血液分析仪检测原理及散点图直方图

血液分析仪检测原理及散点图直方图汇报人：XXX202505101主要内容一

血液分析仪检测原理及技术二

不同仪器检测原理的综合应用三

散点图四

直方图2

一

血液分析仪检测原理及技术

血液分析仪检测原理主要分为两类：电学和光（化）学，用于测定血液中的细胞和细胞内容物。

（一）电学检测原理及技术1电阻抗法

2射频电导法

（二）光（化）学检测原理及技术

1激光散射法

2分光光度法

3

一

血液分析仪检测原理及技术

（一）电学检测原理及技术1电阻抗法

仪器小孔管有内外两个电极。当注入等渗缓冲液并加载低频直流电后，内、外电极与缓冲液即构成电流回路。

当细胞悬液流经宝石计数小孔时，由于血细胞具有相对非导电的特性，使电路中小孔感应区内的电阻突然增大，引起瞬间电压变化而形成脉冲信号。

脉冲信号的强弱反映细胞体积的大小，脉冲信号的多少反映细胞的数量。这些信号经过放大、阈值调节、甄别、整形、计数及自动控制保护系统，完成对血细胞的计数和体积测定。三分类血液分析多采用电阻抗法。

电阻抗法细胞计数原理图4

一

血液分析仪检测原理及技术

（一）电学检测原理及技术2射频电导法

射频（radiofrequency,RF）指射频电流，是每秒变化＞10000次的高频交流电磁波。

高频电流能通过细胞膜，由于不同细胞内部结构不同，电导性也不同，因此用高频电磁探针检测细胞的电导性，利用细胞内部化学成分、胞核和胞质（核质比）、颗粒成分（大小、密度）等特征性信息进行细胞分类。

电导性有助于鉴别体积相同、但内部结构不同的细胞（或相似体积的颗粒）；如淋巴细胞和嗜碱性粒细胞的直径虽均为9～12μm,但在高频电流检测时，因两类细胞核质比例不同而出现不同的检测信号。

射频电流检测原理5

一

血液分析仪检测原理及技术

（二）光（化）学检测原理及技术

1激光散射法

（1）原理：光散射是指光在透明介质中传播时，有部分光波偏离原有方向而向四周传播的现象。经稀释、染色等处理后的细胞悬液注入鞘液流中央，细胞沿着悬液和鞘液流两股液流整齐单个排列，以恒定流速定向通过检测区。

细胞在检测区被激光束照射时，因其自身的特性（如体积、染色程度、细胞内容物大小及多少、细胞核密度等）可阻挡或改变光束的方向，产生与其特征相应的各种角度的散射光（表1），并被信号检测器接收。

鞘流技术1检测光；2细胞流；3前鞘流；4后鞘流；5液流方向。67散射光意义低角度散射光（前向散射光，FSC）反映细胞（或颗粒）的数量和表面体积。细胞越大，FSC的信号就越强。高角度散射光（侧向散射光，SSC）反映细胞内部颗粒、细胞核等复杂性。细胞内部构造越复杂，SSC的信号越强。如嗜酸性粒细胞由于内部颗粒特征明显，其侧向散射光（SSC）信号最强，落在散点图的最右方。侧向荧光（SFL）反映了核酸的含量的多少，提示细胞发育的成熟程度。表1各种角度的散射光及其意义

一

血液分析仪检测原理及技术

（二）光（化）学检测原理及技术

1激光散射法

（2）应用：散射光技术可检测染色后的细胞，不同种类的细胞被染料着色的强弱程度不同，产生的散射荧光及散射光变化也不同，因此可准确区分正常类型的细胞（或颗粒）。染料包括荧光染料和非荧光染料（见表2）。

流式细胞术检测通道和光路系统8表2染料的种类及应用类别种类应用荧光染料主要有碱性槐黄、噻唑橙、恶嗪、碘化丙啶、聚亚甲基蓝等。主要用于核酸染色，荧光染色后的细胞（或颗粒）经激光照射后可产生特定波长的散射荧光。非荧光染料主要有亚甲基蓝（用于核酸染色）、氯唑黑、过氧化物酶等。细胞被染色，部分发生光吸收现象，使散射光强度发生变化。9

一

血液分析仪检测原理及技术

（二）光（化）学检测原理及技术2分光光度法：主要用于血红蛋白测定，检测原理同手工分光光度仪比色法的血红蛋白检测，遵循Lamber～Beer定律。

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二

不同仪器检测原理的综合应用

（一）白细胞五分类计数及相关参数检测

（二）红细胞计数及相关参数检测

（三）血小板计数及相关参数检测

（四）网织红细胞及相关参数检测

（五）有核红细胞计数及相关参数检测

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二

不同仪器检测原理的综合应用

（一）白细胞五分类计数及相关参数检测

1激光与细胞化学法

2体积、电导、光散射法

3电阻抗与射频法

4多角度偏振光散射法12

二

不同仪器检测原理的综合应用

（一）白细胞五分类计数及相关参数检测

1激光与细胞化学法

应用激光散射和过氧化物酶染色技术进行白细胞计数和白细胞分类计数。

（1）过氧化物酶染色通道：在白细胞通道加入溶血剂和POX染色剂，白细胞POX活性由大到小的依次为：嗜酸性粒细胞＞中性粒细胞＞单核细胞；淋巴细胞和嗜碱性粒细胞无POX活性。可计算过氧化物酶平均指数（MPXI)，得到嗜酸性粒细胞、中性粒细胞或单核细胞的相对POX活性。形成以POX分布强度为X轴、以细胞体积为Y轴的散点图，进行白细胞计数与分类。

白细胞（NLME）POX染色散点图POX活性FSC13

二

不同仪器检测原理的综合应用

（一）白细胞五分类计数及相关参数检测

1激光与细胞化学法

（2）

嗜碱性粒细胞/核分叶性通道：苯二酸完全破坏红细胞和血小板；除嗜碱性粒细胞外，其他白细胞膜溶解，胞质溢出，仅剩祼核。完整的嗜碱性粒细胞呈高角度散射，位于散点图上部；祼核则位于下部，可进行白细胞计数和嗜碱粒计数。

（3）

未染色大细胞计数（LUC）检测：在POX通道，可检测到无POX活性，体积大于正常淋巴细胞体积平均值2个标准差的细胞，如异淋、浆细胞、幼淋及原始细胞。嗜碱性粒细胞/核分叶性散点图14

二

不同仪器检测原理的综合应用

（一）白细胞五分类计数及相关参数检测

2体积、电导、光散射法

体积、电导、光散射法：即VCS技术，包括应用电阻抗原理测量细胞体积（volume，V）,应用电导性（conductivity，C）测量细胞内部结构及接收每一个细胞经激光源照射后产生的不同角度的光散射（scatter，S）技术。15

二

不同仪器检测原理的综合应用

（一）白细胞五分类计数及相关参数检测

3电阻抗与射频法（sysmexXN～1000）

（1）4DIFF通道（WDF通道）：利用半导体激光流式细胞术、核酸荧光染色技术。采用溶血剂完全溶解红细胞和血小板，白细胞膜仅部分溶解。聚亚甲基蓝核酸荧光染料进入白细胞内，使DNA、RNA和细胞器着色。因荧光强度与细胞内核酸含量成比例，所以未成熟粒细胞、异常细胞荧光染色深，成熟白细胞荧光染色浅，从而得到4DIFF白细胞散点图。

白细胞分类—4DIFF散点图EoNML16

二

不同仪器检测原理的综合应用

（一）白细胞五分类计数及相关参数检测

3电阻抗与射频法（sysmexXN～1000）

（2）白细胞/嗜碱性粒细胞通道（WNR通道）：在碱性溶血剂作用下，除嗜碱粒细胞外的其他所有细胞均被溶解或萎缩，经流式细胞术计数，可得到白细胞/嗜碱性粒细胞百分率和绝对值及及WBC/BASO散点图。

白细胞分类—WBC/BASO散点图WBCB17

二

不同仪器检测原理的综合应用

（一）白细胞五分类计数及相关参数检测

3电阻抗与射频法

（3）未成熟髓细胞信息（IMI）通道：采用射频、电阻抗和特殊试剂结合法。在细胞悬液中加入硫化氨基酸，幼稚细胞膜脂质含量高，结合硫化氨基酸的量多于较成熟的细胞，对溶血剂有抵抗作用。加入溶血剂后，成熟细胞被溶解，只留下幼稚细胞（包括造血祖细胞、原始细胞、未成熟细胞、有核红细胞）和异型/异常淋巴细胞，报告百分率和绝对值，并提示核左移。

未成熟粒细胞信息通道散点图18

二

不同仪器检测原理的综合应用

（一）白细胞五分类计数及相关参数检测

4多角度偏振光散射法

（1）多角度偏振光散射法：应用氮氖激光流式细胞术，分四个角度检测。

①0度：反映细胞大小、检测细胞数量。②7度：反映细胞内部结构及核染色质的复杂性。③90度偏振光：反映细胞内部颗粒及细胞核分叶情况。④90度去偏振光：“去偏振”是指垂直方向的的激光光波运动随光散射结果而改变。嗜酸性粒细胞颗粒丰富，可消除偏振光，以与中性粒细胞相鉴别。19

二

不同仪器检测原理的综合应用

（一）白细胞五分类计数及相关参数检测

4多角度偏振光散射法

（2）染料：鞘液中的DNA染料碘化丙啶可破坏有核红细胞膜，只留下裸核而将其染色。染料对有活性的白细胞只有极小渗透性或无渗透性，故其细胞核不染色。通过多散点图分析（MSA），可鉴别有核红细胞、无活性白细胞和脆性白细胞，计算活性白细胞比率和计数有核红细胞。20

二

不同仪器检测原理的综合应用

（二）红细胞计数及相关参数检测：分别组合应用电阻法、流式细胞术-光散射-电阻抗法、流式细胞术-光散射法。

（三）血小板计数及相关参数检测：分别组合应用电阻抗法、流式细胞光散射-核酸荧光染色-电阻抗法、流式细胞术-光散射法等。

（四）网织红细胞及相关参数检测：应用非荧光或荧光RNA染色光散射法。

（五）有核红细胞计数及相关参数检测：应用VCS法、流式细胞DNA荧光染色光散射法等。

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三

散点图识别

散点图上的每个点代表被测定的一个细胞或某种颗粒，此点的横坐标和纵坐标分别代表细胞或某种颗粒的两项特性。由于各种细胞的理化性质不同，具有特征性的细胞或某种颗粒在坐标上点的位置也不同，如用不同颜色的点代表各类细胞或某种颗粒，则在散点图上可见不同区域彩色散点图，从而加以区分。

各种五分类血液分析仪均采用激光散射法和散点图来表达测定的结果，不同型号的仪器因检测原理组合不同，散点图表达形式也有显著差别。sysmexXN～1000型血液分析仪主要有WNR散点图和WNR散点图。22

三

散点图识别（一）WDF散点图

进行白细胞的计数，分类为淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞，并提示异常/幼稚细胞的检出。通过溶血剂破坏红细胞，白细胞胞膜轻微受损，利用SSC获得不同白细胞内部构造复杂程度的差异；通过荧光染色，利用SFL获得不同白细胞核酸及细胞器种类和多少的差异，从而对各类白细胞进行区别计数。注：Debris：影细胞/细胞碎片；LYMPH：淋巴细胞；AbnormallymphBlast：异常淋巴细胞/原幼淋巴细胞；Atypicallymph：不典型淋巴细胞/异型淋巴细胞；Leftshift：核左移；IG：未成熟粒细胞（包括杆、早、中、晚）。SSC侧向散射光SFL侧向荧光WDF通道散点图23

三

散点图识别（二）WNR散点图

进行白细胞的计数、嗜碱性粒细胞和有核红细胞的分类计数。

通过溶血剂破坏红细胞，白细胞胞膜轻微受损，利用FSC获得白细胞形态差异，将嗜碱性粒细胞区别于其他白细胞进行计数；通过荧光染色，利用SFL检出有核红细胞并进行计数。注:Debris：影细胞/细胞碎片；PLTClumps：血小板凝集；WBC：除外BASO的其他白细胞；NRBC：有核红细胞；BASO：嗜碱性粒细胞。SFL侧向荧光FSC前向散射光图12WNR通道散点图24

四

直方图

仪器采用电阻法计数细胞数量的同时，能提供细胞体积分布图形，横坐标为血细胞体积大小，纵坐标为不同体积细胞的相对频率，这些用以表示细胞群体分布情况的曲线图形，称作细胞直方图。25

四

直方图

1直方图的观察要点2白细胞直方图

3红细胞直方图4血小板直方图26

四

直方图1直方图的观察要点：①

峰的位置反映主细胞群体积；②

峰的高度反映主细胞群数量；③

峰底宽度反映主细胞群体积均一性；④

峰的头尾处异常提示干扰因素；⑤

异常峰提示异常细胞群。27

四

直方图2白细胞直方图

在35～450fl范围内将血细胞分为3群。正常白细胞直方图左侧峰又高又陡，跨越35～95fl，定为淋巴细胞峰（小细胞群），以成熟小淋巴细胞为主；最右侧峰又低又宽，跨越160～450fl，定义为中性粒细胞峰（大细胞群），以中性粒细胞为主，包含杆状粒细胞和晚幼粒细胞；左右两峰之间的谷平坦区，定为单个细胞峰（中间细胞群），主要以单核细胞为主，也含有嗜酸、嗜碱性粒细胞及白血病细胞等。白细胞异常直方图信号的含义见表3。28表3白细胞异常直方图信号的含义符号异常区域可能原因R1淋巴细胞峰左侧有血小板聚集、巨大血小板、有核红红胞、未溶解红细胞、白细胞碎片、蛋白质或脂类颗粒R2淋巴细胞峰与单个核细胞峰之间有异淋、浆细胞、非典型细胞、原始细胞、嗜酸性粒细胞增多、嗜碱性粒细胞增多R3单个核细胞区与中性粒细胞峰之间有未成熟的中性粒细胞、异常细胞亚群、嗜酸性粒细胞增多、嗜碱性粒细胞增多R4中性粒细胞峰右侧中性粒细胞绝对值增多RM出现多部位警报同时存在2种或2种以上的异常29

四

直方图3红细胞直方图

仪器在36～360fL范围内分析红细胞。正常红细胞，主要分布在50～200fL范围内，可见两个细胞群体。从50～125fL区域有一个几乎两侧对称、较狭窄的正态分布曲线；主峰右侧在125～200fL区域的细胞，为大红细胞和网织红细胞。红细胞体积大小发生变化，峰可左移或右移，或出现双峰。MCV：90.2fl（正常范围82～96fl）RDW～SD:45.1fl（正常范围37～50fl）RDW～CV:13.9%（正常范围11.5～15.5%）30

四

直方图3红细胞直方图RDW～SD与RDW～CV