分子生物学6 基因工程课件

分子生物学6

基因工程

分子生物学6

基因工程

（GENETICENGINEERING）分子生物学6

第一节概述分子生物学6

基因工程技术的定义

用人工方法，提取或制备某种细胞的某种基因，在体外把它和一种载体连接构造杂种DNA分子，然后导入受体细胞，让其复制与表达，以改变受体细胞的某些性状或产生人们所需的产物的工程技术。分子生物学6克隆（clone）指来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细胞或动物（常被称为副本或拷贝）。获取大量单一拷贝的过程称为克隆化（cloning）,也称无性繁殖。

细胞克隆、个体克隆、分子克隆

分子生物学6细胞克隆（cellclone）

细胞克隆（clone）:由一个细胞经无性繁殖而形成的细胞群体。

分子生物学6个体克隆（Organismcloning

）

个体克隆（Organismcloning）：即是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组之后代的过程。克隆在园艺学上是指通过营养生殖产生的单一植株的后代。很多植物都是通过克隆这样的无性生殖方式从单一植株获得大量的子代个体。

克隆一个生物体意味着创造一个与原先的生物体具有完全一样的遗传信息的新生物体。目前，现代生物学背景下，这通常包括了体细胞核移植。分子生物学6

分子克隆(molecularcloning)

分子克隆（molecularcloning）:指建立单一的重组DNA的无性系的过程。即指在体外制备DNA，切割拼接成重组DNA，通过载体导入受体细胞，使重组DNA在受体细胞中扩增复制，形成单一DNA分子大量拷贝的过程。意指由一个祖先分子复制生成的和祖先分子完全相同的分子群体。分子生物学6

克隆技术的应用前景

1.改良动物品种2.挽救濒临灭绝的物种3.培植人体皮肤4.研制名贵药品5.培育人体器官

分子生物学6

第二节工具酶

分子克隆技术中，DNA的切割、重组、修饰及合成都涉及一系列酶促反应，催化这些反应的酶是进行DNA操作的基本工具，故称为工具酶。分子生物学6

一、限制酶

分子生物学6（一）限制酶的定义

限制酶(restrictionenzyme):一类专门切割DNA的酶。是一类能识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并与其特异结合，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。

“Restrictionendonucleasesarebacteriaenzymewhichcut(hydrolyze)DNAintodefinedandreproduciblefragments.Inbacteriatheyformpartoftherestriction—modificationdefensemechanismagainstforeignDNA.Theyarebasicgenecloningtools.”

分子生物学6

阿尔伯

WemerArber

瑞士生物学家

巴塞尔Biozentrum大学

1929～

内森斯

DanienNathans

美国微生物学家

霍普金斯大学医学院

1931～

史密斯

HamiltonO．Smith

美国微生物学家

霍普金斯大学医学院

1931～

阿尔伯(WemerArber1929～)瑞士生物学家，内森斯(DanienNathans1928～1999)美国微生物学家，史密斯(HamiltonO．Smith1931～)美国微生物学家，由于限制性核酸内切酶的发现及其在分子遗传学中的应用，为遗传工程的产生拉开了序幕而获得1978年诺贝尔生理学或医学奖。（二）限制酶的发现分子生物学6

限制酶

1.防御外源性DNA入侵。

2.构成细菌种属和菌株之间交叉繁殖屏障，但又允许外源DNA有某些遗漏，利于物种进化。

3.基因工程重要的工具酶。（350/400）甲基化酶1.保护自身DNA不受限制酶切割（限制）。

2.影响DNA分子构象，利于基因表达调控。甲基化酶:DAMmethylase(DNAadeninemethylase)isanenzymethataddsamethylgrouptotheadenineofthesequence5'-GATC-3'innewlysynthesizedDNAdcm

-

DNAcytosinemethylase分子生物学6（三）限制酶的分类与命名1.分类（根据酶的组成、所需辅助因子及裂解DNA的方式）：Ⅰ型R.E复合酶：核酸内切酶、甲基化酶（修饰）、ATPase识别序列:特异性识别15bp切割特点:识别位点与切割位点不一致产生片段较大、识别后,要移动100-1000bp切割。Ⅲ型R.EM.W和亚基组成类似Ⅰ类R.E，作用方式同I型。

Ⅱ型R.E

分子内部切割、特异性强、切割序列可知且固定。分子生物学62、限制酶命名的原则（1）以该菌株的属名的第一个字母及种名的头两个字母组成三个斜体字母的略语表示（2）同一种细菌若有不同菌株，则在属名种名后再加上株名（3）若一个菌株中有几种酶时，以罗马字加以区分（4）同一属细菌种名头两个字母完全相同，其中一个菌的酶可改用词头后的另一个字母来代替

分子生物学6

第一个字母该酶来源的细菌属名大写英文字母第二、第三个字母该细菌的种名小写英文字母第四个字母代表株名罗马数字同株、不同酶发现的先后次序属名+种名+株名+序号

（大.斜）(小.斜)(大/小.正)(正)

E-Escherichia

H-Haemophilus（EcoRI）co-coli（HindⅢ）in-influenzaeR-RY13d-RdI-该株首次分离Ⅲ-该株第3次分离

限制酶命名举例：分子生物学6（四）Ⅱ型限制酶的特性1、各种限制酶具有专一的识别与切割序列：Sau3AI

EcoRI

PstⅠSmaⅠ5′GATCGAATTCCTGCAGCCCGGG3′3′CTAGCTTAAGGACGTCGGGCCC5′

分子生物学6Sau3AI

EcoRI

PstⅠHgaⅠ5′GATCGAATTCCTGCAGGACGC3′3′CTAGCTTAAGGACGTCCTGCG5′

2、识别碱基对数目一般为：

4～6碱基对，少数识别序列为8个或8个以上碱基对。

分子生物学63、识别序列大多为二重对称：

具有回文结构（palindrom）。Sau3AI

EcoRI

PstⅠSmaⅠ5′GATCGAATTCCTGCAGCCCGGG3′3′CTAGCTTAAGGACGTCGGGCCC5′

分子生物学64、多数限制酶的切割位点就在识别位点内，但少数限制酶的切割位点不在识别位点内，而在识别位点的旁侧。如HgaⅠ的识别位点是GACGC（5/10），切割位点在两条DNA链上分别在距识别位点5个和10个核苷酸处。Sau3AI

EcoRI

PstⅠHgaⅠ5′GATCGAATTCCTGCAGGACGC3′3′CTAGCTTAAGGACGTCCTGCG5′

分子生物学65、有的识别序列中存在简并序列（有的核苷酸位点可以不同）。

简并序列：GTYRACY=C/TR=G/AYR=CG/CA/TG/TA∴

HindⅡ可识别4个特定序列

分子生物学66、限制酶的切割方式有两种：(1)识别序列内两条链上交错切割，产生单链突出的粘性末端(2)对称处同时切断DNA的两条链，产生平端DNA片段分子生物学67、限制酶的切割产生三种不同末端切割的结果：产生三种不同的末端平末端—bluntend5′突出—5′-protruding（cohesiveend）

3′突出—3′-protruding（overhangtail）切割的化学本质：磷酸二酯键的断裂,形成含5′—P和3′—OH末端的两个DNA片段。对一特定的DNA而言，识别序列碱基对少的，则切点数多，产生的片段小。分子生物学6分子生物学6

8、同功异源酶（isoschizomers）

同裂酶(isoschizomer)：又称异源同工酶，是指来源不同，但能识别和切割同一位点，切割DNA后产生相同末端的一类限制酶。例如：HhaⅠ和CtoⅠ的识别序列和切点都是相同的。5′－GCGC－3′3′－CGCG－5′

分子生物学69、同尾（裂）酶

有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同类型的粘性末端。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA分子生物学610、限制酶易失活，需注意酶活力的保存。分子生物学6二、DNA连接酶

DNA连接酶（DNALigase）

T4DNA连接酶

催化一双链DNA3’-OH端与另一双链DNA的5’端磷酸根形成3’，5’-磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的DNA末端连接起来。

分子生物学6

T4DNA连接酶（T4DNALigase）

分子生物学6

三、DNA聚合酶分子生物学6

1.依赖DNA的DNA聚合酶(DNAPolymerase)

以单链DNA（SSDNA）为模板合成DNA的酶

E·ColiDNA聚合酶Ⅰ

Klenow片段

T7噬菌体DNA聚合酶

T4噬菌体DNA聚合酶耐热DNA聚合酶分子生物学6

（1）E·ColiDNA聚合酶Ⅰ

一条多肽链组成,MW:109kDa,含Zn2+

三种活性:5′3′DNA聚合酶5′3′核酸外切酶3′5′核酸外切酶

用途：

1、切口平移标记DNA探针2、对DNA的3′尾进行末端标记3、合成cDNA第二链分子生物学6

（2）Klenow片段枯草杆菌蛋白酶裂解E.Coli

聚合酶I产生两个片段，大片段的分子量76kD，又称Klenow片段。两种活性：5′3′DNA聚合酶3′5′外切酶活性

用途：1.填平5′突出的粘端（补平3’端），

3′————5′3′—————5′5′——3′5′——---------3′

2．3’末端标记（填平）3．合成cDNA第二链4.DNA序列分析分子生物学6

(3)耐热DNA聚合酶：在PCR反应中，DNA聚合酶是最关键的因素之一。PCR发明的初期使用的DNA聚合酶是Klenow片段、T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶，它们因对热的稳定性差而未得到广泛应用。直到耐热的DNA聚合酶(TaqDNApolymerase)应用于PCR反应，才使这一技术得到迅速发展和广泛应用。

分子生物学61）TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶在75-80℃具有最高的聚合酶活性。75-80℃每个酶分子每秒可延伸约150个核苷酸，70℃时延伸速度在60个核苷酸/秒以上。55℃时为22个核苷酸/秒；37℃和22℃时分别为1.5个和0.25个核苷酸/秒。温度超过80℃时，合成速度明显下降，可能与引物和模板结合稳定性遭到破坏有关。分子生物学6TaqDNA聚合酶没有3′→5′外切酶活性。没有校正功能的。TaqDNA聚合酶具有类似未端转移酶的功能，能催化dNTP加到DNA的3′-OH端。分子生物学62）TthDNA聚合酶在950C半衰期为20分钟，具有逆转录酶活性，可简化RT-PCR。但不具35外切酶活性，没有校对功能，催化聚合反应的错误掺入率为1/500分子生物学63）VentDNA聚合酶该酶在1000C时半衰期达95分钟，97.50C时半衰期长达130分钟，其扩增产物的长度可达10-13kb。VentDNA聚合酶具有35外切酶活性，具有校对功能，错误掺入率为1/31000，忠实性比TaqDNA聚合酶提高510倍。分子生物学64）PfuDNA聚合酶此酶耐热性极好，在97.50C半衰期大于3小时，具有35外切酶活性，催化DNA合成的忠实性比TaqDNA聚合酶高12倍。分子生物学6

2、依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）逆转录酶（ReverseTranscriptase）依赖于RNA的DNA聚合酶，以RNA为模板合成DNA，合成方向为5’3’，无3’5’核酸外切酶的活性。还兼有RNaseH活性，可使DNA：RNA杂合体中的mRNA水解。商品化产品：

AML—

鸟类成髓细胞白血病病毒颗粒中的RTase纯化而得。★

MML—Moloney小鼠白血病病毒颗粒制备而得

rMML—基因工程制品。分子生物学63、不依赖模板的DNA聚合酶末端转移酶（末端脱氧核苷酰转移酶）（terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT）

功能：在M2+

离子存在下，将脱氧核苷酸（dNTP）加到DNA的3’-OH上

用途：主要用于探针标记,用于在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接。分子生物学6

末端转移酶的催化活性分子生物学6四、其他DNA修饰酶分子生物学6（一）碱性磷酸酶碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）

功能：能除去DNA或RNA5’-端的磷酸基团

用途：制备载体时，用该酶处理后，可防止载体自身环化，提高重组效率。

分子生物学6

外源基因克隆入

质粒载体的过程分子生物学6（二）T4多核苷酸激酶催化两种反应：

正向反应：将ATP的γ-磷酸直接转移到去磷酸化的DNA5-OH末端，这种反应被称为正向反应。

交换反应：在过量ATP存在下，T4多核苷酸激酶将磷酸化DNA的5端磷酸转移给ADP,然后DNA从γ-P32_ATP中获得放射性同位素标记的γ-磷酸而重新磷酸化。可标记DNA的5-末端，可使缺失5-P末端的DNA发生磷酸化作用。分子生物学6T4多核苷酸激酶的活性分子生物学6T4多核苷酸激酶的交换活性分子生物学6

第三节载体（Vector）

一、定义：携带目的基因片段进入受体细胞的DNA一个理想的载体应具备以下几个条件：（1）具有自主复制能力，以保证重组DNA分子在受体细胞内得到扩增。（2）分子量小，小分子的DNA制备时不易损伤，小分子DNA限制酶的切点少。（3）有较多的拷贝数，便于分离提纯。（4）有一个或多个筛选标记，能给寄主（受体）细胞提供可选择的标记：如抗药性，营养缺陷型或显色表型等，以利于筛选。

（5）具有多克隆位点，便于目的基因片段与载体连接。(6)具有较高的遗传稳定性。分子生物学6

二、载体的分类

功能分类：克隆载体表达载体组成元件的来源分类:

质粒（plasmid）载体噬菌体载体：如λ噬菌体载体、M13噬菌体载体杂合载体(如粘粒cosmid)病毒性载体：逆转录病毒载体、腺病毒载体等人工染色体载体分子生物学6三、克隆载体（cloningvector）（一）克隆载体的功能：用来克隆和扩增DNA片段（目的基因）的载体具备条件：（a）必须是一个复制子，能在受体细胞中复制。复制起点Ori

复制区复制终点term（b）带有抗药性基因

Tetr：编码膜蛋白，阻止Tet进入细胞

Ampr：β-内酰胺环水解酶。

Kanr：

Kan～P,neo～pCamr：氯霉素乙酰基转移酶

分子生物学6

（C）具有多克隆位点（multiplecloningsits，MCS）载体上含有的一个人工合成的DNA片段，其上含有数个单一酶切位点，是外源DNA的插入部位具备条件：是载体中的一段碱基序列，由数个酶切位点组成。这些位点在载体上都是单一位点（d）可导入受体细胞分子生物学6（二）常用克隆载体1、质粒载体概念

质粒（plasmid）是独立于许多细菌及某些真核细胞染色体外共价闭合环状的DNA分子（covalantclosedcircular,cccDNA），能独立复制的最小遗传单位。

分子生物学6特点：分子量小、宿主内均稳定存在、有较高拷贝数。

>1个的遗传标志，便于选择，如antibiotics+lacZ。

含MCS，便于外源基因的插入。

克隆容量

<10kb，主要用于亚克隆片段。

〈例〉pBR322（4.3kb、MCS位于ampr

和tetr基因中间）

pUC系列（2.6kb、来源于pBR322的ampr、Ori、LacZ片段，MCS位于LacZ片段中间）分子生物学61.pBR322质粒有两个抗药性基因，每个抗性基因中均含有单克隆位点，外源DNA插入后使相应的抗性基因失活，宿主细胞失去相应的抗药性，不能在含相应抗生素的培养基中生长，这一现象称为插入失活。分子生物学6质粒pBR322的抗性基因筛选示意图分子生物学62.pUC18/19质粒

有一个抗性基因，可用来筛选转化子。有一个lacZ基因片段，编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个片段（α）片段，某些改造的宿主细胞可表达β-半乳糖苷酶的羧基端片段，质粒和宿主细胞共表达时才具有β-半乳糖苷酶的活性，可使生色底物X-gal降解产生兰色的化合物，这种现象称α-互补。分子生物学6pUC18/19质粒的特点①具有更小的分子量和更高的拷贝数，500700个/细胞。②lacZ基因赋予质粒组织化学染色特性，便于检测重组体。③具有多克隆位点，便于外源基因插入。分子生物学6质粒pBR322质粒pUC分子生物学63.穿梭质粒具有两种不同复制起始点和选择记号，可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒。例如：大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒；大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒等。重组DNA的操作在大肠杆菌中进行，然后转入分支杆菌和酵母中表达。分子生物学6

2、噬菌体1．

λ噬菌体（λbacteriophage，phage)2．

M13噬菌体（M13phage）分子生物学6

1．

λ噬菌体（λbacteriophage，phage）

(1)生活周期：分为lytic和lysogenic期基因组结构：野生型为双链线性分子，在宿主细胞中成环状。左侧（包装）、中间（非必须、整合/切离、重组）、右侧（裂解、调控）分子生物学6λ噬菌体的粘性末端及其环化分子生物学6(2)λ噬菌体的包装75%或105%长度的DNA《基因组的包装》可以包装中间的非必须区可插入9-23kbp的外源DNA（replacementvector）左右臂连接的片段过小不能包装（选择标志）

分子生物学6(3)λ噬菌体改造的载体由

λ噬菌体改造的载体已有100多种分为两类：插入型载体，如λgt系列置换型载体，如EMBL和Charon系列分子生物学6

2．

M13噬菌体（M13phage）

大肠杆菌纤维状噬菌体，基因组DNA为全长6.5kb的闭环ssDNA，感染细菌后呈复制型dsDNA（RFDNA）。

载体特点：

a.允许包装大于病毒单位长度的外源DNA，一般DNA测序的插入片段<1kb；b.感染细菌后，复制环状ssDNA，经包装形成噬菌体颗粒，分泌到细胞外而不溶菌。

c.分离ssDNA容易。如含有插入DNA，可用于测序、制备杂交探针、定点突变研究。

分子生物学6

3、杂合载体—粘粒粘粒（cosmid）

由λ噬菌体的cos区与质粒DNA构建而成

特点：含质粒的ampr

或tetr、Ori成分，可在大肠杆菌中复制含噬菌体的cos区，可在体外进行包装含1个或多个酶切位点本身分子量小（6.5kb左右），可容纳40kb的DNA片段非重组体太小不能包装，只包装重组体，便于筛选

分子生物学6

4、人工染色体人工染色体(artificialchromosome):指人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统。天然染色体基本功能单位包括复制起始点(replicationorigin)、着丝粒(centromere)和端粒(telomere)。复制起始点，保证了染色体复制，着丝粒保证了染色体分离，端粒封闭了染色体末端，防止粘附到其他断裂端，保证了染色体的稳定存在。人工染色体为基因组图谱制作、基因分离以及基因组序列分析提供了有用的工具。分子生物学6

酵母人工染色体YAC(酵母人工染色体,yeastartificialchromosome)是在酵母细胞中用于克隆外源DNA大片段的克隆载体。可接受100-2000kb的外源DNA的插入,是人类基因组计划中物理图谱绘制采用的主要载体分子生物学6

酵母人工染色体优点可以容纳更长的DNA片段，用较少的克隆就可以包含特定的基因组全部序列，从而保持了基因组特定序列的完整性，有利于物理图谱的制作。缺点（1）克隆外源基因易出现嵌合体。（2）有些克隆不稳定。（3）YAC克隆不容易与酵母自身染色体相分离。分子生物学6

细菌人工染色体BAC(细菌人工染色体,bacterialartificialchromosome)是以细菌F因子为基础构建的克隆载体,可接受300kb的外源DNA的插入,是人类基因组计划中基因序列分析采用的主要载体特点：

拷贝数低，稳定，比YAC易分离。

分子生物学6

哺乳动物人工染色体MAC(哺乳动物人工染色体,mammalianartificialchromosome)：类似于YAC的MAC尚在研究之中，它含有哺乳动物染色体基本功能单位。如果研究成功，可能成为很好的基因治疗载体和转基因动物载体。

分子生物学6

哺乳动物人工染色体上述载体主要为克隆载体，用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点诱变。应用领域（1）有丝分裂和减数分裂对DNA片段大小的定量分析。（2）研究哺乳动物细胞中染色体功能。（3）对复杂的基因做功能分析。（4）用于体细胞基因治疗。分子生物学6二、表达载体（expressingvector）（一）表达载体的功能：在受体细胞中表达外源基因的载体

结构：克隆载体+表达构件—原核生物表达真核生物表达

ori

ampr基础上加转录和翻译相关elementMCS

（二）原核（大肠杆菌）表达载体表达载体=克隆载体+表达元件“启动子—核糖体结合位点—克隆位点—转录终止信号”

“P—RBS—MCS—term”分子生物学6原核表达载体结构示意图用T7表达系统质粒的基本结构元件分子生物学6（三）原核表达载体的表达构件

①启动子（promoter）

trp-lac启动子（tac）：杂合启动子，由trp启动子加lac操纵子中的操纵基因和SD序列融合而成。如：tacI：由Trp的－35

区、人工合成的46bp片段（含TATAbox）和

LacO区融合而成

tac12：由Trp的－35区、Lac的-10区、Lac的O区、SD序列融合而成（在lac阻遏蛋白高水平表达的lacIq大肠杆菌菌株中，其转录可被抑制，加入异丙基硫代糖苷（IPTG）可诱导表达）

宿主菌：RB791/XL-1-blue/SB221/JM109诱导表达：Lactose或IPTG分子生物学6

T7噬菌体启动子

表达效率高，需要特殊的受体菌。

宿主菌：如BL21（DE3），Jm109（DE3）带有lacUV5启动子控制下的T7噬菌体RNA聚合酶基因，为溶原菌，可用IPTG诱导表达。

λ噬菌体PL和PR启动子（温度敏感启动子）

该启动子受控于温度敏感的阻抑物cIts857.

温度诱导：

cIts857在37℃时，

阻抑转录42℃时，

去阻遏，激活转录

宿主菌：E·coliM5219(被缺陷型溶原λBPф感染后，含有阻抑物cIts857的编码基因)

PBV220/221（我国构建）

分子生物学6②核糖体结合位点（ribosome-bindingsite，RBS）

RBS包括SD序列和AUG起密码子（或单指SD序列）

③转录终止序列（terminationsequence）

多数表达载体含终止子序列，从几十到800碱基对的长度。分子生物学6（四）真核表达载体的表达构件（1）真核表达载体的基本转录元件原核序列（克隆用）+真核序列（表达用）

复制子

真核抗药基因+真核表达组件

抗药基因（或真核复制起始点）

Promoter/Enhance+CloningSite+Terminater+PolyA-addingSignal①启动子（promoter）和增强子（enhancer）

必须用真核启动子和增强子，但活性差异较大。常用病毒的元件，如SV40病毒早期基因增强子、Rouse肉瘤病毒（RSV）的LTR、人类巨细胞病毒（CMV）等

分子生物学6②转录终止和加尾信号真核细胞中转录后，准确地加poly（A）尾依赖于：

poly（A）加尾信号–AAUAAApoly（A）位点及其下游的GU-rich区或U-rich区

真核表达载体必须含有上两部分，以弥补内源性序列本身的不足。常用SV40的加poly(A)信号：237bp的BamHI-BclI酶切位点片段，同时含有早期和晚期转录单位的切割和加polyA信号，两套信号作用相反，分别位于不同的DNA链上，对mRNA的加工均有效。

分子生物学6

哺乳动物表达载体分子生物学61.表达载体的种类（1）病毒载体整合性载体：外源基因通过这种载体与宿主细胞的染色体整合。如pSV系列载体游离型载体：外源基因与这种载体重组后，以病毒颗粒形式在宿主细胞内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。如痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒等。（2）质粒载体常常是穿梭质粒载体。既含原核的复制位点和筛选标记，又含真核的复制位点、筛选标记和表达构件。分子生物学6

pcDNA3.1质粒物理图谱分子生物学6第四节重组DNA技术的基本过程

重组DNA技术的基本步骤：

①制备目的基因和相关载体②将目的基因和有关载体进行连接③将重组的DNA导入受体细胞④DNA重组体的筛选和鉴定⑤DNA重组体的扩增、表达和其它研究分子生物学6重组DNA技术的应用目的

1.获得足够的DNA片段以分析基因的结构；2.获得基因用于发展农业、林业、畜牧业和医学分子生物学6目的基因指要研究或应用的基因，也就是要克隆和表达的基因。一、目的基因的制备（Isolation）

分子生物学6（一）直接从染色体中分离

如果物理图谱已确定，可用限制酶直接从原核生物，噬菌体及动物病毒基因组切取目的基因。分子生物学6（二）化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列

基因小已报道的合成基因有人生长激素、干扰素、胰岛素、表皮生长因子、白细胞介素II、集落刺激因子等，这些基因均已被克隆，绝大多数已在原核和真核系统中获得表达。分子生物学6（三）用逆转录酶合成cDNA

以mRNA或RNA为模板经RT合成cDNA。然后经过基因克隆，从而获得某种特定的基因。适于高丰度的mRNA。分子生物学6（四）PCR或RT-PCR

根据目的基因的核苷酸序列设计一对引物以基因组DNA为模板经PCR扩增目的基因。以mRNA或RNA为模板经RT-PCR扩增目的基因。分子生物学6三种不同引物引导的RT-PCR示意图分子生物学6

1.从基因组文库（genomiclibrary）筛选目的基因

采用限制酶将基因组DNA切成片段，每一个DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA，然后将所有的重组体都引入宿主细胞并进行扩增，得到的分子克隆的混合体称为“基因组文库”。从基因组文库中通过杂交筛选得到目的基因片段。从细胞中分离基因组DNA、用Sau3A或MboI部分消化、回收大小在一定范围内的片段、构建重组体。（五）从基因组文库和cDNA文库筛选目的基因

分子生物学6组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库：存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合*从基因组DNA文库获取目的基因分子生物学62.从cDNA文库（cDNA文库）筛选目的基因

将不同细胞类型或不同阶段细胞的mRNA逆转录成cDNA后,将所有cDNA混合体与载体进行连接后，将所有的重组体分子都引入宿主细胞并进行扩增，所得到的分子克隆的混合体称为cDNA文库。

分子生物学6mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制*从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAA

TTTT

AAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT分子生物学6二、载体的选择和制备（Digestion）（一）载体的选择（主要考虑以下5个条件）1.有足够容纳目的基因的幅度根据克隆外源DNA片段的大小选择合适的载体2.构建DNA重组体的目的克隆选克隆载体，表达选表达载体3.载体MSC中的酶切位点根据克隆外源DNA的酶切位点选择具有相同酶切位点的载体4.根据受体细胞的类型确定表达载体的类型5.载体克隆位点的阅读框要与目的基因的阅读框匹配

分子生物学6（二）载体制备的方法

获得载体后，用适当的限制酶切割载体DNA分子，获得线形分子。尽量用与消化目的基因时相同的酶

来切割载体，以便获得相同的粘末端，便于连接。1.碱变性法、2.羟基磷灰石柱层析法3.释放法4.酸酚法5.溴乙锭-CsCl2密度梯度离心法分子生物学6三、DNA的体外重组

（一）粘性末端连接：用同一种酶或两种不同酶裂解DNA后，产生相同的粘性末端，很容易按照碱基配对的原则以氢键结合，在T4DNA连接酶的作用下，共价闭合。

连接方式：

定向取代

双向插入（正向/反向）（双酶切）（单酶切）措施：载体酶切后，用AP（碱性磷酸酶）水解5’端的磷酸基团防止载体的自身环化。分子生物学6

同一种限制酶切割DNA产生的粘性末端的连接

G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

GBamHⅠ的识别序列及切割部位G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

GBamHⅠ含目的基因的DNA片段BamHⅠGC

C

T

A

G5'3'5'3'3'5'5'3'5'3'5'3'G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

G

G

A

T

C

C

G目的基因片段混合、退火G

C

C

T

A

G

G

A

T

C

C

G

G

A

T

C

C

GG

C

C

T

A

G质粒载体含目的基因的重组质粒G

C

C

T

A

G

G

A

T

C

C

GDNA连接酶分子生物学6

DNA分子的体外重组过程示意图

外源基因克隆入

质粒载体的过程分子生物学6

双酶切DNA片段粘性末端的连接

G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

GBamHⅠBamHⅠBamHⅠG

C

C

T

A

G5'3'5'3'5'5'5'3'5'3'3'G

A

A

T

T

CC

T

T

A

A

G

A

A

T

T

C

G目的基因片段混合、退火G

C

T

T

A

A

G

A

T

C

C

G

A

A

T

T

C

GG

C

C

T

A

G重组质粒DNA连接酶EcoRIEco

RI5'

G

A

T

C

C

G

G

C

T

T

A

A

A

A

T

T

C

G

G

C

C

T

A

G

G

A

T

C

C

G

G

C

T

T

A

AEcoRI

GATCC

G

G

CCTAG3'5'载体分子生物学6（二）平端连接

不同方式产生的平端DNA片段可以在T4DNA连接酶的作用下，与某些限制酶产生的平端载体相连接。在连接时，所用的ATP及T4DNA连接酶的浓度要比连接粘末端的高些。分子生物学61.利用人工接头（linker）连接：

接头：指化学合成的一段由1012个核苷酸组成的具有一个或数个限制酶识别位点的平末端双链寡核苷酸短片段。分子生物学6连接物分子连接平末端的DNA片段示意图

5'3'3'5'G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

G3'5'5'3'BamHⅠ接头多核苷酸激酶连接酶5'3'G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

G3'5'G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

GBamHⅠ切割G

C

C

T

A

G5'3'

G

A

T

C

C

G5'3'BamHⅠ切割的质粒载体5'3'5'3'G

C

C

T

A

G

G

A

T

C

C

GG

C

C

T

A

G

G

A

T

C

C

G

G

A

T

C

C

GG

C

C

T

A

G重组质粒目的基因分子生物学62.加衔接头连接衔接头：人工合成的一段DNA片段，一端为平端，另一端为某种限制酶粘性末端。当衔接头与外源DNA分子连接后便形成了带有粘性末端的新的DNA分子，可与经同样限制酶切割的载体分子互补连接。如：

AATTCGAGTCTTACGGCAGCTCAGAATGCCGT分子生物学63.加入同聚体尾（homopolymerictail）连接

TdT：末端转移酶，可将某种单一脱氧核苷酸逐一加到3’-OH上去。底物：3’粘性突出末端

分子生物学6四、外源DNA导入受体细胞受体细胞应具备下列条件:1.安全宿主菌（或宿主细胞）在人肠道几无存活或存活率极低2.限制酶缺陷型，外源DNA进入受体菌不被降解3.重组缺陷型，保证外源DNA不与细菌基因组DNA重组，独立存在4.能发展成感受态细胞的菌株感受态：是受体菌能接受外源DNA能力的一种生理状态感受态细胞：指经过一定方法处理后具备接受外源DNA能力的细胞分子生物学6（一）转化（transformation）

定义：

将质粒或其它外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。过程：细胞—低温CaCl2处理—感受态细胞—加重组DNA—42℃热休克—重组体吸入细胞—复苏—涂板（含抗生素）—筛选转化菌落。其它方法：电转化、PEG法等。

分子生物学6

重组DNA转化过程示意图分子生物学6

（二）感染（fection）

以噬菌体、粘粒和真核病毒为载体的重组DNA分子，体外经包装成为具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染相应的细胞，并在其中扩增。此过程又叫转导（transduction）。

感染效率》转化效率

分子生物学6（三）转染（transfection）

真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。进入细胞的DNA可以整合到宿主基因组中，也可游离于染色体外存在和表达。

分子生物学6五、重组细菌和细胞的筛选

根据重组子的表型和结构特征进行筛选1、根据重组子表型进行筛选（1）抗生素筛选：所有的克隆载体均带有可供选择的遗传学标志或特征，如某种抗生素的抗性基因，为选择提供方便。（2）

营养缺陷型的互补筛选插入互补插入失活分子生物学6组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救分子生物学6(插入失活法)抗药性标记选择分子生物学6插入失活示意图

分子生物学6

a–互补（a-

complementation）

某些质粒（如PUC系列），含有大肠杆菌的lacZ基因片段，在该基因区又有MCS，这些质粒将导入lacZ-

的宿主菌中表达。

如果无外源基因插入：则质粒lacZ基因正常表达和宿主菌的lacZ基因互补，产生有活性的β–半乳糖苷酶，经IPTG诱导后，分解X-gal底物，产生blueclony。

如果有外源基因插入：则质粒编码的lacZ基因失活、菌体不可能互补产生β–半乳糖苷酶，产生whiteclony。分子生物学6

α互补的检测分子生物学6

（1）酶切鉴定

挑选单个菌落—扩大培养—小量快速提取质粒—酶切（根据插入片段上的酶切位点选定）—分析有无插入片段、插入片段大小及数量、插入方向等。

2、根据重组子结构特征筛选分子生物学6（2）核酸杂交法—菌落原位杂交

从基因组文库、cDNA文库或重组质粒中筛选目的基因的最有效的方法之一，它与目的基因的表达与否无关。分子生物学6原位杂交

分子生物学6（3）PCR筛选法

针对插入重组体中的目的基因，设计一对引物，进行菌落PCR，如能扩增出条带，则为阳性克隆。分子生物学6

（4）DNA序列测定目的DNA片段的序列必须用DNA测序法加以证实。

基因工程的基本过程

分子生物学6第五节克隆基因的表达一、表达系统分类按克隆基因与受体细胞不同组合分为4类1.原核基因在原核细胞中表达，例基因工程生产各类工具酶2.原核基因在真核细胞中表达，如β-gal在昆虫细胞中表达3.真核基因在原核细胞表达，如IL-2,INF-γ等4.真核基因在真核细胞表达，如人β-干扰素和α-干扰素在昆虫细胞中表达，α-干扰素在小鼠细胞表达按受体细胞表达类型分2类1、原核细胞表达系统（大肠杆菌、枯草杆菌等）2、真核细胞表达系统（酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞）分子生物学6二、克隆基因在大肠杆菌中的表达（一）真核基因与原核基因的差别1、真核基因较大，有内含子，原核生物无剪接内含子的功能2、缺乏E.coliRNA聚合酶识别的启动子3、无SD序列，不能与E.coli核糖体小亚基16srRNA结合，不能翻译4、真核蛋白易被E.coli蛋白酶水解分子生物学6（二）构建策略：

一）目的基因：表达真核基因必须克隆cDNA片段,表达分泌蛋白必须去除真核信号肽序列,ATG的5’端非编码区必须去除二）载体选择：必须是大肠杆菌的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。商用载体已含P和SD序列，无须构建。

启动子的条件：转录效率高和可调控

PL、tac、T7启动子能满足上述要求分子生物学6三）目的基因和载体的连接

1.产生非融合蛋白时目的基因与载体的连接方式：例如pRSET载体的SD序列3

端下游适当位置构建的NdeI(CATATG)位点，此ATG可作为起始密码子。目的DNA片段5

端引入NdeI（CATATG）酶切位点，利用其中的ATG作为起始密码子。分子生物学