DB36T-土壤和沉淀物 四环素类的测定 超高效液相色谱-三重四极杆质谱法

DB36/TXXXXX—2023DB36/TXXXXX—2023土壤和沉积物四环素类抗生素的测定超高效液相色谱-三重四级杆质谱法范围本标准规定了测定土壤和沉积物中金霉素、土霉素和四环素等四环素类抗生素的超高效液相色谱-三重四级杆质谱法。本标准适用土壤和沉积物中金霉素、土霉素和四环素的测定。本方法金霉素的检出限为0.2μg/kg，测定下限为0.8μg/kg；土霉素的检出限为0.2μg/kg，测定下限为0.8μg/kg；四环素的检出限为0.2μg/kg，测定下限为：0.8μg/kg。规范性引用文件本标准内容引用了下列文件或其中的条款。凡是不注明日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法HJ/T166土壤环境监测技术规范HJ168环境监测分析方法标准制订技术导则EPAMethod1694方法原理使用乙腈与EDTA-Mcllvaine缓冲液，经水平振荡提取土壤样品中四环素类抗生素，提取液经冷冻离心后通过固相萃取柱净化，经浓缩后待测样使用超高效液相色谱三重四级杆质谱法，电离方式为ESI(+)，采用多反应监测(MRM)模式进行测定。试剂和材料除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的优级纯试剂。实验用水为新制备的去离子水或同等纯度的水。4.1盐酸：优级纯或优级纯以上。4.2盐酸溶液：ρ（HCl）=0.5mol/L。4.3乙腈：农残级。4.4甲醇：农残级。4.50.1%甲酸水溶液：移取1.0mL甲酸加入1000mL水中，混匀。4.60.1%甲酸乙腈溶液：移取1.0mL甲酸加入1000mL乙腈中，混匀。4.7金霉素、土霉素、四环素：优级纯。4.8金霉素、土霉素、四环素标准贮备液（100mg/L）称取0.0100g金霉素、土霉素、四环素（4.7），用甲醇（4.4）溶解并定容至100mL；于4℃冷藏、避光保存，或市售标准溶液。4.9金霉素、土霉素、四环素标准使用液（100μg/L）移取100μL金霉素、土霉素、四环素标准贮备液（4.8），用甲醇（4.4）定容至100mL。4.10样品提取液（Mclvaine缓冲溶液：乙腈=7:3）称取磷酸氢二钠27.6g，柠檬酸12.9g，乙二胺四乙酸二钠盐37.2g，用水溶解后稀释并定容至1000mL。移取Mclvaine缓冲溶液350mL，用乙腈稀释定容500mL。4.11固相萃取柱：填料为二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物或等效萃取柱，规格为6mL/500mg。4.12氮气：纯度≥99.999%。4.13去离子实验纯水仪器和设备5.1液相色谱-三重四极杆质谱仪：配有电喷雾离子化源（ESI）。5.2分析天平：精度为0.0001g。5.3浓缩装置：旋转蒸发仪浓缩仪或其他类型的等性能相当的设备。5.4固相萃取装置：自动或手动，流速可调节。5.5色谱柱：C18反相高效液相色谱柱（规格2.1mm×100mm，1.7mm）或其他性能相近的色谱柱。5.6往复振荡器。5.7高速冷冻离心机。5.8微量注射器：5μL、10μL、20μL、50μL、100μL。5.9一般实验室常用仪器设备。样品样品的采集和保存样品采集按照HJ/T166的相关规定执行，采集具有代表性的样品，立即置于棕色磨口玻璃瓶中，用锡箔纸封口于4℃冰箱冷藏。样品的制备6.2.1土壤中抗生素提取：称取2.0g冷冻干燥土壤样品于50mL离心管中，加入按EDTA-Mcllvaine缓冲溶液∶乙腈＝7:3比例配制的混合液（pH≈4.0）提取液10mL，然后置于往复振荡器中振荡45min，4500r/min条件下冷冻离心10min后收集上清液，重复提取2次，然后加水（4.13）稀释至200mL，待净化。6.2.2净化：依次用3mL甲醇、3mL0.5mol/LHCl溶液、3mL水活化HLB固相萃取小柱，以5mL/min速度将萃取液通过萃取柱，然后依次用5mL5%甲醇溶液、5mL水通过萃取柱，达到清洗萃取柱的目的。利用减压真空泵抽干萃取柱，保持30min，最后用5mL甲醇洗脱，洗脱液在旋转蒸发浓缩至小于1mL后，氮气吹干，用1mL甲醇混合液定容，超声溶解5min，过0.22μm滤膜后，供UPLC-MS/MS测定。分析步骤7.1仪器参考条件7.1.1超高液相色谱仪参考条件流动相：A：0.1%甲酸溶液（4.7）B：0.1%甲酸乙腈（4.4）。流速：0.2mL/min。柱温：30℃。进样体积：2.0μL。表1梯度洗脱程序时间（min）流动相A(%)流动相B(%)090101901054060659585958.0190101090107.1.2质谱仪参考条件离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子模式。毛细管电压：4000V，干燥气体温度：350℃，雾化器压力：35psi。干燥气体流速：10L/min。多离子反应监测方式（MRM），具体条件参见附录，对于不同质谱仪器，参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。7.1.3仪器调谐按照仪器使用说明书在规定时间和频次内对液相色谱/串联质谱仪进行仪器质量数和分辨率校正，其中仪器质量数偏移在±0.5Da之内，质谱峰半峰宽在0.6Da~0.9Da之间，以确保仪器处于最佳测试状态。注：Da，道尔顿Dalton的缩写，指以人名命名的原子质量单位。7.2标准曲线的建立准确移取一定体积的金霉素、土霉素、四环素标准使用液（4.9），用甲醇（4.4）稀释，低溶度1.0μg/L-10μg/L浓度间以及高浓度10.0μg/L-2000μg/L，配置6不同浓度的溶液，低溶度为1.0μg/L、2.0μg/L、4.0μg/L、6.0μg/L、8.0μg/L、10μg/L，高浓度10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L的标准系列，分别取1.0mL制备好的标准系列，混匀后贮存在棕色样品瓶中，待测。由低浓度到高浓度依次对标准系列溶液进样，以标准系列溶液中目标组分的响应值为横坐标，以其对应的峰面积（或峰高）为纵坐标，建立标准曲线。7.3样品测定取按（6.2）制备好的待测试样，按照与绘制校准曲线相同的仪器分析条件进行测定。当待测试样浓度超出标准曲线线性范围时，使用提取液适当稀释后再测定。7.4空白试验使用石英砂，按照(6.2)进行样品制备，与试样相同的测定条件（7.1）进行空白试样的测定。结果计算与表示8.1定性分析按照附表B1确定的母离子与子离子进行监测，试样中目标组分的保留时间与标准样品中该组分的保留时间的相对偏差的绝对值应小于2.5%；且对待测样品中各组分定性离子的相对丰度（Ksam，见式1）与浓度接近的标准溶液中对应的定性子离子相对丰度（Kstd，见式2）进行比较，所得偏差标准在表2规定的最大允许偏差范围内，则可判定为样品中存在对应的待测物。四环素的MRM图见图1。（1）式中：Ksam——样品中某组分定性子离子的相对丰度，%；A2——样品中某组分二级质谱定性子离子的峰面积（或峰高）；A1——样品中某组分二级质谱定量子离子的峰面积（或峰高）。（2）式中：Kstd——标准样品中某组分定性子离子的相对丰度，%；Astd2——标准样品中某组分二级质谱定性子离子的峰面积（或峰高）；Astd1——标准样品中某组分二级质谱定量子离子的峰面积（或峰高）。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差Kstd/%最大允许偏差/%Kstd>502020<Kstd≤502510<Kstd≤2030Kstd≤10508.2定量分析根据目标化合物的峰面积，对应的内标物峰面积和内标浓度，按照公式（3）计算样品中四环素的质量浓度。(3)式中：ρ中-样品中目标组分i的质量浓度，μ质量浓；Ai-样品中目标组分i的峰面积（或峰高）；Ais-样品中内标物的峰面积（或峰高）；ρ品中内样品中内标物的质量浓度，μ品中内；a-标准曲线的斜率；b-标准曲线的截距；Vi-定容后体积，mL；V-水样体积，mL。8.3结果表示当测定结果大于等于1μg/kg时，数据保留三位有效数字；当结果小于1μg/kg时，保留至小数点后三位。精密度和准确度9.1精密度用5μg/kg；50μg/kg；200μg/kg低、中、高三个浓度对金霉素、土霉素、四环素三个样品进行精密度测试，结果相对标准偏差为金霉素：5.1%，3.5%，3.0%，土霉素：5.5%，3.6%，2.9%，四环素：6.6%，3.2%，3.3%。9.2正确度五家实验室分别对含有浓度分别为5μg/L、50μg/L、200μgL的统一样品进行了加标分析测定。加标回收率范围分别为：金霉素：86.6%-118.2%，82.0%-112.0%，80.5%-102.6%；土霉素：92.8%-100.2%，87.9%-113.0%，93.8%-101.6%；四环素95.4%-116.0%，86.9%-111.0%，79.6%-117.6%。质量保证和质量控制10.1空白分析每次分析至少做一个实验室空白，实验室空白中检出目标化合物的浓度不得超过方法的检出限。10.2校准10.2.1每批样品应绘制标准曲线，相关系数应≥0.990，否则重新绘制标准曲线。10.2.2每20个样品或每批次样品（少于20个样品）应测定一个标准曲线中间浓度点标准溶液，其测定结果与该点浓度的相对偏差应≤20%，否则，需重新绘制标准曲线。10.3平行样的测定每20个样品或每批次（少于20个样品）需做1个平行双样，平行双样测定结果的相对偏差应≤20%。10.4样品加标回收率测定每20个样品或每批次（少于20个样品）需做1个基体加标样，加标样与原样品在完全相同的测试条件下进行分析。固相萃取法加标回收率应在70%~120%之间。废物的处理实验过程中产生的废液和废物应分类收集和保管，委托有资质的单位进行处理。（资料性附录）方法的精密度和准确度方法的精密度和准确度表A.1方法精密度汇总表元素实验室内相对标准偏差（%）实验室间相对标准偏差（%）石英砂实际土壤石英砂实际样品5(μg/kg)50(μg/kg)200(μg/kg)20(μg/kg)40(μg/kg)200(μg/kg)5(μg/kg)50(μg/kg)200(μg/kg)20(μg/kg)40(μg/kg)200(μg/kg)金霉素CTC2.8-9.61.6-6.11.9-4.41.7-281.6-7.62.2-5.111129.0242822土霉素OTC1.8-10.02.3-8.21.7-4.04.4-262.4-122.6-5.43.09.03.07.0127.0四环素TC1.8-111.4-5.91.8-4.44.0-272.0-102.1-5.88.09.014121910元素重复性限r（μg/kg）再现性限R(μg/kg)石英砂实际样品石英砂实际样55020020402005502002040200金霉素CTC0.75.416.80.75.416.81.717.017.311.637.718.7土霉素OTC0.96.616.40.96.616.40.914.019.63.017.619.0四环素TC1.15.419.81.15.419.81.513.520.25.317.320.7表A.2方法正确度汇总表石英砂元素5(μg/kg)50(μg/kg)200(μg/kg)加标回收率P（%）加标回收率的标准偏差（%）加标回收率最终值（%）加标回收率P（%）加标回率的标准差（%）加标回收率最终值（%）加标回收率P（%）加标回率的标准偏差（%）加标回收率最终值（%）金霉素100.211100.2±1195.11295.4±1294.6994.6±9土霉素97.8397.8±399.8999.8±997.3397.3±3四环素102.78102.7±897.1997.1±996.81496.8±14实际土壤元素20(μg/kg)40(μg/kg)200(μg/kg)加标回收率P（%）加标回收率的标准偏差（%）加标回收率最终值（%）加标回收率P（%）加标回率的标准差（%）加标回收率最终值（%）加标回收率P（%）加标回率的标准偏差（%）加标回收率最终值（%）金霉素89.82289.8±2295.02795±2790.62190.6±21土霉素99.0799±7102.512102.5±1294.6594.6±5四环素91.21091.2±1096.31096.3±1094.21094.2±10(资料性附录）质谱参考条件质谱参考条件表B.1目标化合物、替代物及内标物的多离子反应监测条件种类名称母离子（m/z）定量、定性离子（m/z）碰撞电压/V毛细管出口电压/V目标化合物金霉素479443.9*，153.918，30124土霉素461.1425.9*，200.914，42118四环素445.1410*，153.914,26122注：带*的为定量离子对参考文献左艳丽．毛细管电泳法应用于头孢菌素类、氟喹诺酮类和磺胺类抗生素药物的检测［D］．石家庄:河北大学，2012．SPELTINIA，STURINIM，MARASCHIF，etal．Microwave-assistedex-tractionanddeterminationofenrofloxacinanddanofloxacinphoto-trans-formationproductsinsoil［J］．Analyticalandbioanalyticalchemistry，2012，404(5)．1565－1569．刘潇雅，徐源洲，贺南南，等．土壤磺胺类抗生素固相萃取－高效液相色谱法的构建与优化［J］．土壤，2019，51(6):1129－1136．SALVIAMV，FIEUM，VULLIETE．Determinationoftetracyclineandflu-oroquinoloneantibioticsattracelevelsinsludgeandsoil［J］．Appliedandenvironmentalsoilscience，2015，2015(11):1－10．UKASZEWICZP，BIAK-BIELINSKAA，DOZ·ONEKJ，etal．Anewapproachfortheextractionoftetracyclinesfromsoilmatrices:Applicationofthemicrowave-extractiontechnique［J］．Analytical＆bioanalyticalchemistry，2018，410:1697－1707．孟明辉，贺泽英，徐亚平，等．QuEChERS方法结合高效液相色谱－串联质谱法同时测定土壤中20种抗生素［J］．农业环境科学学报，2017，36(8):1672－1679．PANLX，FENGXX，CAOM，etal．DeterminationanddistributionofpesticidesandantibioticsinagriculturalsoilsfromnorthernChina［J