1.2.2《微生物的选择培养和计数》课件高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

第1章

发酵工程第2节

微生物的选择培养与计数目标010203通过对土壤中分解尿素的细菌进行分离和计数，理解并掌握微生物计数的方法。（科学探究）通过实例，理解各类微生物都能适应其生活环境。（生命观念）根据微生物的代谢类型，配制选择培养基，总结分离微生物的过程和测定微生物数量的常用方法。（科学思维）温故知新：酵母菌的纯培养酵母菌的纯培养2.接种和分离酵母菌1.制备培养基3.培养酵母菌①配制培养基（马铃薯、葡萄糖、琼脂、水）②灭菌③倒平板（在酒精灯火焰附近操作）培养基：湿热灭菌（高压蒸汽灭菌锅）培养皿：干热灭菌（干热灭菌锅）用接种环在固体培养基上用平板划线法接种平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱培养情境问题自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，某研究小组想在土壤样品中分离得到能分解尿素的细菌，但是土壤中还有许多其他微生物，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现，该怎么办呢？1.2.2微生物的选择培养和计数本节聚焦怎样运用生物与环境相适应的观点来理解选择培养的原理？如何通过调整培养基的配方来有目的地培养某种微生物？测定微生物数量的常用方法有哪些？科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。1973年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。美国黄石公园筛选原因：思考1：水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存耐高温的酶耐高温生物体高温环境（热泉、火山口）寻找寻找筛选思路：为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找耐寒微生物耐热微生物石油分解菌思考2：这对在实验室中选择培养特定的微生物有什么启示？实验室中如何从众多的微生物中筛选出单一菌种？培养基中加青霉素具有青霉素抗性的菌落培养基应有菌落没有青霉素抗性的细菌被淘汰怎样选择出抗青霉素能力的细菌?实例1+氨苄青霉素具有抗氨苄青霉素能力的菌落没有氨苄青霉素抗性的细菌培养基+氨苄青霉素培养基没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌?实例2一选择培养基1.概念：类型条件分离得到的菌种①改变培养条件②添加化学物质③营养缺陷70～80℃的高温水生栖热菌加入青霉素酵母菌、霉菌等真菌高浓度食盐金黄色葡萄球菌不加含碳有机物不加氮源自养型微生物固氮菌允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，叫做选择培养基。2.类型：合作探究1：请同学们自主学习教材P16页，小组合作思考讨论以下问题

讨论1.你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的

细菌分离出来？讨论2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？一选择培养基

尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。尿素的立体结构细菌利用尿素的原因他们能合成脲酶CO(NH2)2+H2O2NH3+CO2

脲酶讨论1：你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？讨论2：该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？

培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。

缺乏脲酶的微生物由于缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。一选择培养基只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g蒸馏水定容到1000ml培养基一KH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g琼脂15.0g蒸馏水定容到1000ml培养基二2.从用途上来讲，培养基二属于

培养基，目的是为了获得

。3.两种培养基共有的培养基成分有：

。培养基一的碳源为

，

氮源为

；培养基二的碳源为

，氮源为

。1.从物理性质来讲，两者属于_____

培养基，判断依据是______________________。固体添加了凝固剂琼脂选择能分解尿素的微生物碳源、氮源、无机盐、水牛肉膏,蛋白胨牛肉膏,蛋白胨葡萄糖尿素练一练牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g蒸馏水定容到1000ml培养基一KH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g琼脂15.0g蒸馏水定容到1000ml培养基二4.是否能根据选择培养基和完全培养基上的菌落数目来证明选择培养基具有筛选作用？能,完全培养基的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数选择培养基具有选择性:基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基。练一练同理：将土壤稀中能分解纤维素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？设计一种选择培养基,用纤维素作为唯一碳源,可以将分解纤维素的细菌分离出来设计一种选择培养基,用石油作为唯一碳源,可以将分解石油的细菌分离出来思考：将土壤中能分解石油的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？一选择培养基情境问题：某研究小组想知道1g土壤样品中有多少能分解尿素的细菌，仅通过选择培养基可以知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌吗？分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物计数：测定分解尿素的细菌的数量二微生物的选择培养

分离方法：稀释涂布平板法问题1：由于土壤细菌的数量庞大，怎么获得要想得到特定微生物的纯培养物呢？微生物的数量测定课本P181.间接计数法——稀释涂布平板法

当样品的稀释度

时，培养基表面生长的一个

，来源于

中的一个

。通过计数平板上的

数，就能推测出样品中大约含有多少

。(1)原理：足够高菌落样品稀释液活菌菌落活菌样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目稀释104倍稀释105倍稀释106倍稀释107倍因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落微生物的数量测定课本P18-191.间接计数法——稀释涂布平板法(2)计数原则:①通常选用_____________的样品液进行稀释，以保证获得菌落数为_________②选择菌落数为

的平板计数。③

稀释度下，应

对

个平板进行重复计数，然后求出______

④统计的菌落往往比活菌的实际数目

。⑤统计结果一般用

表示，而不是用活菌个数表示。30~300同一至少3平均值少菌落数恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键重复实验，保证结果的准确度一定稀释范围30~300微生物的数量测定课本P181.间接计数法——稀释涂布平板法(2)计算公式:M代表稀释倍数C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M每克样品中的菌落数＝平板上平均菌落数稀释液体积(ml)×稀释倍数微生物的数量测定课本P181.间接计数法——稀释涂布平板法每克样品中的菌落数＝平板上平均菌落数稀释液体积(ml)×稀释倍数实例分析1：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？（80+90+100）/30.1×105=9×107个请计算4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为

个1.1×108微生物的数量测定实例分析2：某同学检测土壤中细菌总数时，在10、100、1000倍稀释液的平均菌落数为2760、330、46，如果用于平板涂布的稀释的量都是1ml，则每克样品中的菌落总数为_________实例分析3：微生物的数量测定46000微生物的数量测定课本P182.直接计数法——显微镜直接计数法

利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。血细胞/细菌计数板血细胞计数板：计数相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等细菌计数板：观察和计数细菌等较小的细胞优点：快速、直观缺点：①不能区分死菌和活菌→统计值偏大

②不适于对运动细菌的计数

③个体小的细菌在显微镜下难以观察问题2:为了避免上述缺点，我们该如何做？可以染色（如使用台盼蓝，死细胞会被染成蓝色）后再进行显微镜计数微生物的数量测定2.直接计数法——显微镜直接计数法合作探究2：请同学们自主学习教材P17-18页，观看稀释涂布平板法操作视频，小组合作思考讨论完成问题。

1.实验过程用箭头画流程图。2.培养时要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养为什么？3.实验注意事项有哪些？二微生物的选择培养二微生物的选择培养

分离方法：稀释涂布平板法情境问题：某研究小组想知道1g土壤样品中有多少能分解尿素的细菌，仅通过选择培养基可以知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌吗？分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物计数：测定分解尿素的细菌的数量二微生物的选择培养

分离方法：稀释涂布平板法问题1：由于土壤细菌的数量庞大，怎么获得要想得到特定微生物的纯培养物呢？2、实验的具体操作：（2）土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌（1）制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基1、稀释涂布平板法：是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养二微生物的选择培养（3）样品的稀释将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。1×101mL1mL1mL1mL1mL1mL1×1021×1031×1041×1051×1061×1079mL无菌水90mL无菌水二微生物的选择培养①取0.1mL菌液滴加到培养基表面1×107移液枪②将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中③将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀二微生物的选择培养（4）涂布平板：（5）培养与观察二微生物的选择培养待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d（5）培养与观察二微生物的选择培养问题2:培养时要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在

一起培养为什么？培养未接种的培养基的作用是对照稀释104倍稀释105倍稀释106倍空白对照观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。

培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d

ABC二微生物的选择培养（5）培养与观察防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。3、注意事项：注意事项三注意事项四注意事项一注意事项二将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，在计算时，不要忽略；由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证二微生物的选择培养

本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种方法：在培养基中加入酚红指示剂——鉴别培养基CO(NH2)2+H2O脲酶2NH3+CO2呈碱性，遇酚红指示剂呈红

色。思考进一步探究——分解尿素细菌的进一步鉴定补充(1)原理：

细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。CO(NH2)2+H2O2NH3+CO2

脲酶呈碱性，遇酚红指示剂呈

色。红(2)方法：

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红：①液体培养基可以直接看液体的变色情况；②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带(或变红)。补充鉴别培养基：在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。伊红和亚甲蓝培养基鉴别大肠杆菌课本P30刚果红培养基鉴别纤维素分解菌课本P20

将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红-亚甲蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。测定饮水中大肠杆菌数量的方法：滤膜法到社会中去五、结果分析与评价：内容现象结论有无杂菌污染的判断空白对照的培养基中无菌落生长培养基中菌落数偏高菌落形态多样，菌落数偏高选择培养基的筛选作用牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目多于选择培养基上的数目样品的稀释操作得到2个或2个以上菌落数目在30~300的平板重复组的结果未被杂菌污染被杂菌污染混入其他氮源选择培养基具有筛选作用操作成功若选取同一种土样，统计结果应相近土壤中分解尿素细菌的分离与计数主要方法稀释涂布平板法平板划线法主要步骤接种工具菌体获取能否用于计数共同点稀释涂布平板法和平板划线法的比较系列梯度稀释操作和涂布平板操作接种环在固体培养基表面连续划线涂布器接种环可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板不能计数使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体—菌落二微生物的选择培养最后划线区域挑取稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落微生物的数量测定选择培养基的作用微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法微生物的选择培养和计数选择培养基微生物的选择培养科学实例筛选原则选择培养基的概念及举例稀释涂布平板法的操作过程间接计