DB13-T2596-2017-苹果组培苗繁育技术规程-河北省

ICS65.020.01DB13B61河北省地方标准DB13/T2596—2017苹果组培苗繁育技术规程河北省质量技术监督局发布DB13/T2596—2017前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由河北农业大学提出。本标准起草单位：河北农业大学。本标准主要起草人：师校欣、杜国强、高仪、杨丽丽、许建锋、王燕霞、张莹、刘婉君、成晓华。IDB13/T2596—2017苹果组培苗繁育技术规程1范围本标准规定了苹果品种和砧木（Malusspp.）组织培养繁育过程中的术语和定义、苹果组培苗生产设施、培养基制备、组培室消毒灭菌、苹果组培苗生产、组培苗质量标准、包装、标签和运输等方面的操作规程。本标准适用于苹果品种和砧木组织培养繁育苗木。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB9847苹果苗木LY/T1882-2010NY/T1085-2006NY/T2306-2013NY/T2719-2015林木组织培养育苗技术规程苹果苗木繁育技术规程花卉种苗组培快繁技术规程苹果苗木脱毒技术规范3术语和定义LY/T1882-2010、NY/T2306-2013等界定的以及下列术语和定义适用于本文件。为便于使用，以下重复列出了LY/T1882-2010、NY/T2306-2013中的某些术语和定义。在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体，在人工培养基和人工控制的环境中，使其再生新植株的过程和技术。以植物茎尖为外植体，通过组织培养的方式获得完整植株的一种生物技术。一般用来进行脱毒种苗的生产，以获得不含检疫及影响植物正常生长的病毒的植株。[NY/T2306-2013，定义3.4]1DB13/T2596—20173.4培养基母液mediumstocksolution按试剂种类和性质分别配制的高于培养基配方浓度的溶液。[LY/T1882-2010，定义3.5]3.5灭菌sterilization通过物理、化学及一些理化方法，杀灭一切微生物（包括孢子等）的过程。[NY/T2306-2013，定义3.5]3.6消毒disinfection通过物理、化学方法去除物体表面大部分有害病原微生物（孢子除外）的过程。[NY/T2306-2013，定义3.10]3.73.83.9外植体explant从自然生长的活体植物上获取的用于建立植物组培快繁体系的起始材料。[NY/T2306-2013，定义3.8]采集外植体并对其进行消毒接种，将其置于适宜的培养条件下，启动生长、获得最初的无菌培养在适宜条件下，外植体的顶芽或腋芽萌发形成的嫩梢会长出新的腋芽，腋芽又不断萌发出嫩梢，此过程重复发生而形成的多芽多梢的集合体。2DB13/T2596—20173.12试管苗plantletinvitro通过组织培养方法获得的培养容器中的培养材料。包括外植体初代培养、继代培养、生根培养各阶段的组培材料。注：改写NY/T2306-2013，定义3.7。3.13组培苗plantpropagatedviatissueculture利用植物组织、器官或细胞等作为起始材料，通过植物组织培养方式生产获得的植株。[NY/T2306-2013，定义3.12]4苹果组培苗生产设施苹果组培苗繁育实验室或组培生产工厂应包括培养基制备室、洗涤室、灭菌室、接种室、培养室、制水室、储存室（仓库）、温室或大棚等部分，面积可视工作（生产）规模确定。5培养基制备培养基配方5.15.1.1基本培养基采用MS培养基或C17培养基，具体成分分别见附录A中的表A.1和附录B中的表新红星等元帅系品种：C17+6-苄基腺嘌呤（6-BA）0.5mg/L+吲哚丁酸（IBA）0.2mg/L+水解酪蛋白（CH）300mg/L+蔗糖30g/L+固化剂（能使培养基凝固的最低用量，视固化剂种类确定）。除元帅系外的其它苹果品种和砧木：MS+6-BA0.5mg/L～1.0mg/L+萘乙酸（NAA）0.05mg/L+蔗糖35g/L+固化剂（能使培养基凝固的最低用量，视固化剂种类确定）。继代培养基：基本培养基MS（C17）+6-BA1.0mg/L～3.0mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖35g/L+固化剂（同5.1.2）。生根培养基：1/2MS（1/2C17）+IBA0.3mg/L~0.6mg/L+吲哚乙酸（IAA）1.0mg/L+蔗糖25g/L+固化剂（同5.1.2）。不同苹果品种或砧木组织培养时，培养基中生长调节物质的浓度可根据以上配方给出的浓度范围适当调整。3DB13/T2596—20175.2.2根据附录A中表A.1和附录B中表B.1的基本培养基配方成分分组和浓度扩大倍数，分别配制大量元素（50倍）母液、钙元素（50倍）母液、微量元素-1（200倍）母液、微量元素-2（500倍）母液、铁元素（100倍）母液和有机物（100倍）母液。5.2.3植物生长调节物质配制成单一成分母液，浓度以方便使用为原则，一般为0.1mg/ml～0.5mg/ml。5.2.4培养基母液试剂瓶分别贴上标签，标注母液名称、配制倍数和日期，置于冰箱冷藏保存。有机物母液、铁元素母液和植物生长调节物质母液应储存在棕色试剂瓶中。5.3培养基配制程序5.3.1根据培养基配方与培养基配制数量，计算各种母液的用量及配方中其它成分的用量，登记在册，以备查证。5.3.2按照计算结果称量固化剂与蔗糖（或白砂糖），加入已温热的蒸馏水中，蒸馏水的量以培养基配制体积的1/2～2/3为宜，不断搅拌，熬至沸腾。5.3.35.3.45.3.55.3.65.3.7在熬开的锅内加入相应母液，加蒸馏水定容，充分搅拌均匀。用1.0mol/L盐酸或1.0mol/L氢氧化钠调节pH值至5.8～6.0。将培养基分装到培养容器中，用封口膜、封口盖或棉塞加牛皮纸封口。将培养基放入高压蒸汽灭菌器内灭菌。灭菌温度121℃，灭菌时间20min。灭菌后的培养基在干净、阴凉的室内常温平放保存，保存时间不宜超过2周。67利用超净工作台提供的无菌环境进行接种，使用超净工作台接种前应提前20min开机及紫外刀、镊子等接种工具用酒精擦拭或浸泡，再用电热接种工具灭菌器（280℃～320℃）或酒精灯灼烧灭菌后，置搁置台上冷却至常温使用。选择品种纯正或砧木类型一致、性状稳定、生长健壮、无病虫危害和机械损伤的植株。4DB13/T2596—20177.2.1.2在春季采集由叶芽萌发长出几片小幼叶的幼嫩新梢、未木质化或半木质化新梢，去除新梢上展开的叶片，未展开的小幼叶可不去除。亦可选用一年生枝，将基部浸于水中室内催芽，待叶芽萌动长出幼嫩新梢后及时采集。7.2.1.3将外植体表面用自来水冲洗干净，较长新梢剪段，置于瓶中。外植体消毒7.2.27.2.2.1按照7.1的要求准备好超净工作台及接种工具。7.2.2.2使用5%次氯酸钠溶液，消毒时间10min～15min；使用0.1%氯化汞溶液，消毒时间6min～15min。消毒时间可根据材料的幼嫩程度、洁净程度适当调整。7.2.2.37.2.2.47.2.2.57.2.3消毒期间多次晃动消毒容器，以保证外植体与消毒剂充分接触。外植体消毒完成后，用无菌水冲洗4遍以上。使用过的氯化汞废液禁止随意倾倒，应妥善收集保存，交由当地环保部门处理。外植体切分接种7.2.3.1长度1cm以下的幼嫩新梢去掉外围叶片，基部切出新鲜切口，接入培养基；较长的新梢切单节茎段，节位密集时，亦可切双节或多节茎段接种。7.2.3.27.2.3.37.2.3.47.2.3.5每瓶接1个～3个外植体，要求分布均匀，深浅适中。元帅系品种初代培养较难，可在接种后常规培养1周，然后暗培养1周，再常规培养。暗培利用茎尖培养脱除病毒培育无病毒原种和无病毒苗时，应剥取0.1mm～0.2mm的茎尖分生将初代或继代培养材料，去除基部愈伤组织、老化组织及生长不良的组织，切分成0.5cm～接种数量根据培养容器的大小决定，要求材料摆布均匀，间距1.0cm～2.0cm。培养4周～6周，继代苗生长缓慢至停长时，及时进行继代转接。个别苹果品种或砧木（如苹果砧木难咽等）继代苗停长后衰老速度较快，应适当缩短继代间隔时间。继代增殖阶段，如遇继代苗发生“玻璃化”，在继代培养基中添加1g/L～3g/L聚乙烯醇（PVA），可有效防止玻璃苗发生，也可使部分玻璃化程度较轻的试管苗恢复正常。继代培养4周～6周后，切取长度大于2cm的单根粗壮嫩梢插入生根培养基，接种数量参见7.3.2。5DB13/T2596—20177.4.27.4.37.5接种后放至培养室培养，元帅系品种先暗培养1周，再常规培养，有助于提高生根效果。富士等多数苹果品种需连续继代培养8代～10代以上才能获得较高且稳定的生根率。培养条件外植体初代培养、继代增殖、生根培养各阶段的接种材料均放至培养室培养，培养条件为，温度：（25±2）℃，光照强度：1500Lx～2000Lx，光周期：14h～16h光照时间，8h～10h黑暗时间。7.6试管苗移栽7.6.1移栽适宜条件生根苗出瓶移栽应先在温室（或大棚）进行锻炼和过渡移栽。温室（或大棚）的最适温度25℃，最低温度>10℃，最高温度<35℃，光照强度18000Lx～30000Lx以上。7.6.2移栽容器及基质试管苗移栽容器可选用塑料或无纺布营养钵。基质可用蛭石、草炭、珍珠岩或沙壤土等混合物，装入移栽容器的2/3处，浇透水。7.6.3强光照锻炼生根培养2周~3周、不定根长至约1.0cm时，将试管苗由培养室移至温室，闭瓶锻炼3周，促使试管苗生长充实健壮，适应性和抗逆性增强。温室光照过强时可遮荫。闭瓶锻炼后除去封口材料，开瓶锻炼2d～4d，以增强锻炼效果。将试管苗从培养容器内取出，轻轻抖掉根部的培养基，将小苗直立置于移栽容器的基质上，根系尽量舒展，用0.1%多菌灵药液搅拌消毒过的蛭石覆盖并固定根系。栽后喷0.1%多菌灵液防病，扣小拱棚，保证小拱棚内空气湿度90%以上。过渡移栽2个月后，成活苗地上部生长>10cm，从移栽容器中倒出，带基质土坨移栽至田间。移栽前加强通风炼苗，控制浇水。高温季节移栽应适当遮阴。脱毒方法及病毒检测方法按NY/T2719-2015执行。经病毒检测确认脱除了病毒的材料进行组织培6DB13/T2596—20178试管苗及组培苗质量标准试管苗质量标准8.1适宜出瓶移栽的合格试管苗应无污染，具有3条以上不定根，根长适中，最好有侧根发出，幼茎粗壮，茎基部没有或仅有少量愈伤组织，叶片发育良好，无黄叶，无枯尖。8.2组培苗质量标准出圃的组培苗质量标准按GB9847执行。9包装、标签和运输9.1试管苗包装、标签和运输试管苗应放于泡沫箱中，用填充物固定好，高温季节加冰袋，泡沫箱用胶带密封。标签标明品种、瓶苗数量、包装时间等。码放禁止上下倒置，运输过程避免剧烈颠簸。9.2组培苗包装、标签和运输组培苗的包装、标签和运输按照GB9847的规定执行。7DB13/T2596—2017附录A（规范性附录）MS基本培养基配方表A.1规定了MS培养基的配方。表A.1MS培养基成分及母液配制表配方规定量配制1升母液所需量母液种类及倍数试剂mg/LgKNO31900165037095NH4NO3MgSO4•7H2OKH2PO482.518.58.5大量元素50x170钙元素CaCl2•2H2O4402250xNa2•EDTA•2H2OFeSO4•7H2OVB137.327.80.13.732.780.010.050.050.2铁元素100x100x甘氨酸200x500x8DB13/T2596—2017附录B（规范性附录）C17基本培养基配方（适合元帅系品种）表B.1规定了C17培养基的配方。表B.1C17培养基成分及母液配制表配方规定量配制1升母液所需量母液倍数试剂mg/LgKNO3NH4NO314003001504007015大量元素50xMgSO4•7H2OKH2PO47.520钙元素CaCl2•2H2O1507.550xFeSO4•7H2ONa2•EDTA•2H2O甘氨酸27.8537.2522.793.730.2铁元素100x100x微量元素-1200x微量元素-2500x9DB13/T2596—2017附录C（资料性附录）组培室消毒灭菌工作细则C.1接种室消毒灭菌工作细则C.1.1C.1.2C.1.3每天清洁接种室地面、窗台、超净工作台等，去除灰尘污物。晴朗、无风或微风、无雾霾或其它污染物的良好天气时，可开窗通风0.5h～1h。按照每15m配置1根30w紫外灯，每1g臭氧可杀菌20m的标准，每天用紫外灯照射杀菌231h，每周2次～3次臭氧消毒