共和国动物防疫法》，编制并发布DB53/T1064《绿孔雀检疫技术》地方标准，可让从事绿孔雀保护的相关人员按标准化和规范化程序开展绿孔雀病原学诊断，从而采取必要的防治措施，以提高染疫绿孔雀的成活率，维护绿孔雀种群健康和地区生态平衡，提升生物多样性保护成效。本文件已发布4个部分：——第1部分：禽副黏病毒实验室检测技术规范。本部分从禽副黏病毒实验室检测技术的总则、仪器设备和试剂、样品、试验步骤、试验数据处理等方面制定了规范；——第2部分：禽流感病毒实验室检测技术规范。本部分从禽流感病毒实验室检测技术的总则、禽流感病毒毒株的毒力划分和血清亚型、仪器设备和试剂、样品、试验步骤、试验数据处理等方面制定了规范；——第3部分：羽虱实验室检测技术规范。本部分从羽虱实验室检测的原理、试验条件、仪器设备和试剂、样品、试验步骤、试验数据处理等方面制定了规范；——第4部分：消化道线虫实验室检测技术规范。本部分从消化道线虫实验室检测技术的试验原理、常见线虫形态特征、试验条件、仪器设备和试剂、样品、试验步骤、试验数据处理等方面制定了规范。ⅤDB53/T1064.1—2021绿孔雀检疫技术第1部分：禽副黏病毒实验室检测技术规范重要提示：本检测技术规范中，氯仿有中等毒性，操作时应在通风条件下进行并戴手套和口罩，不小心接触皮肤应立即冲洗；凝胶电泳若使用溴化乙啶（EB）作核酸染色剂，操作时应戴手套和口罩，被EB污染的物品要进行无害化处理；操作焦碳酸二乙酯（DEPC）应戴手套和口罩并在通风条件下，不小心接触皮肤应立即冲洗。由于新城疫病毒可引起人一过性结膜炎，采样及检测人员应佩戴口罩和防护眼镜，并采取必要的消毒措施。本文件中凡接触病毒样品的检验器材、废弃物及其包装物均应做消毒或灭菌无害化处理，以免污染环境或扩散病毒。1范围本文件规定了绿孔雀（Pavomuticus）检疫技术中禽副黏病毒实验室检测技术涉及的总则、仪器设备和试剂、样品、试验步骤和试验数据处理。本文件适用于绿孔雀检疫技术中禽副黏病毒实验室检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，标注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不标注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。禽副黏病毒avianparamyxoviruses一类感染家禽和野禽的单链负股RNA病毒，属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒亚科（Paramyxovirinae）、禽腮腺炎病毒属（Avulavirus），包括至少禽副黏病毒1~9血清型，其中禽副黏病毒1型又称作新城疫病毒（Newcastlediseasevirus），其致病性最受关注。F蛋白酶切位点cleavagesiteofFprotein新城疫病毒融合蛋白（F）的F2亚基（位于F氨基端）与F1亚基（位于F羧基端）之间被宿主细胞蛋白内切酶识别的一个短肽，由113～117位氨基酸残基组成，其中113～116位可能含多个碱性氨基酸，如病毒血凝试验viralhemagglutinationtest1DB53/T1064.1—2021利用有血凝活性的病毒与特定动物的红细胞结合而使红细胞凝集（即红细胞不再自然下沉汇集）的特性，测定病毒效价即滴度的方法。3.4病毒血凝抑制试验viralhemagglutinationinhibitiontest使用抗体阻断或抑制病毒的血凝活性，用于测定血清抗体效价或病毒种类的一种方法。4缩略语下列缩略语适用于本文件。AMV：禽成髓细胞瘤病毒AvianmyeloblastosisviruscDNA：互补DNAcomplementaryDNADEPC：焦碳酸二乙酯DiethypyrocarbonatedNTP：脱氧核苷酸DeoxyribonucleotidetriphosphateEB：溴化乙啶EthidiumbromideF：融合蛋白FusionproteinHA：血凝HemagglutinationHAU：血凝单位HemagglutinationunitHI：血凝抑制HemagglutinationinhibitionL：大聚合酶蛋白LargepolymeraseproteinM：基质蛋白MatrixproteinNDV：新城疫病毒NewcastlediseasevirusPBS：磷酸缓冲盐溶液Phosphate-bufferedsalinePCR：聚合酶链式反应PolymerasechainreactionRBCs：红细胞RedbloodcellsRT-PCR：反转录-聚合酶链式反应Reverse-transcriptionpolymerasechainreactionSPF：无特定病原体Specificpathogenfree5.1采用鸡胚接种方法从绿孔雀检测样品分离禽副黏病毒。5.2取5.1得到的鸡胚尿囊液做病毒血凝（HA）试验和血凝抑制（HI）试验，确定分离毒株的种属和血清型（亚型）。5.3用RT-PCR扩增分离毒株的RNA聚合酶（L）基因和基质蛋白（M）基因，对禽副黏病毒及其第1血清型（新城疫病毒）分别做出鉴定。5.4对5.2或5.3确定的新城疫病毒分离株，采取RT-PCR扩增其融合蛋白（F）基因，再做测序分析，对新城疫病毒分离株做出毒力判定。2DB53/T1064.1—20216.1.2凝胶成像系统：对EB染色的DNA检测灵敏度低至0.1ng；有效像数1360×1024、10bit，数据线接口USB2.0。6.1.3冷冻高速离心机：最高离心力20000g；容量1.5mL×12。6.1.4电泳仪：电压50V～120V，电流10mA～800mA，定时0min～999min。6.1.5电泳槽：耐高温、耐腐蚀、不漏液；缓冲液新鲜且容量充足。6.1.6冰箱：具有冷藏和冷冻功能分区（−20℃～4℃）。6.1.7微量移液器：单道可调，量程0.5μL～10μL、2μL～20μL、10μL～100μL和100μL～1000μL。6.1.8水浴锅：温度范围20℃～100℃。6.1.9过滤器：一次性无菌用品，内含孔径0.45μm的滤膜。6.1.10V形孔血凝反应板：一次性或可重复使用的血凝反应板。6.2试剂6.2.1阿氏液（Alsever'sSolution），pH7.2、0.01mol/L磷酸缓冲盐溶液（PBS）、1%健康未免疫鸡红细胞悬液、标准新城疫病毒抗原、阳性对照血清和阴性对照血清。6.2.2RNA提取试剂盒、氯仿、异丙醇、75%乙醇、1.0%琼脂糖凝胶、50×TAE缓冲液、10μg/μL溴化乙啶（EB）或其他可替代的核酸染料、DNA分子量标准、2×TaqMasterMix、无RNA酶灭菌超纯水（DEPC处理水）、10×扩增反应缓冲液、dNTPs、RNase抑制剂（40U/μL)、AMV反转录酶（5U/μL）、胶回收试剂盒。6.2.3试剂配制见附录A。7样品7.1.1采样应符合NY/T541的要求。7.1.2采集的样品具有代表性，应从濒死、死禽和处于急性发病期的绿孔雀采集样品，对暴发疫病的群体宜采集多只发病或死亡个体的样品，采样过程应无菌操作，容器应密封，注意避免被污染。取病死孔雀待检样品，采集肺脏（或气管）、脑、心、肝、脾、胃、肾等组织各1份，每份不少于3g，置于洁净样品袋或平皿内。将样品封口贴上标签，做好标记。7.3.2.1取待检样品，采集喉气管拭子和泄殖腔拭子（或新鲜粪样）各1份，将拭子样品端剪下或折断，分别置于无菌试管或器皿中，加1.0mL～1.5mL含抗生素的PBS。将样品封口，贴上标签，做好标记。a)对气管拭子，PBS应含青霉素（1000U/mL）、链霉素（1mg/mL）或卡那霉素（50μg/mL）和制菌霉素（1000U/mL）；3DB53/T1064.1—2021b)对泄殖腔拭子和粪便PBS，上述抗生素浓度应提高至5倍。7.3.3血清样品采集静脉血液2mL～3mL于无菌离心管中，自然放置析出血清，3000r/min离心10min，将血清转移、分装于新的无菌试管中，盖紧盖子，封好口，贴上标签。不同个体的血清样品不能混合。7.3.4整只采样将病死孔雀装入封闭的无毒塑料袋内，至少用两层塑料袋包装，封口并贴上标签，作好标记。7.4采样登记表的填写填写采样记录表（见附录B），样品编号应与标签一致，随样品送至符合NY/T1948要求的实验室。7.5样品的保存和运输7.5.1样品应置于加干冰或冰袋的保温瓶或隔热泡沫盒中运输，也可用液氮罐运输，保温容器应密封，防止渗漏。保温容器外贴封条，封条有贴封人（单位）签字或盖章，并注明贴封日期。7.5.2所有样品在4℃以下运输，拭子样品和组织样品应作暂时的冷藏（4℃）或冷冻（–20℃）处理，随即送至实验室。7.5.3血清样品宜单独存放。若24h内可运达实验室，在保温箱内加冰袋冷藏运输；若超过24h，应先冷冻，其后在保温箱内加大量冰袋运输，途中不能超过48h。7.5.4各种样品到达实验室后，若暂时不进行处理，则应冷冻（–20℃以下）保存，不应反复冻融。8试验步骤将棉拭子在PBS中充分混匀至拭子上没有肉眼可见的样品；粪便、研碎的组织加样品稀释液充分研磨，按照1g组织加10mLPBS的比例混成悬液。样品液经3000r/min离心10min，取上清液用滤器过滤，再取滤过液作为接种材料。取按8.1.1处理完毕的样品，以0.2mL/胚的量经尿囊腔途径接种孵化9d～11d的SPF鸡胚，每个样品接种3～5枚鸡胚，在37℃孵化箱内孵育，每天上午和下午定点观察鸡胚死亡情况。无菌收集24h~96h死亡鸡胚及96h仍存活鸡胚的尿囊液，用于病毒血凝试验以测定有无HA活性。8.2病毒血凝（HA）试验和血凝抑制（HI）试验8.2.1病毒血凝（HA）试验8.2.1.1在96孔V型微量反应板，每孔预先加25μLPBS。8.2.1.2向第1孔加入25μL尿囊液，反复吹吸3次～5次混匀。8.2.1.3从第1孔吸取25μL溶液加入第2孔，混匀后吸取25μL加入第3孔，如此进行2倍连续稀释至第11孔，从第11孔吸取25μL溶液弃去，但第12孔加入25μLPBS或正常尿囊液作为阴性对照孔。4DB53/T1064.1—20218.2.1.4每孔加入25μLPBS。8.2.1.5每孔加入25μL1%鸡红细胞悬液。8.2.1.6轻轻振荡血凝反应板以混匀反应体系，室温（20℃～25℃）静置40min，或4℃静置60min，当阴性对照孔的红细胞在孔底汇集成原点时判定结果。8.2.2病毒血凝抑制（HI）试验8.2.2.1在96孔血凝反应板，每孔预先加入25μLPBS。8.2.2.2向第一孔加入25μL血清样品，混匀。8.2.2.3在血凝反应板上将血清作横向的2倍连续稀释，但第12孔、第13孔、第14孔和第15孔分别设置为加25μLPBS的红细胞对照孔、加未做任何免疫禽血清的阴性对照孔、加禽流感病毒抗体的对照孔和加禽腺病毒抗体的对照孔（对已确定禽副黏病毒血清型的分离毒株，还可设置阳性对照孔）。8.2.2.4每孔加入25μL4HAU的病毒抗原，室温（20℃～25℃）静置不少于30min，或4℃静置不少于60min。8.2.2.5每孔加入25μL1%RBCs，轻轻振荡混匀，室温（20℃～25℃）静置约40min，或4℃放置约60min，当红细胞对照孔呈显著钮扣状时判定结果。8.3禽副黏病毒L和M基因的RT-PCR扩增8.3.1病毒RNA的提取可用商品化RNA提取试剂盒提取待检样品（棉拭子、组织或鸡胚尿囊液）、阳性对照样品及阴性对照样品的病毒RNA。也可用RNA提取试剂（如Trizol）提取，方法如下：a)将经过预处理的250μL待检样品加入750μLRNA提取试剂（如Trizol）中，振荡2min，室温放置5min；b)加入250μL氯仿，在微量振荡器上振荡1min，室温放置5min后，4℃、12000r/min（约14000×g）离心15min；c)吸取上层水相转入一新的离心管中，加入等量的异丙醇，混匀，室温放置15min，4℃、12000r/min（约14000×g）离心15min；d)小心吸弃上清，加入DEPC处理的75%乙醇750μL，4℃、12000r/min（约14000×g）离心5min；e)小心吸弃上清，将沉淀自然风干或于50℃干燥箱中晾干，加适量的DEPC处理水溶解；f)取5μL提取物与1μL6×核酸上样缓冲液混匀，做1%琼脂糖凝胶电泳检查RNA提取效果，对组织样品观测到28S、18S及5.8SrRNA三个条带或至少前两个条带，提示RNA提取合格；g)提取的RNA应在2h内进行RT或RT-PCR扩增，若需长期保存RNA，应置于−80℃冰箱或液氮内。8.3.2.1反转录反应（cDNA的合成）：取提取的RNA11μL，加入2μL、10μmo1//L的反转录引物（见附录C），4μL5×反转录缓冲液、0.5μL反转录酶、0.5μLRNA酶抑制剂、2μLdNTPMixture至20μL，42℃孵育1h，即得到cDNA溶液，直接用于PCR扩增或−20℃冻存备用。PCR扩增体系：在反应管中依次加入8μL无核酸酶水、10μL2×TaqMasterMix、1μL上述cDNA溶液、0.5μL上游引物和0.5μL下游引物（见附录C，引物浓度均为10μmol/L），混匀，瞬时5DB53/T1064.1—20218.3.2.3PCR扩增条件：94℃预变性3min，94℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸25s，循环30次，72℃延伸5min。扩增反应结束后立即取扩增产物进行电泳检查或置于4℃冰箱备用。8.3.3扩增产物的电泳检测制备1.5%琼脂糖凝胶板。在电泳槽内加入1×TAE电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取3μL～5μL扩增产物加到凝胶孔，加入5μLDNA分子量标准。恒压（8V～10V/cm凝胶长度）电泳30min～40min，随后取出凝胶，置于凝胶成像系统下观察扩增结果。8.4新城疫病毒F基因的RT-PCR扩增及测序分析8.4.1病毒RNA的提取按照8.3.1步骤进行。8.4.2引物针对新城疫病毒F基因设计的引物见附录C。8.4.3RT-PCR扩增（一步法）8.4.3.1RT-PCR扩增体系配制见表1。体系配好后，盖紧PCR反应管盖，并做好标记。8.4.3.2使用瞬时离心使液体都沉降到PCR管底。同时设立阳性对照和阴性对照。PCR扩增程序：42℃反转录30min；95℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s；72℃延伸45s共进行35次循环；72℃再延伸7min。PCR产物置于4℃保存或−20℃冻存备检。F基因上游引物（10μmol/L）F基因下游引物（10μmol/L）模板RNA将PCR产物用胶回收试剂盒回收、纯化，做核酸测序，所获序列用DNAstar（5.0）分析并在NCBI网站上做BLAST在线比对。根据核苷酸序列推导分离毒株F的氨基酸序列，确定内切蛋白酶识别位点的碱性氨基酸数量。6DB53/T1064.1—20219试验数据处理9.1HA试验结果判定9.1.1将血凝反应板倾斜呈约60°，观察RBCs有无呈泪珠样流淌，出现泪珠样流淌的反应孔判定为病毒血凝阴性。9.1.2完全凝集（无泪珠样流淌）的病毒最大稀释倍数为该病毒样品（尿囊液）的血凝滴度，其相应的病毒含量表示为1个血凝单位（HAU)，再根据开始的稀释倍数精确计算血凝滴度。9.1.3血凝判定标准：红细胞均匀分散在孔内、倾斜血凝板时不流淌判为完全凝集，记作++++；75%凝集记作+++；50%凝集记作++；25%凝集记作+；红细胞汇集于孔底中央呈圆点、倾斜血凝板时与对照孔（仅含25μLRBCs和50μLPBS）RBCs流淌相同的孔判定为不凝集，记作−。9.2HI试验结果判定9.2.1红细胞均匀分散在孔底周围、倾斜血凝板时不流淌判为完全凝集，记作++++；75%凝集记作+++；50%凝集记作++；25%凝集记作+；红细胞集中在孔底中央呈圆点、倾斜血凝板时与对照孔（仅含25μLRBCs和50μLPBS）RBCs流淌相同的孔判定为不凝集或血凝被抑制，记作−。9.2.2完全抑制4HAU病毒抗原的最高血清稀释倍数为该血清的HI滴度。9.2.3检查各种对照：阴性对照血清HI滴度不高于4（记作2或2log2），阳性对照血清HI滴度应2在已知滴度的一个稀释度以内，红细胞对照应无自凝现象，结果有效，试验成立。9.2.4如果高于1:16（2或4log2）稀释度的血清能抑制4HAU的病毒抗原，HI滴度被判为HI抗体4阳性，表明动物发生新城疫病毒感染或接种过新城疫疫苗。9.2.5如果血清HI滴度为16，判为可疑，需重复HI试验，若HI滴度仍为16，可判定血清抗体阳性，若HI滴度为8则判定为血清抗体阴性。9.2.6在所有的确诊试验中针对试验采用的HAU应设病毒HA滴度的追溯性测定。9.2.7当血凝活性不被禽流感病毒抗体和禽腺病毒抗体阻断，便可初步判定为禽副黏病毒阳性。9.3L和M基因扩增结果判定使用L基因引物做PCR扩增呈阳性结果时，禽副黏病毒各血清型的扩增产物均约121bp。进而使用M基因引物扩增NDV阳性对照、阴性对照和待测分离毒株，其扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，阴、阳性对照同时成立表明试验有效，否则试验无效。在阴、阳性对照结果成立的前提下，如果待检样品的RT-PCR产物凝胶电泳后在约300bp位置出现特异性的单一条带，则初步判定为禽副黏病毒1型即NDV核酸阳性。F基因扩增结果及毒力判定9.4.1试验成立条件：凝胶