《核酸检测技术》课件

核酸检测技术探索分子诊断的前沿技术了解现代医学诊断的金标准掌握疾病预防与医疗健康的核心技术什么是核酸检测核酸基础DNA为双链结构RNA为单链结构生物信息载体携带遗传信息控制生命活动检测意义分子水平诊断精准医疗基础核酸检测的发展历程11970年代限制性内切酶应用分子克隆技术建立21983年PCR技术首次提出科学家KaryMullis发明31990-2000年代实时荧光PCR发展检测灵敏度大幅提高421世纪高通量测序兴起CRISPR检测技术发展核酸检测在现代医学中的地位诊断金标准精确度远超传统方法病原体检测快速识别传染源遗传病筛查早期干预提高预后肿瘤精准诊疗指导靶向治疗方案核酸分子的结构特征DNA结构双螺旋结构碱基配对规则遗传信息稳定存储RNA结构单链结构更易降解多种功能性分子结构意义碱基互补配对为检测提供理论基础设计特异性引物关键核酸提取与纯化样本裂解破碎细胞膜和核膜去除蛋白质酚-氯仿提取法核酸沉淀乙醇沉淀回收质量检测纯度与浓度测定分子诊断基础检测结果解读临床意义分析信号获取荧光/电化学检测3核酸扩增特异性放大目标序列样本前处理核酸提取与纯化核酸检测适用范围传染病病毒、细菌、真菌检测肿瘤突变检测与分型遗传病单基因病与多基因疾病3产前检测无创产前基因检测药物基因组学个体化用药指导核酸检测的优势与局限优势灵敏度极高特异性强可定量分析自动化程度高局限成本较高需专业技术人员设备要求高受样本质量影响大核酸检测的基本工作流程样本采集采集合适样本严格防污染措施核酸提取裂解细胞纯化核酸核酸扩增PCR或其他方法特异性引物设计结果检测信号获取数据分析与解读PCR技术原理变性95°C双链分离退火55-65°C引物结合延伸72°C合成新链循环30-40次指数增殖实时荧光定量PCR（qPCR）技术优势实时监测扩增过程CT值原理定量分析基础荧光检测方式探针法或染料法应用场景病毒载量测定数字PCR技术样本分区分成数千微滴绝对定量无需标准曲线高灵敏度检测稀有突变高精确度降低系统误差等温扩增技术概述LAMP技术环介导等温扩增60-65°C条件下反应RPA技术重组酶聚合酶扩增37-42°C低温反应共同优势无需热循环仪快速获得结果核酸杂交技术1探针结合特异识别目标序列杂交条件温度影响特异性信号产生荧光或其他标记显示高通量测序（NGS）简介文库构建DNA片段化接头连接大规模并行测序同时测数百万片段碱基逐个识别数据分析生物信息学处理序列比对与变异检出基因芯片检测探针固定芯片表面阵列化1样本标记荧光或生物素标记杂交特异性结合目标信号检测芯片扫描仪读取CRISPR/Cas核酸检测靶标识别gRNA特异结合Cas蛋白激活切割活性释放信号放大侧向切割报告分子结果检测荧光或试纸条显示检测样本类型血液循环肿瘤DNA检测全血/血浆/血清拭子呼吸道病原体检测咽拭子/鼻拭子尿液泌尿系统感染检测无创样本采集结果解读与质量控制质控要素阴性对照阳性对照内参基因扩增曲线形态结果判定CT值评估阈值设定重复性分析临床关联性RT-PCR检测技术详解逆转录RNA转化为cDNA逆转录酶催化PCR扩增目标cDNA放大特异引物识别信号检测荧光实时监测CT值分析结果RT-PCR优势与不足优势RNA病毒高效检测敏感性低至几拷贝检出不足RNA易降解风险时间成本操作复杂耗时长荧光定量PCR（qPCR）应用端点PCR法简介PCR反应常规热循环扩增电泳制备凝胶制备与上样电泳分离DNA片段大小分离成像分析荧光染料显示条带数字PCR实际应用案例LAMP等温扩增应用65°C反应温度恒温水浴即可30分钟检测时间快速出结果6条引物数量高特异性设计109倍扩增倍数超高效扩增LAMP法优势恒温反应无需昂贵热循环仪速度快20-60分钟完成可视化结果肉眼可观察沉淀现场检测适合基层和野外RPA等温扩增特色低温条件37-42℃反应体温即可启动能耗极低高速反应10-20分钟检测重组酶介导无需热变性步骤应用场景现场快速诊断资源有限地区便携式设备集成核酸杂交技术应用场景HPV分型探针区分不同亚型DNA指纹法医鉴定应用FISH技术染色体异常检测探针设计与优化靶点选择高度保守区域熔解温度Tm值合理设计长度优化15-30个核苷酸特异性验证生物信息学分析高通量测序在基因组学个体化医疗靶向药物筛选2全基因组测序整体变异图谱外显子组测序编码区变异筛查靶向测序已知基因深度分析基因芯片检测流程样本标记荧光或生物素PCR扩增目标芯片杂交温度控制严格特异性结合靶标清洗步骤洗去非特异信号降低背景干扰扫描分析激光扫描仪读取软件分析信号强度微阵列芯片的局限已知序列限制仅能检测已知变异无法发现新突变分辨率受限点密度有物理极限检测精度需提高背景干扰交叉杂交风险假阳性可能性CRISPR/Cas报告系统靶标结合gRNA识别特定序列1特异性切割Cas蛋白激活侧向切割活性切割报告分子信号产生荧光或其他指示CRISPR/Cas在新冠检测SHERLOCK系统Cas13a蛋白应用RNA检测能力强灵敏度可达10拷贝DETECTR系统Cas12a蛋白为核心侧向流试纸条显示现场快速诊断10-30分钟获得结果高特异性识别病毒变异主流检测方法对比方法灵敏度特异性速度成本RT-PCR高高4-6小时中-高LAMP中-高中30-60分钟低数字PCR极高极高4-6小时高CRISPR高高30-60分钟中核酸检测在新冠疫情防控1000万+日检测量全球高峰期单日量4小时检测时间标准RT-PCR流程40Ct阳性判断值国际通用标准10拷贝检出限高灵敏度检测能力流感病毒核酸检测多重PCR同时检测多种亚型区分能力甄别H1N1/H3N2等快速诊断指导抗病毒治疗乙肝、丙肝病毒核酸检测肿瘤分子诊断ctDNA液体活检无创肿瘤监测靶向药物伴随诊断个体化治疗方案复发监测微小残留病灶检测遗传病基因检测单基因病直接检测特定突变产前筛查无创产前基因检测家族风险评估遗传咨询依据新生儿筛查早期干预提高预后药物基因组学与伴随诊断个体化治疗最优剂量与药物选择疗效预测药物反应性基因检测不良反应预防代谢酶基因多态性分析4药物靶点检测特定靶向药物基因状态食品与环境核酸检测食品安全转基因成分鉴定食源性病原体检测肉类来源鉴别环境监测水体微生物检测土壤污染评估生物多样性研究技术特点高通量筛查多靶点同时检测定量分析能力异地/应急核酸检测移动实验室车载核酸检测系统便携式设备野外快速检测远程数据传输结果云端分析现场应用灾区、边远地区检测国内外核酸检测行业现状技术标准及法规解读国家标准GB/T37892-2019核酸检测通用要求实验室认证ISO15189医学实验室CAP认证要求生物安全规范BSL-2实验室要求样本处理安全标准自动化与信息化趋势家用自测与便携式检测样本自采集鼻拭子自检操作简化采样流程即时检测便携式检测设备20-30