生物制药 微生物制药-新药产生菌的分离学习资料

微生物制药一、微生物药物的几个相关基本概念二、微生物药物的分类三、微生物药物的应用四、药源微生物及微生物药物的筛选技术五、微生物药物的发酵生产技术六、微生物药物的分离、精制和鉴别七、废弃物的综合利用和环境保护四、药源微生物及微生物药物的筛选技术（2）（一）药物的产生菌（二）新药产生菌的分离（三）新微生物药物的筛选（四）微生物药物产生菌的菌种改良（五）微生物药物产生菌的保藏（二）新药产生菌的分离1、土壤微生物的分离土壤是微生物的重要栖息地。（1）采集样品（2）分离微生物（3）选留菌种及保存分离放线菌的样品除土壤以外，还有河（湖、海）泥和水、枯树叶、堆肥、动物粪便等。土壤样品通常采表层土（5cm以下），样品以未开垦过的土壤为佳，要尽可能选择不同地理和生态环境的土壤。

1、土壤微生物的分离（1）采集样品（2）分离微生物（3）选留菌种及保存样品的处理分离培养基抑制剂的使用分离方法培养条件稀有放线菌的选择性分离其他微生物的分离利用放线菌孢子和细菌营养细胞及不同属间放线菌孢子间的耐性差异，用物理或化学的方法除去细菌及目的外放线菌，或者用花粉作为诱饵，增加某些特定放线菌的分出率。分离前样品加热处理处理条件样品分离的放线菌40℃，2~16h土壤、植物根链霉菌55℃，6min水、土壤、粪便小单孢菌、链霉菌、红球菌、嗜酸放线菌和嗜碱放线菌等55℃干热，10d土壤高温放线菌100℃干热，15min土壤马杜拉放线菌100~120℃干热，1h土壤马杜拉放线菌、小双孢菌，小四孢菌，孢囊链霉菌样品的处理A）温度B）化学试剂的处理SDS-酵母膏处理法，SDS对放线菌孢子基本无害，酵母浸膏以及温和的热休克可以促进放线菌孢子的出芽，使细菌数明显减少。风干的土壤与CaCO3混合后在26℃培养7～9d，然后分离放线菌。风干的土壤减少了细菌的数量，CaCO3有利于放线菌生长而不利于绝大多数真菌的生长。用0.01mol/LNaOH处理土壤5～10min（15℃）可减少细菌的数量，有利于分离小单孢菌。用1.4%酚处理土样10min或用1.4%酚130℃处理30min，分别有利于获得链霉菌或小单孢菌。用乙酸乙酯或氯仿和苯处理样品，过滤风干后用来分离微生物，可以除去样品中的真菌。B）化学试剂的处理C）物理方法的处理离心，1600g离心20min，上清液主要有放线菌孢子，沉淀含有细菌和真菌孢子。超声波处理，分离小单孢菌和链霉菌。特殊器具捕集空气中的游离孢子，分离糖多孢菌。搅动，使干草上孢子脱落，用于从干草中分离高温放线菌。膜过滤，将水经膜（孔径0.45滤膜）过滤，浓缩水中微生物，再将膜直接贴在琼脂平板上培养。诱饵法，在培养基中添加特殊物质，如花粉、蛇皮、头发等，可分离小瓶菌和发仙菌。分离培养基合成培养基——精氨酸培养基，高氏合成一号培养基，天门冬素培养基，察氏培养基等有机培养基——Waksman培养基，Bennett培养基几丁质培养基——只有放线菌能够利用几丁质，生长的菌落小，白色，需转接到产可溶性色素的适当培养基上加以区分HV培养基——以土壤腐殖质为唯一碳源和氮源的培养基总的要求：尽量使样品中的全部放线菌都生长出来，而其他微生物（细菌和真菌）尽可能不长。选择性分离放线菌所使用的培养基待分离的放线菌所用固体培养基中的主要成分马杜拉放线菌属葡萄糖，甘油，L-天冬酰胺，微量盐，维生素（AV培养基）小双孢菌属AV培养基小单孢菌属微量盐，丙酸钠，硫胺素（M3培养基）小四孢菌属下层：葡萄糖，L-天冬酰胺，微量盐上层：（水解）酪蛋白氨基酸诺卡菌属微量盐，丙酸钠，硫胺素（M3培养基）嗜高温放线菌属半浓度营养琼脂链孢囊菌属葡萄糖，L-天冬胺酰，微量盐（NH2），维生素，土壤浸出液各种菌属胶体几丁质，微量盐抑制剂的使用加入抗真菌试剂（制霉菌素、两性霉素B、放线菌酮、丙酸钠以及使真菌形成较小菌落的rosebengal等），抑制真菌生长；加入抗细菌抗生素（青霉素、链霉素）抑制细菌生长，增加放线菌的分出率；加入某些抗生素也可抑制部分放线菌，有利于分离到一定种类的放线菌。如新生霉素有利于分离北里孢菌属。分离方法稀释法干土喷射法孢子飞扬法滤膜法——最常用，将土壤样品用无菌水（或生理盐水、磷酸缓冲液）制成悬液，倍比稀释，涂布平板，恒温培养。——用喷土机或其他方法将风干碾细的土样直接喷在分离平板上。——将0.22~0.45μm的滤膜放在分离平板上，接种菌悬液或喷撒干土，适温培养一段时间，放线菌菌丝可穿过滤膜小孔生长到培养基上，细菌只能在滤膜表面生长，去掉滤膜，深入培养基的放线菌经继续培养后长出菌落。——将样品置于特制瓶中，其瓶口刚好能倒置一个分离平板，剧烈振荡使孢子飞扬，撞到分离平板上进行分离培养。培养条件一般培养温度为25~30℃，也有32~37℃，培养7~14d，生长慢的放线菌可延长培养1个月；分离高温放线菌用45~50℃培养1~2d；海水放线菌用20℃培养6周左右。稀有放线菌的选择性分离稀有放线菌的特征：生长速度比较缓慢；营养需求较为复杂；比较缺乏孢子分化的能力；不能稳定保存。分离几种稀有放线菌的方法待分离的稀有放线菌种类形态特征预处理方法分离方法分离方法的特征马杜拉放线菌100℃加热15min，并悬浮于无菌的25％（V/V）Ringer’s溶液中悬浮液涂布于含有100μg/mL放线菌酮、25μg/mL利福平的固体培养基上高温处理土样与使用含有利福平的固体培养基相结合的选择性分离方法游动放线菌不形成真正的气生菌丝，并且菌落呈鲜艳的橘黄色。营养菌丝上形成孢子囊。游动孢子由成熟的孢子囊产生。土样浸泡于饱和的硫酸镁盐溶液中，再洗去镁盐，干燥土样。将经过干湿处理后的土样涂布于几丁质琼脂上，可得到大量的游动放线菌利用了生物趋化方法小单孢菌大多数种缺乏气生菌丝，形成橘黄色或橘红色的菌落孢子；分化的菌落表面变成黑色或暗褐色，有时呈光滑或粘稠。单孢子只在营养菌丝上形成，没有运动性。碱处理有效的降低了革兰氏阴性细菌的生长含有衣霉素的固体培养基可选择性的支持小单孢菌的生长将土样进行碱处理和使用含有衣霉素的固体培养基相结合的独特方法分离几种稀有放线菌的方法待分离的稀有放线菌种类形态特征预处理方法分离方法分离方法的特征诺卡菌大多数种形成腊样的或有光泽的菌落而不形成气生菌丝，但也有一些种会产生不成熟的气生菌丝，营养菌丝可断裂成球状或杆状片断用石蜡棒在土壤样品的悬液中富集然后将石蜡从棒上剥离，接种到DST（Oxoid）琼脂平板上，25℃培养3w链孢囊菌营养和气生菌丝与链霉菌菌株一样发育良好，包含着不能移动孢子的孢囊位于气生菌丝的顶端可先将土样在室温风干，然后在120℃加热1h将处理后的土样或用土壤悬液涂布于含有维生素的培养基上北里孢菌属形态特征以及菌落特征与链霉菌属非常相似，但它们的细胞壁中含有LL-DAP、meso-DAP、甘氨酸、半乳糖，与链霉菌属完全不同50μg/mL新生霉素的培养基利用了北里孢菌属菌种对新生霉素具有抗性的特征其他微生物的分离真菌的分离常用PDA培养基、Martin培养基、察氏蔗糖（葡萄糖）琼脂培养基，pH偏酸性。为了抑制细菌的生长一般在分离培养基中加入β-内酰胺类和氨基糖苷类等抗生素。细菌的分离常用有机培养基，如牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、营养琼脂加氨基酸维生素的培养基等，pH偏碱性。分离时一般加入一定量的抗真菌抗生素如制霉菌素、两性霉素、放线菌酮等，抑制真菌生长，有利于细菌分离。加入多粘菌素可大大减少G－细菌生长，使G＋细菌得以富集。1、土壤微生物的分离（1）采集样品（2）分离微生物（3）选留菌种及保存将菌株的优良特性保存下来，保持微生物的活力。低温保藏法传代培养保藏法液体石蜡保藏法沙土保藏法冷冻干燥保藏法2、海洋微生物的分离Okami等从海洋中分离放线菌的程序①目的从海水和海底沉淀物中分离放线菌②分离的样品用采样器采集海水和海底沉淀物③前处理离心和过滤海水达到浓缩，沉淀物直接涂平板④培养基各种培养基，包括含人造海水的一些培养基（淀粉－水解酪蛋白－海水）⑤培养20℃，6w⑥挑选菌落挑出全部放线菌菌落⑦结果有几株产生新抗生素的菌种，包括沉淀物中得到的产生aplasmomycin的Str.griseus分离海洋放线菌的培养基：（1）SC培养基：（2）Z培养基：（3）普通分离放线菌培养基适当稀释，再加入人造海水可溶性淀粉10g酪蛋白1g人造海水500ml蒸馏水500ml琼脂1.7%pH7.4蛋白胨5g磷酸铁0.1g酵母膏1g人造海水1000ml琼脂1.7%pH7.63、极端微生物的分离极端微生物是在特殊环境（如高温、低温、高盐、高碱、高压等）中形成的一类特殊的微生物，因而在分离这类微生物时，需考虑它们生长繁殖所需的特殊条件，以设计分离与培养条件。分离嗜热微生物，有些菌株的最适生长温度高达80℃，pH在1~6；分离嗜盐微生物时培养基中的盐浓度可高达2.5mol/L。4、其他微生物资源粘细菌基因重组微生物利用基因工程技术构建产生新的次级代谢产物的基因重组微生物，逐步创立组合生物合成。利用基因重组微生物提高已有抗生素的产量和有效组分的含量。纤维素堆囊菌（Sorangium

cellulosum）——大环内酯类抗生素堆囊菌素，—琥苍菌素（抗真菌）组合生物合成——将产生不同抗菌药物或其他生理活性中间体的基因重组到一种微生物中，使其生物合成途径重新组合，生产迄今自然界还没有的新的抗生素或生理活性化合物。5、难培养微生物的分离与培养研究VBNC（viablebutnonculturable）——指