高三生物一轮复习课件 第4讲动物细胞工程

第4讲

动物细胞工程动物细胞培养考点一一、动物细胞培养1.概念：

从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。原理地位对象目的细胞增殖（主：有丝分裂）动物细胞工程的基础胚胎或幼龄动物的细胞获得细胞或者细胞产物一、动物细胞培养2.培养条件：（1）营养：合成培养基+血清等天然成分①无机物：无机盐等②有机物：糖类、氨基酸、维生素、血清……

血清将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基。含人类未知、细胞生长增殖所必需的物质，满足细胞对未知营养成分的需求。蛋白质、氨基酸、未知的促生长因子等合成培养基一般用液体培养基，也称为培养液血清不能灭菌2.培养条件：（2）无菌、无毒的环境：无菌①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理②在无菌环境下进行操作无毒定期更换培养液，以便清除代谢物，防止细胞代谢物对细胞自身造成危害③添加一定量抗生素（抑制培养液中细菌的生长和繁殖）一、动物细胞培养湿热灭菌处理一、动物细胞培养2.培养条件：合成培养基在培养基中加入一定量的抗生素，从培养基功能的角度分类属于

培养基，用于动物细胞培养的培养基中没有加入凝固剂（如琼脂），从物理性质分类属于

培养基，从化学成分分类属于

培养基选择液体合成2.培养条件：温度pH（3）适宜的温度、pH和渗透压：哺乳动物多以（36.5±0.5）℃多数细胞生存的适宜pH在7.2-7.4一、动物细胞培养渗透压需要考虑的一个重要环境参数（维持细胞正常形态和功能）2.培养条件：95%空气5%CO2（4）气体环境：维持培养液的pH细胞代谢所必需一、动物细胞培养培养装置培养皿或松盖培养瓶置于CO2培养箱，CO2培养箱可定期消毒95%空气+5%CO22.培养过程：一、动物细胞培养胰蛋白酶胶原蛋白酶单个细胞培养液（1）制备细胞悬液：取动物组织①部位：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官选材原因：这些细胞生命旺盛，分化程度低，分裂能力强，容易培养2.培养过程：一、动物细胞培养②将组织分散成单个细胞的原因:从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖。③将组织分散成单个细胞的优点：（1）制备细胞悬液：a.使细胞与培养液充分接触，保证细胞所需营养和氧气的供应，保证细胞内代谢产物的及时排出b.使得在细胞水平操作的其他技术得以实现。④进行动物细胞培养时常用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质，胰蛋白酶的用量和时间需控制好。2.培养的过程：一、动物细胞培养（1）制备细胞悬液：短时间内细胞________(填“会”或“不会”)被胰蛋白酶消化，原因是_________________________________________________________。长时间后细胞____(填“会”或“不会”)被胰蛋白酶消化，原因是_________________________________________________________________________________________________________________________不会细胞表面具有糖蛋白，对细胞具有一定的保护作用会细胞表面糖蛋白的保护作用是有限的；细胞膜的主要成分包括磷脂和蛋白质，长时间处理，细胞膜蛋白质可被胰蛋白酶水解⑤进行动物细胞培养时不可用胃蛋白酶

胃蛋白酶作用的适宜pH约为1.5，当pH大于6时，胃蛋白酶就失去活性，多数动物细胞培养的适宜pH为7.2~7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以不能用胃蛋白酶。2.培养的过程：一、动物细胞培养（1）制备细胞悬液：2.培养的过程：一、动物细胞培养（2）动物细胞培养：①培养对象:a.悬浮（生长）细胞：细胞能够悬浮在培养液中生长増殖b.贴壁（生长）细胞：细胞需要贴附于某些基质（如培养瓶壁）表面才能增殖（主要类型）方法：用培养液将细胞制成细胞悬液，再将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养。培养瓶或培养皿要求：内表面光滑、无毒、易于贴附。2.培养的过程：一、动物细胞培养（2）动物细胞培养：②贴壁细胞的培养现象（特点）:a.细胞贴壁现象：贴壁生长细胞细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。b.接触抑制现象：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。接触抑制现象的原因：细胞增殖到相互接触的时候，细胞表面的糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续繁殖。特例：肿瘤细胞、杂交瘤细胞细胞膜表面糖蛋白等物质显著减少，失去接触抑制，细胞之间的黏着性显著降低，适宜条件下可以无限增殖，可形成多层细胞)2.培养的过程：一、动物细胞培养（2）动物细胞培养：③影响细胞生长因素:解除措施：分瓶培养悬浮生长细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等因素而分裂受阻。一般会形成单层细胞贴壁生长细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏、及接触抑制现象等因素而分裂受阻。2.培养的过程：一、动物细胞培养（2）动物细胞培养：a.原代培养：分瓶前的细胞培养。指动物组织经处理后的初次培养。b.传代培养：分瓶后的细胞培养。④培养阶段:二、动物细胞培养的过程⑤进行培养的过程:a.悬浮生长细胞：细胞悬液

原代培养

制成细胞悬液

分瓶培养用离心法收集细胞加培养液b.贴壁生长细胞：细胞悬液

原代培养

制成细胞悬液

分瓶培养先用胰蛋白酶等处理，再用离心法收集细胞加培养液（2）动物细胞培养：2.培养的过程：一、动物细胞培养（2）动物细胞培养：[易错提醒]区分原代培养和传代培养的关键是看用胰蛋白酶处理的对象和是否分瓶；

分瓶前，第一次用胰蛋白酶对动物组织进行处理后的培养是原代培养；第二次用胰蛋白酶处理，使细胞从瓶壁上脱离下来，分瓶后的细胞培养为传代培养。原代培养传代培养少数形成细胞株少数形成细胞系遗传物质改变遗传物质有的改变多数细胞固定在表面生长和分裂随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖细胞悬浮液10代细胞50代细胞无限传代培养危机：危机1危机2遗传物质上来讲：传代培养过程中部分细胞可能发生细胞转化（即遗传物质改变）绝大部分细胞凋亡一、动物细胞培养植物组织培养和动物细胞培养的比较项目植物组织培养动物细胞培养原理细胞全能性、细胞增殖细胞增殖培养前处理无菌；用机械的方法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理，使组织分散成单个细胞无菌、离体取材幼嫩的细胞、组织或器官胚胎或出生不久的幼龄动物器官或组织培养基成分无机盐、蔗糖、维生素、植物激素、琼脂等糖类、氨基酸、无机盐、微量元素、维生素、血清等培养基类型固体液体项目植物组织培养动物细胞培养结果植株或大量细胞只能获得大量细胞，不能得到生物个体应用快速繁殖、作物脱毒、细胞产物的工厂化生产和单倍体育种等人造皮肤的构建、动物分泌蛋白的规模化生产相同点①都需人工条件下的无菌操作；②都需要适宜的温度、pH等条件；③都进行有丝分裂，都不涉及减数分裂二、干细胞1.概念：3.来源：是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，与组织、器官的发育、再生和修复密切相关。在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞存在于

、

和

等多种组织和器官中早期胚胎骨髓脐带血

体积较小，细胞核大，核仁明显。2.特点：分布特点（作用）局限性胚胎干细胞早期胚胎中具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。必须从胚胎中获取，涉及伦理问题；因而限制了在医学上的应用。二、干细胞4.分类：动物体内包括胚胎干细胞(ES细胞）和成体干细胞等培养ES细胞的培养基中加入胰岛素等激素以提高形成率（促进细胞增殖，有利于动物细胞对葡萄糖的摄取）成体干细胞分布特点（作用）运用实例类型成体组织或器官内具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力①造血干细胞（主要骨髓、外周血和脐带血中）②神经干细胞（神经系统中）③精原干细胞（睾丸中）治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病造血干细胞→神经干细胞→造血干细胞是发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例二、干细胞二、干细胞4.分类：诱导多能干细胞概念获取方法优点通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称iPS细胞将特定基因或特定蛋白导入细胞中或者用小分子化合物诱导形成。运用实例①可治疗镰状细胞贫血症②在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展①诱导过程无须破坏胚胎②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应，所以科学家普遍认为ips细胞的应用前景优于胚胎干细胞。二、干细胞4.分类：诱导多能干细胞过程取成纤维细胞转入相关因子细胞转化为iPS细胞诱导iPS细胞定向分化为多种组织细胞移植回病人体内Ips细胞最初由成纤维细胞转化而来，后来发现已分化的T细胞、B细胞等也能被诱导为ips细胞。1.若将病人的皮肤成纤维细胞诱导成iPS细胞，再使它转化为需要的细胞，用这些细胞给病人治病，不会产生免疫排斥反应，尝试解释其中的原因。iPS细胞来源于病人自身的体细胞。2.利用iPS细胞治疗镰状细胞贫血的过程是首先制备患者的iPS细胞，再将其诱导形成造血干细胞，最终输给患者使其产生健康的血细胞。判断该过程是否能治疗镰状细胞贫血？并阐述理由。不能。镰状细胞贫血是常染色体单基因隐性遗传病(基因突变)，因为从患者中获取的体细胞的相应基因是突变的，制成iPS细胞相应基因仍是突变的，诱导分化形成的造血干细胞成也是突变的，因此无法通过该过程治疗。制备iPS细胞时可用健康的基因取代镰状细胞贫血的致病基因，再将其诱导形成造血干细胞，这样可用于治疗小鼠的镰状细胞贫血。面临的问题运用展望存在导致肿瘤发生的风险干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。胚胎干细胞成体干细胞二、干细胞5.面临的问题和运用展望：动物细胞融合技术与单克隆抗体一、动物细胞融合技术1.概念：使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。细胞膜的结构特点即细胞膜具有一定的流动性2.原理：物理法：电融合法化学法：聚乙二醇（PEG)生物法：灭活病毒诱导法（动物细胞融合特有）3.诱导方法：一、动物细胞融合技术4.结果：形成具有原来两个或多个细胞的遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。5.意义：研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。6.应用：Q.大量制备单一抗体的思路遗憾的是，在体外培养条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体B淋巴细胞群克隆单一B淋巴细胞选择大量纯度高特异性强的抗体产生骨髓瘤细胞能在体外大量增殖Q.有什么办法能得到既能迅速大量增殖又能产生大量特定抗体的细胞呢？（但不能产生抗体）单克隆抗体米尔斯坦【英国】科勒【德国】二、单克隆抗体及其应用1.单克隆抗体的制备：（1）技术手段：动物细胞融合和动物细胞培养（2）制备原理：B淋巴细胞特点：一种B淋巴细胞只分泌

种特异性抗体，但不能在体外无限增殖。骨髓瘤细胞特点：能在体外大量增殖，但不能产生抗体。杂交瘤细胞的特点：由B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合得到，既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。一①细胞融合——细胞膜具有一定的流动性②动物细胞培养——细胞增殖有丝分裂、不涉及减数分裂③三类细胞特点多次注射特定的抗原进行免疫多种B淋巴细胞从脾中提取①为什么要注射特定的抗原？为了刺激机体发生免疫应答，从而获得能产生特定抗体的的B淋巴细胞②那为什么得的是多种B淋巴细胞呢？因为一种B淋巴细胞只能产生一种特定的抗体，小鼠的脾中分离出来的B细胞，还包含了其他抗原激活的B淋巴细胞二、单克隆抗体及其应用1.单克隆抗体的制备：（3）制备过程：骨髓瘤细胞诱导融合将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合能大量增殖，但不能产生抗体PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法培养骨髓瘤细胞多次注射特定的抗原进行免疫多种B淋巴细胞从脾中提取能产生抗体，但不能大量增殖（3）制备过程：骨髓瘤细胞诱导融合将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合多种B淋巴细胞多种杂交细胞③若只考虑细胞的两两融合，融合形成的细胞有几种？需要的是？A-A细胞A-B细胞B-B细胞3种杂交瘤细胞未融合细胞一共有5种，AA、BB、AB、A、B,出现不同类型是因为细胞融合不是100%的，且是随机的。（3）制备过程：杂交瘤细胞方法：用特定的选择培养基(HAT培养基)：在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长第一次筛选目的：筛选获得杂交瘤细胞特点：既能迅速大量增殖，又能产生抗体原因：诱导融合后得到多种杂交细胞，还有未融合的细胞。（3）制备过程：杂交瘤细胞特点：既能迅速大量增殖，又能产生抗体第二次筛选目的：筛选得到能分泌所需特异性抗体的杂交瘤细胞方法：克隆化培养、抗体检测抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞能产生所需抗体的杂交瘤细胞方法：抗原—抗体杂交原理：抗原—抗体特异性结合原因：小鼠生活中受到其他抗原的刺激，经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞。（3）制备过程：单克隆抗体从细胞培养液中提取从小鼠腹水中提取注射到小鼠腹腔内体外培养体内培养抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞能产生所需抗体的杂交瘤细胞（3）制备过程：最终目的：获得能与抗原特异性结合的单克隆抗体体外培养和体内培养的目的：获得大量单克隆抗体（离心取上清）项目腹腔培养体外培养优点缺点易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低规模小，产量少可大规模培养，大量生产需要人为控制培养条件，成本相对较高二、单克隆抗体及其应用1.单克隆抗体的制备：二、单克隆抗体及其应用1.单克隆抗体的制备：（4）血清抗体和单克隆抗体区别：①抗体的概念：抗体是机体受

刺激后产生的、并能与之发生特异性结合的具有免疫功能的

。②抗体是由

细胞合成和分泌的，每种这种细胞能产生

抗体。③动物免疫反应中产生的抗体有

种④为获得单一的抗体，

（能/不能）选用特定的浆细胞直接去培养；理由是

。抗原蛋白质浆多不能浆细胞已经高度分化，不能再分裂一种二、单克隆抗体及其应用常规抗体：（传统抗体）（血清抗体)方法：向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生____，然后从动物____中分离所需抗体缺点：产量低、纯度低、________。抗体血清

特异性差单克隆抗体：方法：由________________增殖产生的高度专一的抗体。优点：单一杂交瘤细胞

①灵敏度高，能准确地识别______的细微差异。②特异性强，与特定____发生特异性结合。③能大量制备。抗原抗原1.单克隆抗体的制备：（4）血清抗体和单克隆抗体区别：二、单克隆抗体及其应用2.单克隆抗体的应用：①作为诊断试剂。如：a.用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成“早早孕诊断试剂盒”。b.利用__________________的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。同位素或荧光标记②可以运载药物。ADC——“生物导弹”，优点是位置准确、疗效高、副作用小

抗体—药物偶联物(ADC)：通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。③单克隆抗体自身也可用于治疗疾病细胞凋亡ADC的作用机制示意图①ADC被细胞吞噬（胞吞）②⑤ADC抗体药物接头ADC组成：单克隆抗体+接头+药物（如细胞毒素）二、单克隆抗体及其应用注意：图片中ADC中谁是药物，谁是抗体2.单克隆抗体的应用：➊ADC的抗体和药物各具有什么作用？ADC的抗体和药物具有的作用分别是将药物定向运到靶细胞、治疗。➋除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？放射性同位素和化学药物等。➌ADC在临床应用上的作用机理是什么？其作用机理是通过单克隆抗体的靶向作用特异性地识别肿瘤细胞表面抗原，然后利用细胞本身具备的内吞作用使化学药物进入肿瘤细胞体内发生药力，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。二、单克隆抗体及其应用2.单克隆抗体的应用：[模型新命题点思考]为研制抗病毒A的单克隆抗体，某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。回答下列问题：(1)上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A，该处理的目的是______________________________________________________。(2)写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤：_________________________________________________________________________________________________________________。诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞取小鼠甲的脾脏用机械法或用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞，加入培养液制成单细胞悬液(3)为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞，需要进行筛选。图中筛选1所采用的培养基属于________________，使用该培养基进行细胞培养的结果是_______________________。图中筛选2含多次筛选，筛选所依据的基本原理是________________________________。选择培养基只有杂交瘤细胞能够生存抗原与抗体的反应具有特异性(4)若要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖，可采用的方法有______________________________________________________________________________(答出2点即可)。

将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖；将杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养√考向单克隆抗体的制备及应用1．(2024·北京朝阳区高三检测)人绒毛膜促性腺激素(HCG)是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，制备抗HCG单克隆抗体可用于早孕的诊断。下面是抗HCG单克隆抗体制备流程示意图。有关分析错误的是(

)A．体外培养单个B淋巴细胞也可以获得大量抗HCG的抗体B．过程③培养后的细胞均能产生特定抗体C．图中细胞集落a可用于大规模培养，生产抗HCG单克隆抗体D．图中能产生单克隆抗体的细胞在培养过程中不会出现接触抑制的现象√2．(2024·湖北部分高中联考)一种杂交瘤细胞只能产生一种抗体，抗体由两条相同的重链和两条相同的轻链构成。科研人员通过动物细胞融合技术将两种不同的杂交瘤细胞(A和B)融合形成双杂交瘤细胞AB，双杂交瘤细胞能够悬浮在液体培养基中生长繁殖，产生的双特异性抗体AB如下图所示。下列叙述正确的是(

)

A．用抗原α和β处理杂交瘤细胞A、B后再诱导二者融合B．诱导杂交瘤细胞A、B融合后无需筛选即可获得双杂交瘤细胞ABC．对培养到一定密度的双杂交瘤细胞进行传代培养时，需使用胰蛋白酶处理D．若双特异性抗体应用于肿瘤治疗，则α、β抗原中至少有一种为癌细胞表面抗原1．制备的单克隆抗体在临床上不能直接用于人体，还需要对抗体进行人源化，即对鼠源单克隆抗体进行改造，使其大部分氨基酸序列为人源序列所替代，该过程的意义是_______________________________。提示鼠源单克隆抗体对人而言可能是异种抗原，经人源化后能保留抗体的特异性，降低其异源性2.请根据以下信息，设计一方法(不考虑机械方法)，从培养液中筛选出杂交瘤细胞，并写出其依据的原理。已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。小鼠骨髓瘤细胞中尽管只有D途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加入聚乙二醇促融，获得杂种细胞。提示可向培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞因为加入氨基嘌呤后，使D合成途径阻断，仅有D合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人的淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖。3．dMAb技术是一种通过DNA编码产生单克隆抗体的技术，比传统的单克隆抗体制备方法有更多的发展潜力。下图是dMAb技术在埃博拉病毒感染疾病的临床研究中的操作流程。与传统利用杂交瘤细胞产生单克隆抗体的技术相比，dMAb技术在抗体的制备上有何优势？(请列举两点)提示①dMAb技术抗体的产生在生物体内进行，不需要进行细胞体外培养；②产生抗体的细胞种类不局限于免疫细胞(浆细胞)；③抗体直接由DNA编码产生，省去抗原刺激免疫细胞、细胞融合和筛选的步骤。动物体细胞核移植技术和克隆动物分娩一、动物细胞核移植技术一、动物细胞核移植技术1.概念：将动物的一个细胞的细胞核，移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。

①供体：动物一个细胞的

。

②受体：去掉核的

。

③结果：重新组合的细胞发育成

，继而发育成动物个体。④原理：

。细胞核卵母细胞新胚胎动物体细胞核具有全能性2.生殖方式：无性生殖不能丰富生物的多样性，不能促使生物进化,不遵循孟德尔遗传定律。一、动物细胞核移植技术3.类型：胚胎细胞核移植和体细胞核移植

种类难易程度原因胚胎细胞核移植体细胞核移植较容易较难分化程度低，全能性易表现分化程度高，全能性难表现动物体细胞核移植中，非人灵长类动物的体细胞核移植非常困难的原因：

①供体的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其分化前的功能状态，这导致了胚胎发育率低。

②非人灵长类动物胚胎进行操作的技术尚不完善。重构胚早期胚胎采集牛卵巢中的卵母细胞,在体外培养到MⅡ期去核的(次级)卵母细胞供体细胞培养高产奶牛（供体）通过显微操作法去核从供体身体某一部位上取体细胞将供体细胞注入去核的卵母细胞通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程将胚胎移入受体(代孕)母牛体内生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛①减数分裂II中期（MII)卵母细胞的“核”其实是纺锤体-染色体复合物。4.过程：重构胚早期胚胎采集牛卵巢中的卵母细胞,在体外培养到MⅡ期去核的(次级)卵母细胞供体细胞培养高产奶牛（供体）通过显微操作法去核从供体身体某一部位上取体细胞将供体细胞注入去核的卵母细胞通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程将胚胎移入受体(代孕)母牛体内生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛②受体细胞选用MⅡ次级卵母细胞的原因：a.其细胞质中含有激发细胞核全能性表达的物质；b.卵母细胞体积大，易操作；c.卵母细胞营养物质丰富。重构胚早期胚胎采集牛卵巢中的卵母细胞,在体外培养到MⅡ期去核的(次级)卵母细胞供体细胞培养高产奶牛（供体）通过显微操作法去核从供体身体某一部位上取体细胞将供体细胞注入去核的卵母细胞通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程将胚胎移入受体(代孕)母牛体内生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛③卵母细胞“去核”的原因：保证克隆动物的核遗传物质全部来自具有优良性状的供体细胞。重构胚早期胚胎采集牛卵巢中的卵母细胞,在体外培养到MⅡ期去核的(次级)卵母细胞供体细胞培养高产奶牛（供体）通过显微操作法去核从供体身体某一部位上取体细胞将供体细胞注入去核的卵母细胞通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程将胚胎移入受体(代孕)母牛体内生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛④卵母细胞“去核”的方法：目前动物细胞核移植技术中普遍使用的去核方法是显微操作。也有人采用梯度离心、紫外线短时间照射和化学物质处理等方法。这些方法是在没有穿透卵母细胞透明带的情况下去核或使其中的DNA变性。

*去核时，由于MⅡ期卵母细胞核的位置靠近第一极体,故用微型吸管一般会将核和第一极体一并吸出重构胚早期胚胎采集牛卵巢中的卵母细胞,在体外培养到MⅡ期去核的(次级)卵母细胞供体细胞培养高产奶牛（供体）通过显微操作法去核从供体身体某一部位上取体细胞将供体细胞注入去核的卵母细胞通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程将胚胎移入受体(代孕)母牛体内生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛⑤供体——提供细胞核的个体的条件：

a.选择有重要利用价值的动物的体细胞。b.一般选用传代10代以内的细胞，保证正常二倍体核型。重构胚早期胚胎采集牛卵巢中的卵母细胞,在体外培养到MⅡ期去核的(次级)卵母细胞供体细胞培养高产奶牛（供体）通过显微操作法去核从供体身体某一部位上取体细胞将供体细胞注入去核的卵母细胞通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程将胚胎移入受体(代孕)母牛体内生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛

a.对卵母细胞损伤较小；b.保证供体细胞的细胞核不被破坏，操作方便。⑥将整个供体细胞注入卵母细胞中的优点：重构胚早期胚胎采集牛卵巢中的卵母细胞,在体外培养到MⅡ期去核的(次级)卵母细胞供体细胞培养高产奶牛（供体）通过显微操作法去核从供体身体某一部位上取体细胞将供体细胞注入去核的卵母细胞通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程将胚胎移入受体(代孕)母牛体内生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛

⑦激活重构胚的方法及目的是：用物理或化学方法(如电刺激、Ca2+载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂等)激活重构胚胎，使其完成细胞分裂和发育进程。重构胚：是指人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力。重构胚早期胚胎采集牛卵巢中的卵母细胞,在体外培养到MⅡ期去核的(次级)卵母细胞供体细胞培养高产奶牛（供体）通过显微操作法去核从供体身体某一部位上取体细胞将供体细胞注入去核的卵母细胞通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程将胚胎移入受体(代孕)母牛体内生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛

⑧克隆动物的性状与供体不完全相同的原因：a.克隆动物的细胞质遗传物质来自受体卵母细胞的细胞质。b.生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境等因素的影响。克隆动物性别、基因型与供体相同重构胚早期胚胎采集牛卵巢中的卵母细胞,在体外培养到MⅡ期去核的(次级)卵母细胞供体细胞培养高产奶牛（供体）通过显微操作法

去核从供体身体某一部位上取体细胞将供体细胞注入去核的卵母细胞通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程将胚胎移入受体(代孕)母牛体内生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛动物细胞核移植动物细胞培养动物细胞融合早期胚胎培养胚胎移植一、动物细胞核移植技术5.体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题：（1）应用前景①在畜牧生产中加速家畜遗传改良进程、促进优良畜群繁育a.通过建立转基因体细胞系，再利用体细胞核移植技术培育的转基因克隆动物可以作为生物反应器，生产许多珍贵的医用蛋白；b.在治疗人类疾病时，转基因克隆动物的细胞、组织或器官可以作为异种移植的供体；c.以患者作为供体培育的人核移植胚胎干细胞，经过诱导分化能形成相应的细胞、组织或器官，将它们移植给患者时可以避免免疫排斥反应。②在医药卫生领域：一、动物细胞核移植技术5.体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题：（1）应用前景③在科研领域：a.研究克隆动物可以使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程；b.克隆一批遗传背景相同的动物，可以通过它们之间的对比来分析致病基因；c.克隆特定疾病模型的动物，还能为研究该疾病的致病机制和开发相应的药物提供帮助。④在保护濒危物种方面：该技术有望增加濒危物种的存活数量一、动物细胞核移植技术5.体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题：（2）存在的问题①体细胞核移植技术成功率非常低②核移植的理论研究较为滞后③绝大多数克隆动物存在健康问题，许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷。如异常肥胖、免疫失调等治疗性克隆与iPS细胞治疗病人取核去核卵母细胞重构胚胎各种细胞组织或器官诱导取出体细胞核移植移植成纤维细胞取出转入相关因子iPS细胞各种细胞组织或器官胚胎干细胞取出诱导移植治疗性克隆iPS细胞治疗细胞发生转化1．(2021·湖南选择考)M基因编码的M蛋白在动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验，将外源DNA片段F插入M基因的特定位置，再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得M基因失活的转基因克隆动物A，流程如下图所示。回答下列问题：(1)在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是___________________________，这类酶能将特定部位的两个核苷酸之间的_____________断开。解析：构建基因表达载体时，切割质粒DNA要用到限制酶，限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。限制酶(或限制性内切核酸酶)

磷酸二酯键(2)在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是________________________________________________________________。解析：在进行动物细胞培养的过程中，要定期更换培养液，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。

清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害(3)与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是________________________________________。从早期胚胎中分离获得的胚胎干细胞，在形态上表现为_______________________________________(答出两点即可)，功能上具有_____________________________。解析：体细胞核移植技术由于动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难，故与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低。胚胎