广西《猪主要病毒性腹泻鉴别检测 多重反转录聚合酶链反应法》编制说明

PAGEPAGE14广西地标《猪主要病毒性腹泻鉴别检测多重反转录聚合酶链反应法》(征求意见稿）编制说明一、项目背景、来源及目的1、项目背景近年来，随着我国规模化养猪业的迅猛发展，除饲养管理、细菌性和寄生虫因素外，病毒性因素是导致猪腹泻至关重要的原因。其中猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（PRoV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）等所致的疫病已成为病毒性腹泻中最为常见且危害最大的病毒性肠道疾病，以厌食、呕吐、腹泻、脱水、急性死亡为主要特征，发病率和死亡率可高达100%。猪传染性胃肠炎（TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的一种急性、高度接触性肠道传染病，是危害养猪业较严重的一种传染病。不同年龄和品种的猪只均可感染，但以2周龄以下仔猪为主，呕吐、严重腹泻、脱水，1周龄内仔猪病死率甚至高达100%，是引起仔猪发病和死亡的主要传染病。TGE引起成年猪掉膘、降低饲料报酬。猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种高度接触性肠道传染病，PEDV与TGEV同属冠状病毒科，两种病毒感染后所引起的临床症状极其相似，给养猪业带来严重危害。猪轮状病毒（PRoV）能感染各种年龄的猪，以2-5周龄的仔猪多发，发病率高（50%-80%），死亡率低（7%-20%）。患病仔猪排黄白色或灰暗色水样或糊状稀粪，症状与PED相似，但较轻且缓和。猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）是一种新型猪肠道冠状病毒，可引起5-15日龄哺乳仔猪腹泻和呕吐，迅速脱水，衰竭而亡，发病率和死亡率高50%-100%，生长猪、成年猪及生产母猪发病轻微。近年来，病毒性腹泻不断蔓延，呈现持续上升趋势，给养猪业造成了巨大的经济损失，严重威胁广西养猪业的健康发展。由于这4种病毒性疫病在临床上常表现为混合感染、继发感染，加上流行特点、临床症状、病理变化难以区分，因而给疫病的鉴别、诊断带来了很大困难，需要借助实验室的检测。当前，迫切需要建立能同时检测并区分PEDV、TGEV、PRoV、PDCoV快速鉴别检测方法的地方标准，从病原学上对这4种疫病加以鉴别、确诊，以便采取有针对性的防控措施，确保防控效果。2、项目来源 根据《广西壮族自治区市场监督管理局关于下达2018年第二批广西地方标准制定项目的通知》（桂市监函[2018]253号），自治区市场监督管理局将广西地方标准《猪主要病毒性腹泻鉴别检测多重反转录聚合酶链反应法》的制定下达给广西动物疫病预防控制中心，项目编号2018-0272，由施开创研究员主持。3、项目目的迄今，未见关于同时检测并鉴别PEDV、TGEV、PRoV、PDCoV的多重RT-PCR的国家标准、行业标准或地方标准。因此，亟需制定鉴别检测PEDV、TGEV、PRoV、PDCoV多重RT-PCR的地方标准，填补检测技术空白，可作为全区各级动物疫病预防控制中心及相关兽医实验室的检测依据，同时这也是我区兽医实验室标准化建设、规范化运行、法制化管理的迫切要求，对猪主要病毒性腹泻的临床监测、检测、诊断、有效防控具有重要意义。二、工作概况施开创研究员从2015年1月起主持开展广西水产畜牧科技项目《猪流行性腹泻病毒Nsp1蛋白调控天然免疫信号通路的机制与推广应用》（桂渔牧科201528017），从2017年9月起主持开展广西科技重大专项《畜禽重大病害生态综合防控技术创新示范》（桂科AA17204057）子课题。课题组在PEDV、TGEV、PRoV、PDCoV的快速鉴别检测方法上开展了大量实验室研究、临床验证工作，取得较好效果。鉴于国内没有鉴别检测PEDV、TGEV、PRoV、PDCoV多重RT-PCR的国家、农业行业及地方标准，课题组开展了相关资料的收集整理工作，确定标准编写目标和依据，同时起草制订广西地方标准项目建议书，积极开展标准的申报。2018年12月接到自治区市场监督管理局下达的地方标准制定（修订）项目计划的通知后，迅速成立标准编制课题组，确定标准起草编写方案及时间进度表，并积极组织实施。至2019年12月已完成标准网上征求意见稿的编写。本标准编制课题组人员包括：施开创、冯淑萍、陈芳芳、粟艳琼、尹彦文、屈素洁、陆文俊、莫胜兰、李军，各成员均具备多年专业知识，并且有丰富的实验室检测工作和地方标准编写经验，能保证完成本标准的制定任务。具体分工如下：施开创：组长，负责标准的提出、起草、审定。冯淑萍：负责标准的起草、审核。陈芳芳：负责标准的实验室及临床验证。粟艳琼：负责标准方法的建立、验证。尹彦文：负责标准的起草、校正、外联。屈素洁：负责标准的实验室及临床验证。陆文俊：负责标准的实验室及临床验证。莫胜兰：负责标准的实验室及临床验证。李军：负责组织标准的校正、审定。三、标准编制原则1、政策性原则：本标准制定的每一项内容均遵循国家相关法律、法规和规章制度。2、先进性原则：以国内外相关技术文献资料和研究报告为参考，并在大量前期研究和实验工作的基础上编写而成，力求反映最新的科技成果；以国内同类标准的编写方法为基础，对本标准进行规范、充实和创新，使之具有先进性。3、经济性原则：本标准编制过程，从获取信息、起草、实验室试验和临床验证到形成征求意见稿的每一个环节，在确保质量的前提下均厉行节约，利用有限的经费圆满完成各阶段编写任务。4、适用性原则：本标准借鉴国内外PEDV、TGEV、PRoV、PDCoV等RT-PCR法检测技术的成功经验，并经实验室和临床验证，内容全面，形式规范，可操作性和实用性强，相关技术人员均能看懂并可按标准规定进行实际操作。5、协调统一性原则：本标准参照国内相关标准的编写形式和表达方法，力求与国内相关标准协调统一。本标准通过持续查新，确保内容不与已有的国家标准、农业行业标准和地方标准重复或矛盾。6、规范化原则：本标准是严格按照GB/T1.1-2009的要求来编写的。四、标准主要内容及依据本标准是动物疫病防控推荐性地方标准，编写重点是疫病的检测。标准的主要依据是借鉴国内先进标准和技术内容，参考国内外有关文献资料，结合我国国情，并通过实验室试验和临床验证后提出。标准编写主要内容包括材料准备、操作方法、结果判定等，适合于猪主要病毒性腹泻病毒的鉴别检测。标准的建立过程主要进行了以下试验：1、试剂和材料（1）主要试剂E.

coli

DH5α感受态细胞、MiniPlasmidKit质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0胶回收试剂盒、pMD18-T载体、EcoRⅠ内切酶、HindШ内切酶、MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0核酸抽提试剂盒、PrimeScriptTMⅡ1ststrandcDNASynthesisKit反转录试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。（2）主要设备生物安全柜、普通梯度PCR仪、高速台式冷冻离心机、电热恒温水槽、混匀器、组织匀浆机或研钵、凝胶成像系统、微量移液器、水平电泳仪等。（3）引物序列表1引物序列及扩增长度引物名称引物序列（5′→3′）目的基因扩增片段长度/bpPEDV-N-F5′GCATTTCTACTACCTCGGAA-3′PEDV-N750PEDV-N-R5′GCGATCTGAGCATAGCCTGA-3′TGEV-M-F5′GCGTCTGATTGTGAGTCATG-3′TGEV-M544TGEV-M-R5′AATAGTCCTGCTGGGTAATG-3′PRoV-VP6-F5′CTTCGACATGGAGGTTCTGTACTC-3′PRoV-VP6329PRoV-VP6-R5′CATTTCGTTGCGATTCTCTAG-3′PDCoV-M-F5′GTCCCAGAGGAAATCTTAAGTATG-3′PDCoV-M183（4）样品来源2017-2018年从广西各地采集的270份发生腹泻的病猪的淋巴结、肠道组织、粪便拭子等样品。2、方法（1）待检样品的处理无菌采取腹泻病猪淋巴结、肠道组织、粪便拭子等样品共约1g，置于2.0mL离心管中，加入灭菌的1mol/LPBS（pH7.2）1mL，用组织匀浆机充分研磨后，反复冻融3次；细胞培养物则直接反复冻融3次。以10000×g离心5min，收集上清，用于总RNA抽提，或置-20℃保存备用。（2）待检样品总RNA提取取待检样品上清200µL置于无RNA酶的1.5mL离心管中，加入200µLBufferVGB，20µL的ProteinaseK，1.0µL的CarrierRNA，充分混匀，置56℃水浴锅温浴10min；向上述裂解液中加入200µL无水乙醇，充分吸打混匀。将Spincolumn安置于ColletionTube上，溶液移至Spincolumn中（套在2.0mL收集管上），12000rpm离心2min，弃滤液；将500µL的BufferRWA加入到Spincolumn中；12000rpm离心1min，弃滤液；将800µL的BufferRWB加入到Spincolumn中；12000rpm离心1min，弃滤液；12000rpm离心Spincolumn2min；将Spincolumn安置于新的1.5mL的离心管上，在Spincolumn膜的中央处加入50µL的RNasefreedH2O，室温静置5min；12000rpm离心2min，洗脱病毒RNA。（3）反转录在冰浴条件下，在PCR反应管中按下表用量分别加入各成分：试剂名称用量终浓度10×RTBuffer1dNTPMixture（10mMeach）1µL1mmol/µLRnaseInhibitor（40U/µL）0.25µL1U/µLAMVReverseTranstriptase(5U/µL)0.5µL0.25U/µLMgcl2（25mM）2µL5mmol/µLRandom9mers(50pmol/µL)0.5μL2.5pmol/µL待检总RNA模板4µL加灭菌双蒸水至总体积为10µL加完试剂后瞬时离心混匀，将

PCR

反应管置于

PCR

仪内，按以下循环条件进行反转录

：①30

℃，10min；②

42℃，30min；③95

℃，5min。（4）重组质粒标准品的制备取PEDVCV777株、TGEVH株、PDCoVGX1701株、PRoVNX株病毒液，根据MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.4.0试剂盒使用说明书提取总RNA，应用PrimeScriptTMⅡ1stStrandcDNASynthesisKit反转录试剂盒进行反转录获得cDNA。以此为模板，应用设计的4对引物进行PCR扩增。回收、纯化PCR产物，连接至pMD18-T载体、转化DH5α感受态细胞，涂板，筛选阳性克隆并增菌培养，提取质粒，进行PCR、酶切及测序鉴定。（5）多重RT-PCR反应条件的优化以构建的4种重组质粒标准品为模板，用设计的4对特异性引物在同一反应体系中进行PCR扩增。建立总体积为25μL的四重PCR反应体系：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，4对特异性上、下游引物各0.5μL，4种重组质粒标准品等比例混合物2.5μL，灭菌双蒸水补足至25μL。对PCR的退火温度（分别为54.0℃、55.2℃、56.3℃、57.5℃、58.6℃、59.6℃）、上下游引物的浓度（终浓度分别为0.125、0.25、0.375、0.50、0.625、0.75pmol/μL）、循环数（分别为25、30、35、40、45个循环）等反应条件进行优化。（6）多重RT-PCR的特异性、敏感性、重复性试验首先，以重组质粒标准品pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-N和pPRoV-VP6，以及PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、FMDV、PRRSV和CSFV的cDNA，PRV、PCV2和PPV的DNA作为模板，双蒸水作为阴性对照，对所建立的多重RT-PCR进行特异性试验。其次，将上述4种重组质粒标准品等比例混合后，10倍系列稀释成浓度为1.57×109~1.57×100拷贝/μL，对所建立的多重RT-PCR进行敏感性试验。再次，随机选取同一个浓度的4种重组质粒标准品等比例混合成1.57×107拷贝/μL，对所建立的多重RT-PCR进行重复性试验。（7）多重RT-PCR方法的临床应用在广西各地发生腹泻的猪场中，采集病猪的粪便拭子、死亡仔猪的肠道组织，共270份。应用所建立的多重RT-PCR方法检测PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV。3、结果（1）重组质粒标准品的构建提取PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV病毒液总RNA，反转录成cDNA后作为模板，应用特异性引物进行PCR扩增，获得PEDVN基因750bp、TGEVM基因544bp、PDCoVN基因183bp、PRoVVP6基因329bp等目的片段。回收、纯化PCR产物，连接至pMD18-T载体、转化E.coliDH5α感受态细胞，阳性克隆增菌培养后提取质粒。经PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定正确后，分别命名为pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-N、pPRoV-VP6。鉴定结果见图1。图1重组质粒pPEDV-N(A)、pTGEV-M(B)、pPDCoV-N(C)、pPRoV-VP6(D)鉴定M：DNA分子质量标准；1：HindⅢ+EcoRⅠ酶切产物；2：PCR产物（2）退火温度的优化建立25μL多重PCR反应体系：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，4对特异性上、下游引物（25pmol/μL）均为0.5μL，4种重组质粒标准品等比例混合物2.5μL，双蒸水补足至25μL。反应程序：94℃预变性2min；94℃变性10s，退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。其中，退火温度分别设置为54.0、55.2、56.3、57.5、58.6和59.6℃。结果如图2所示，各个退火温度均可获得较为清晰的扩增条带，最后选取58.6℃作为最适退火温度。图2多重RT-PCR退火温度的优化M：DNA分子质量标准；1：54.0℃；2：55.2℃；3：56.3℃；4：57.5℃；5：58.6℃；6：59.6℃；7：阴性对照（3）引物浓度的优化在25μL多重PCR反应体系中，固定退火温度为58.6℃，将4对特异性上、下游引物终浓度以0.125、0.25、0.375、0.50、0.625和0.75pmol/μL为6组不同的引物浓度，进行排列组合，其它条件固定不变，进行多重PCR，以选出最佳引物浓度。经过优化，PEDV-N和PDCoV-N引物对的最佳终浓度为0.50pmol/μL，TGEV-M和PRoV-VP6引物对的最佳终浓度为0.625pmol/μL。部分结果见图3。图3多重RT-PCR引物浓度的优化M：DNA分子质量标准；1~6：PEDV、TGEV、PRoV引物终浓度分别固定为0.50、0.625、0.625pmol/μL，PDCoV引物终浓度分别为0.125、0.25、0.375、0.50、0.625、0.75pmol/μL；7：阴性对照（4）循环数的优化建立25μL多重PCR反应体系，固定最佳退火温度和最佳引物浓度，保持其它条件不变，将循环数分别设置为25、30、35、40和45个循环，进行多重PCR。结果见图4，当循环数为35个时，扩增条带最清晰明亮，确定为最佳循环数。图4多重RT-PCR循环数的优化M：DNA分子质量标准；1~5：循环数分别为25、30、35、40、45个；6：阴性对照（5）多重RT-PCR反应条件的确定经过优化反应条件，确定多重RT-PCR的反转录体系和PCR扩增体系。20μL反转录体系：5×PrimeScriptⅡBuffer4μL，dNTPMixture（10mmol/μL）1μL，随机引物6聚体（50μmol/μL）1μL、总RNA模板8μL，RNA酶抑制剂（40U/μL）0.5μL，PrimeScriptⅡ反转录酶（200U/μL）1μL，灭菌双蒸水4.5μL。反转录程序：30℃10min，48℃60min，95℃5min。25μLPCR反应体系：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，PEDV-N和PDCoV-N上、下游引物（25pmol/μL）0.5μL（终浓度均为0.50pmol/μL），TGEV-M和PRoV-VP6上、下游引物（25pmol/μL）0.625μL（终浓度均为0.625pmol/μL），cDNA2.5μL，灭菌双蒸水5.5μL。PCR扩增程序：94℃预变性2min；94℃变性30s，58.6℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃再延伸10min。（6）多重RT-PCR特异性试验分别以重组质粒pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-N和pPRoV-VP6，以及PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、FMDV、PRRSV和CSFV的cDNA，PRV、PCV2和PPV的DNA作为模板，灭菌双蒸水作为阴性对照，进行多重RT-PCR反应。结果，只有PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV扩增出与相应目的片段大小符合的条带，而FMDV、PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、PPV均未出现扩增条带（见图5），表明多重RT-PCR没有交叉反应。图5多重RT-PCR特异性试验M：DNA分子质量标准；1：四种重组质粒混合物；2：PEDV；3：TGEV；4：PDCoV；5：PRoV；6：FMDV；7：PRRSV；8：CSFV；9：PRV；10：PCV2；11：PPV；12：阴性对照（7）多重RT-PCR敏感性试验分别将pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-N和pPRoV-VP6重组质粒10倍系列稀释成终浓度为1.57×109拷贝/μL~1.57×100拷贝/μL，进行单重PCR。结果，pPEDV-N、pPDCoV-N、pPRoV-VP6的检出下限均为1.57×101拷贝/μL，p-TGEV-M的检出下限为1.57×103拷贝/μL（见图6）。图6单重RT-PCR敏感性试验M：DNA分子质量标准；1~10：重组质粒浓度分别为1.57×109~1.57×100拷贝/μL；11：阴性对照将pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-N和pPRoV-VP6重组质粒等比例混合后，10倍系列稀释，使4种重组质粒的终浓度均为1.57×109拷贝/μL~1.57×100拷贝/μL，进行多重PCR。结果，pPEDV-N、pPDCoV-N、pPRoV-VP6的检出下限均为1.57×102拷贝/μL，pTGEV-M的检出下限为1.57×103拷贝/μL（见图7）。图7多重RT-PCR敏感性试验M：DNA分子质量标准；1~10：重组质粒浓度分别为1.57×109~1.57×100拷贝/μL；11：阴性对照（8）多重RT-PCR重复性试验选取终浓度均为1.57×107拷贝/μL的4种重组质粒混合物作为模板，固定其它条件不变，进行多重RT-PCR。结果，5次重复试验均能扩增出均匀一致的目的条带，具有良好的重复性。图8多重RT-PCR重复性试验M：DNA分子质量标准；1~5：相同条件下的5次重复试验；6：阴性对照（9）多重RT-PCR方法的临床应用应用所建立的多重RT-PCR方法，对2017-2018年从广西各地采集的270份腹泻病料进行检测。结果，PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV阳性分别为42份（15.56%）、31份（11.48%）、29份（10.74%）、5份（1.85%），其中