中国人肥胖基因大肠杆菌中的表达课件

中国人肥胖基因的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达资料来源：中华内分泌代谢杂志1998年第4期第14卷临床研究作者：周炜缪为民周丙荣王立明陈志辉焦炳华单位：200433第二军医大学微生物学教研室；复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室中国人肥胖基因大肠杆菌中的表达肥胖基因概述及发现肥胖基因(Obesegene)是近几年克隆的一个新基因,该基因产物———瘦蛋白

(leptin)，是由脂肪组织产生并分泌167个氨基酸组成的多肽,分泌蛋白分子量约16kb,是反映体内脂肪组成及体内脂肪含量和调节体重的重要信号因子1783年Lavoisier和Laplace研究表明能量平衡受生理调节。1950年发现了第一个隐性基因突变，命名为肥胖基因(Obesegene），它是一个单基因突变，导致重度肥胖和2型糖尿病，但其研究一直进展甚微。动物试验表明将肥胖鼠和正常鼠血液循环相连，肥胖鼠体重有所下降，提示正常鼠体内有一种因子可控制过度肥胖，而肥胖鼠则因基因突变而使该因子表达减少或作用丧失。经过8年努力，Friedman实验组运用定位克隆(Positionalcloning)技术，分离得到小鼠的肥胖基因并得到人的同源序列，为揭开肥胖症之迷及肥胖症的诊治奠定了基础。瘦素作用于下丘脑，控制代谢、能耗和生殖系统，调节体内脂肪含量。实验表明，重组的瘦素具有使肥胖小鼠代谢和体重正常化，恢复肥胖基因缺陷小鼠生育能力等活性，而无明显的副作用〔4，5〕。中国人肥胖基因大肠杆菌中的表达脂肪组织：取自男性中国人胃切除手术病人的正常大网膜，液氮冻存备用新鲜脂肪组织立即置于液氮冻存。取1克冻存的大网膜脂肪组织，剪成数小块，在总量为10ml的Trizol液中高速匀浆1分钟。将组织匀浆液吸入50ml离心管，于室温下静置5分钟，加入2ml氯仿，剧烈振摇混匀后，室温静置3分钟，然后11000g4℃离心15分钟，将上层无色水相吸入一新管，加入5ml异丙醇，室温孵育10分钟，然后11000g4℃离心10分钟，75%乙醇洗涤RNA沉淀，7500g4℃离心5分钟，稍干燥后用400μl无RNase的双蒸水溶解。（冷冻-离心-保存）RNA抽提中国人肥胖基因大肠杆菌中的表达反转录PCR（PCR扩增）根据已报道的序列设计引物，即将编码成熟肽的第二个密码子CCC转变为大肠杆菌常见密码子CCG:

P1：5’-AACGAATTCATGGTGCCCATCCAAAAAGTCCAA-3’P2：5’-TTTGGATCCTCAGCACCCAGGGCTGCGGTC-3’以提取的RNA与P2引物70℃共同孵育5分钟后置冰浴。第一链cDNA合成反应体系为200uAMV反转录酶，5μl5×缓冲液，1μlRNasin，2μgRNA，四种dNTP(各250μmol/L)。100pmol/LP2引物，总体积25μl,37℃，1小时。取5μlcDNA产物进行PCR扩增，反应体系为5uTaq酶，5μl10×缓冲液，四种dNTP(各250μmol/L)，P1和P2引物各100pmol/L，总体积50μl,94℃5分钟后行PCR扩增，循环条件为94℃变性30秒，60℃复性30秒，72℃延伸1分钟，35循环后72℃延伸10分钟，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。中国人肥胖基因大肠杆菌中的表达肥胖基因的分子克隆及DNA顺序分析

将肥胖基因的RT-PCR产物电泳纯化后行EcoRI和BamHI双酶切，与同样经EcoRI和BamHI双酶切的pUC19质粒载体连接。连接产物转化大肠杆菌TG1感受态细胞，LB培养基培养过夜。以IPTG/X-Gal体系筛选白色菌落，碱法快速抽提质粒，酶切后电泳鉴定重组质粒。用ABI377荧光自动测序仪进行DNA顺序分析。中国人肥胖基因大肠杆菌中的表达肥胖基因的分子克隆及DNA顺序分析用测序载体pUC19顺利地对肥胖基因PCR产物进行了克隆。通过ABI377荧光自动化测序，证明其序列与报道的白种人完全一致。中国人肥胖基因大肠杆菌中的表达肥胖基因的原核表达

用EcoRI和SalI将肥胖基因从pUC19载体上切下，克隆入六聚组氨酸融合表达载体pPROEXHTa

质粒(图1)。pPROEXHTa重组质粒转化大肠杆菌（E.coli）DH5α菌株并经酶切电泳鉴定。接种重组质粒的单菌落于3mlLB中，37℃振摇培养过夜，按1%比例转接至30mlLB中，37℃振摇培养3小时，使OD600约等于0.3～0.4，加入IPTG至终浓度为0.4mol/L，继续培养3小时，离心收集菌体，进行SDS电泳。示意图中国人肥胖基因大肠杆菌中的表达将肥胖基因克隆入pPROEXHTa六聚组氨酸融合表达载体，获得表达的蛋白分子量为17.5Kd，表达量高达20%左右。用所得的瘦蛋白可以进一步研究瘦素作用机制及治疗肥胖症和糖尿病。最后结果中国人肥胖基因大肠杆菌中的表达特别说明在有些研究肥胖基因在大肠杆菌表达中，肥胖基因可在不同大肠杆菌、不同oD600值、不同时间诱导等条件下表达，从而可以研究外源基因在大肠杆菌中的表达量的效率。中国人肥胖基因大肠杆菌中的表达实验中我们曾分别用随机引物和P2引物来进行RNA反转录，结果后者的PCR得率要高得多。测序结果表明运用RT-PCR方法从中国人脂肪组织获得的肥胖基因序列与Friedman实验组报道的白种人完全一致，可见该基因在人种间可能没有差异，属于高度保守序列，在功能上有极其重要的作用。对肥胖基因的原核表达，起初我们将肥胖基因克隆入pBL220原核表达载体，但未获得表达。后将其克隆入pPROEXHTa六聚组氨酸融合表达载体，结果获得了高效表达。运用该融合表达载体并可给产物纯化工作带来便利，只须用相应的亲和层析系统即可达到高质量的纯化。我们成功完成了中国人肥胖基因的克隆，并通过核苷酸顺序分析证明中国人肥胖基因和已报道的白种人DNA顺序完全一致。我们得到的基因可用作探针，用于研究肥胖基因在肥胖症和糖尿病等病人中的表达情况。通过将肥胖基因克隆入原核表达载体，在大肠杆菌中表达，所得的重组瘦素可用于肥胖症和糖尿病的治疗研究，也可进一步探讨肥胖基因的作用机制。结果讨论中国人肥胖基因大肠杆菌中的表达谢谢欣赏！导演：黄富新主演：中国人肥胖基因大肠杆菌中的表达肥胖基因表达载体构建示意图

中国人肥胖基因大肠杆菌中的表达1

PCR分子量标准PCRmolecularweightmarker2

RT-PCR扩增产物RT-PCRproduct箭头所指为肥胖基因条带Arrowindicatestheobesegeneband运用Trizol试剂得到了非常满意的总RNA，电泳条带显示18s和28srRNA分别在1.7kb和4.5kb位置，比例约为1:2，可见总RNA完整性和片段大小均很好。根据已知序列设计引物，以中国人脂肪组织RNA为模板，结果非常特异地扩增出约500bp片段的肥胖基因条带(下图)。

中国人肥胖基因大肠杆菌中的表达肥胖基因的分子克隆及酶切鉴定

1

DNA分子量标准DNAmolecularweightmarker2重组的pUC19质粒RecombinantpUC19plasmid3重组的pUC19质粒经EcoRI和BamHI酶切RecombinantpUC19plasmiddigestedbyEcoRIandBamHI

箭头所指为肥胖基因条带Arrowindicatestheobesegeneband中国人肥胖基因大肠杆菌中的表达ATGGTGCCCATCCAAAAAGTCCAAGATGACACCAAAACCCTCATCAAGACAATTGTCACCAGGATCAATGACATTTCACACACGCAGTCAGTCTCCTCCAAACAGAAAGTCACCGGTTTGGACTTCATTCCTGGGCTCCACCCCATCCTGACCTTATCCAAGATGGACCAGACACTGGCAGTCTACCAACAGATCCTCACCAGTATGCCTTCCAGAAACGTGATCCAAATATCCAACGACCTGGAGAACCTCCGGGATCTTCTTCACGTGCTGGCCTTCTCTAAGAGCTGCCACTTGCCCTGGGCCAGTGGCCTGGAGACCTTGGACAGCCTGGGGGGTGTCCTGGAAGCTTCAGGCTACTCCACAGAGGTGGTGGCCCTGAGCAGGCTGCAGGGGTCTCTGCAGGACATGCTGTGGCAGCTGGACCTCAGCCCTGGGTGCTGA中国人肥胖基因序列

中国人肥胖基因大肠杆菌中的表达肥胖基因的原核表达

1低分子量蛋白质标准Lowmolecular

protein

marker

2大肠杆菌DH5α

E.coliDH5α

3载体pPROEXHta转化的DH5