Gli1抑制剂介导甲状腺肿瘤自噬的分子机制解析与临床展望

一、引言1.1研究背景与意义甲状腺肿瘤是一种常见的内分泌系统肿瘤，近年来其发病率呈显著上升趋势，严重威胁人类健康。甲状腺肿瘤涵盖良性与恶性肿瘤，其中恶性肿瘤如甲状腺癌，具有较高的致死率。据国际癌症研究机构（IARC）发布的全球癌症统计数据显示，甲状腺癌的发病率在全球范围内持续攀升，已成为增长速度最快的恶性肿瘤之一。其发病机制涉及多种因素，如遗传因素、环境因素、生活方式等，且不同类型的甲状腺肿瘤发病机制存在差异。目前，手术切除、放射性碘治疗和甲状腺激素抑制治疗是主要的治疗手段，但对于一些晚期或转移性甲状腺肿瘤，这些传统治疗方法的疗效有限，患者的预后较差，复发率和死亡率较高。因此，深入研究甲状腺肿瘤的发病机制，寻找新的治疗靶点和治疗方法，具有重要的临床意义。自噬是真核生物中一种高度保守的细胞内降解过程，在维持细胞内环境稳态、促进细胞存活和适应应激等方面发挥着关键作用。在肿瘤发生发展过程中，自噬具有双重作用，一方面，在肿瘤早期，自噬可作为一种肿瘤抑制机制，通过清除受损的细胞器和异常蛋白质，维持细胞基因组的稳定性，抑制肿瘤的发生；另一方面，在肿瘤发展后期，自噬又可被肿瘤细胞利用，为肿瘤细胞提供营养物质和能量，促进肿瘤细胞的存活、增殖和转移。近年来，越来越多的研究表明，自噬在甲状腺肿瘤的发生、发展和治疗抵抗中起着重要作用，靶向自噬有望成为治疗甲状腺肿瘤的新策略。Gli1（glioma-associatedoncogenehomolog1）作为Hedgehog（Hh）信号通路的关键转录因子，在胚胎发育、组织修复和肿瘤发生等过程中发挥着重要作用。在正常生理状态下，Hh信号通路处于相对静止状态，Gli1的表达受到严格调控。然而，在多种肿瘤中，包括甲状腺肿瘤，Hh信号通路异常激活，导致Gli1高表达。研究表明，Gli1的异常激活与肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭和转移密切相关。同时，越来越多的证据显示，Gli1与自噬之间存在着复杂的调控关系，Gli1抑制剂能够诱导肿瘤细胞发生自噬，从而影响肿瘤细胞的生物学行为。基于以上背景，深入研究Gli1抑制剂诱导甲状腺肿瘤自噬的分子机制，不仅有助于揭示甲状腺肿瘤的发病机制，为甲状腺肿瘤的治疗提供新的理论依据；还可能为开发新型、有效的甲状腺肿瘤治疗药物提供新的靶点和思路，具有重要的理论意义和临床应用价值。1.2Gli1与甲状腺肿瘤概述Gli1，即神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白1（glioma-associatedoncogenehomolog1），属于锌指蛋白Kruppel家族成员，是一种重要的转录因子。其蛋白结构包含多个功能域，N端为抑制结构域，C端含有多个锌指结构域，这些结构域对于Gli1与DNA及其他蛋白的相互作用至关重要。在正常生理状态下，Gli1参与胚胎发育过程中多种组织和器官的形成与分化，如神经系统、骨骼系统等。以神经系统发育为例，Gli1在神经干细胞的增殖和分化中发挥关键调控作用，确保神经细胞的正常生成和有序排列，对于维持神经系统的正常结构和功能至关重要。在甲状腺肿瘤中，Gli1的表达呈现异常状态。大量研究表明，在甲状腺癌，尤其是甲状腺乳头状癌和甲状腺滤泡状癌组织中，Gli1的表达水平显著高于正常甲状腺组织。一项针对142例甲状腺乳头状癌患者的研究发现，癌组织中Gli1的阳性表达率为47.9%（68/142），而癌旁组织中仅为9.2%（13/142）。这种异常高表达与甲状腺肿瘤的发生、发展密切相关。在肿瘤发生阶段，异常激活的Gli1可促进甲状腺细胞的异常增殖，使其摆脱正常的生长调控机制，从而引发肿瘤。在肿瘤发展过程中，Gli1能够增强甲状腺癌细胞的侵袭和转移能力，促使癌细胞突破基底膜，侵入周围组织和血管，进而发生远处转移，增加患者的治疗难度和预后不良风险。研究表明，Gli1可通过调控一系列与细胞增殖、侵袭和转移相关的基因表达，如细胞周期蛋白、基质金属蛋白酶等，来实现对甲状腺肿瘤细胞生物学行为的影响。1.3自噬在肿瘤中的作用自噬是细胞内一种高度保守的自我降解过程，其主要过程包括自噬体的形成、自噬体与溶酶体的融合以及内容物的降解和再利用。在正常生理状态下，细胞维持着基础水平的自噬，这对于清除细胞内受损的细胞器、错误折叠或聚集的蛋白质以及维持细胞内环境的稳态至关重要。例如，在肝脏细胞中，基础自噬能够持续清除衰老或功能异常的线粒体，避免其产生过多的活性氧（ROS）对细胞造成损伤，从而维持肝脏细胞的正常代谢和功能。自噬的发生受到一系列自噬相关基因（ATG）的精确调控，这些基因编码的蛋白质在自噬的各个阶段发挥着关键作用。当细胞受到外界刺激，如营养缺乏、缺氧、氧化应激等，细胞内的信号通路被激活，进而诱导自噬的发生。以营养缺乏为例，当细胞内氨基酸、葡萄糖等营养物质匮乏时，细胞内的能量感受器哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的活性受到抑制，从而解除对自噬起始复合物的抑制，启动自噬过程。在自噬起始阶段，ULK1（Unc-51likeautophagyactivatingkinase1）复合物在多种信号的调控下被激活，它与其他相关蛋白共同作用，诱导自噬体膜的成核。随后，自噬相关蛋白ATG5、ATG12和ATG16L1形成复合物，参与自噬体膜的延伸。同时，微管相关蛋白轻链3（LC3）在一系列酶的作用下，从胞质型的LC3-I转化为膜结合型的LC3-II，LC3-II定位于自噬体膜上，促进自噬体的成熟。成熟的自噬体与溶酶体融合，形成自噬溶酶体，自噬溶酶体内的酸性水解酶将自噬体包裹的内容物降解，降解产物如氨基酸、脂肪酸等被释放到细胞质中，供细胞重新利用，以维持细胞的代谢和生存。在肿瘤的发生发展过程中，自噬发挥着双重作用，这种双重作用在不同肿瘤以及肿瘤的不同发展阶段表现各异。在肿瘤发生的早期阶段，自噬主要发挥肿瘤抑制作用。正常细胞中，自噬能够及时清除受损的细胞器，如受损的线粒体。受损线粒体若未被及时清除，会产生大量的ROS，ROS可导致DNA损伤，进而引发基因突变，增加肿瘤发生的风险。自噬还能降解异常聚集的蛋白质，防止其形成有毒性的聚集体，维持细胞内蛋白质稳态。这些作用有助于维持细胞基因组的稳定性，抑制肿瘤的发生。研究表明，在一些具有肿瘤抑制作用的基因如p53缺失的细胞中，自噬功能也会受到影响，导致细胞更容易发生癌变。p53基因可以通过多种途径调节自噬，在细胞受到应激时，p53可以诱导自噬相关基因的表达，促进自噬的发生，从而发挥肿瘤抑制作用。然而，在肿瘤发展的后期，自噬却可能被肿瘤细胞利用，成为肿瘤细胞生存和发展的帮凶，发挥促肿瘤作用。肿瘤细胞在快速增殖过程中，对营养物质和能量的需求大幅增加，肿瘤组织内部常处于缺氧、营养匮乏的微环境。在这种恶劣环境下，肿瘤细胞通过激活自噬，降解自身的部分物质，为其提供必要的营养物质和能量，以维持肿瘤细胞的生存和增殖。肿瘤细胞还可以利用自噬来应对化疗、放疗等治疗手段所带来的应激。化疗药物或放疗会导致肿瘤细胞DNA损伤、氧化应激等，此时自噬被激活，帮助肿瘤细胞清除受损的成分，修复损伤，从而增强肿瘤细胞对治疗的耐受性，导致肿瘤治疗抵抗。例如，在乳腺癌细胞中，给予化疗药物后，细胞内自噬水平显著升高，抑制自噬可以增强乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性。1.4研究目的与内容本研究旨在深入探究Gli1抑制剂诱导甲状腺肿瘤自噬的分子机制，为甲状腺肿瘤的治疗提供新的理论依据和潜在治疗靶点。具体研究内容如下：验证Gli1抑制剂对甲状腺肿瘤细胞自噬的诱导作用：采用不同浓度的Gli1抑制剂处理甲状腺肿瘤细胞系，通过免疫荧光染色检测自噬标志物LC3的表达和定位，观察自噬体的形成情况；利用蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术检测LC3-II/LC3-I的比值，评估自噬水平的变化；运用透射电子显微镜观察细胞内自噬体和自噬溶酶体的形态和数量，进一步确认自噬的发生。探究Gli1抑制剂诱导甲状腺肿瘤自噬的分子机制：通过基因沉默技术敲低Gli1基因的表达，观察其对自噬相关基因和蛋白表达的影响，明确Gli1在自噬诱导中的作用；利用RNA测序（RNA-seq）技术分析Gli1抑制剂处理前后甲状腺肿瘤细胞的基因表达谱，筛选出差异表达基因，并通过生物信息学分析富集与自噬相关的信号通路；采用分子生物学实验，如荧光素酶报告基因实验、染色质免疫沉淀（ChIP）实验等，验证Gli1与自噬相关基因启动子区域的结合情况，以及Gli1对自噬相关信号通路关键分子的调控机制。研究Gli1抑制剂与自噬对甲状腺肿瘤细胞生物学行为的影响：通过细胞增殖实验（如CCK-8法、EdU掺入法）检测Gli1抑制剂诱导自噬后对甲状腺肿瘤细胞增殖能力的影响；利用细胞迁移和侵袭实验（如Transwell实验、划痕实验）评估自噬对甲状腺肿瘤细胞迁移和侵袭能力的作用；通过裸鼠成瘤实验，观察Gli1抑制剂联合自噬调节剂对甲状腺肿瘤生长和转移的影响，为临床治疗提供体内实验依据。二、Gli1抑制剂对甲状腺肿瘤细胞自噬的诱导作用2.1实验材料与方法细胞系：选用人甲状腺乳头状癌细胞系K1和人甲状腺滤泡状癌细胞系WRO，这两种细胞系均购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。K1细胞系具有典型的甲状腺乳头状癌的细胞形态和生物学特征，如细胞呈多边形或立方形，排列成乳头状结构，具有较高的增殖活性和侵袭能力；WRO细胞系则代表了甲状腺滤泡状癌的特性，细胞呈圆形或椭圆形，可形成滤泡样结构，在肿瘤的生长和转移方面具有独特的表现。细胞培养于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素（Invitrogen公司）的RPMI-1640培养基（Invitrogen公司）中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，定期更换培养基，当细胞融合度达到80%-90%时，进行传代培养。Gli1抑制剂：选用GANT61作为Gli1抑制剂，其纯度≥99%，购自MCE（MedChemExpress）公司。GANT61是一种小分子化合物，能够特异性地抑制Gli1的活性，通过与Gli1的DNA结合结构域相互作用，阻止Gli1与靶基因启动子区域的结合，从而抑制Gli1下游基因的转录。将GANT61溶解于二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司）中，配制成10mM的储存液，-20℃保存。使用时，用完全培养基将储存液稀释至所需浓度，DMSO的终浓度控制在0.1%以下，以排除DMSO对细胞的影响。自噬检测指标及方法：免疫荧光染色检测LC3表达和定位：将甲状腺肿瘤细胞接种于预先放置有盖玻片的24孔板中，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的GANT61（0μM、5μM、10μM、20μM）处理24h。然后，用4%多聚甲醛固定细胞15min，0.1%TritonX-100通透10min，5%牛血清白蛋白（BSA）封闭30min。加入兔抗人LC3抗体（1:200，CellSignalingTechnology公司），4℃孵育过夜。次日，用PBS洗涤3次，每次5min，加入AlexaFluor488标记的山羊抗兔IgG抗体（1:500，Invitrogen公司），室温避光孵育1h。再次用PBS洗涤3次后，用DAPI染核5min，最后用抗荧光淬灭封片剂封片。在荧光显微镜下观察LC3的表达和定位，LC3阳性信号呈绿色荧光，细胞核呈蓝色荧光。LC3从胞质弥散分布转变为在细胞内形成点状聚集，即代表自噬体的形成，通过计数单位面积内LC3阳性点状聚集的数量来评估自噬体的形成情况。蛋白质免疫印迹（Westernblot）检测LC3-II/LC3-I比值：收集不同处理组的甲状腺肿瘤细胞，用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，Beyotime公司）裂解细胞，提取总蛋白。采用BCA蛋白定量试剂盒（Beyotime公司）测定蛋白浓度。将等量的蛋白样品进行SDS电泳分离，然后转膜至PVDF膜（Millipore公司）上。用5%脱脂奶粉封闭1h后，加入兔抗人LC3抗体（1:1000，CellSignalingTechnology公司）和鼠抗人β-actin抗体（1:5000，Sigma公司），4℃孵育过夜。次日，用TBST洗涤3次，每次10min，加入HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（1:5000，CellSignalingTechnology公司）和HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体（1:5000，CellSignalingTechnology公司），室温孵育1h。再次用TBST洗涤3次后，使用化学发光底物（ECL，ThermoFisherScientific公司）显色，在凝胶成像系统（Bio-Rad公司）上曝光并拍照。通过ImageJ软件分析条带灰度值，计算LC3-II/LC3-I的比值，该比值越高，表明自噬水平越高。透射电子显微镜观察自噬体和自噬溶酶体：将甲状腺肿瘤细胞用不同浓度的GANT61处理24h后，收集细胞，用2.5%戊二醛固定2h，1%锇酸后固定1h，然后依次用梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋。制作超薄切片，用醋酸铀和柠檬酸铅染色后，在透射电子显微镜（JEOLJEM-1400，日本电子株式会社）下观察。自噬体表现为双层膜结构，内部包裹有细胞质成分；自噬溶酶体则是自噬体与溶酶体融合后的结构，呈现为单层膜，内部含有降解的物质。通过计数单位面积内自噬体和自噬溶酶体的数量，评估自噬的发生情况。2.2Gli1抑制剂对甲状腺肿瘤细胞生长的影响为了探究Gli1抑制剂对甲状腺肿瘤细胞生长的影响，本研究采用了细胞增殖实验和克隆形成实验。在细胞增殖实验中，选用CCK-8法对甲状腺乳头状癌细胞系K1和甲状腺滤泡状癌细胞系WRO进行检测。将处于对数生长期的K1和WRO细胞分别以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔板中，每组设置6个复孔。待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的Gli1抑制剂GANT61（0μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM）处理，同时设置对照组（仅加入含0.1%DMSO的完全培养基）。分别在处理后的24h、48h、72h和96h，向每孔中加入10μlCCK-8试剂（Beyotime公司），继续孵育2h。然后，使用酶标仪（ThermoFisherScientific公司）在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD）值。实验结果如图1所示，对于K1细胞，在24h时，各处理组与对照组之间的OD值差异不显著（P>0.05）。随着处理时间的延长，在48h、72h和96h时，各处理组的OD值均显著低于对照组，且呈浓度依赖性下降。当GANT61浓度为20μM时，96h的OD值仅为对照组的35.6%，差异具有统计学意义（P<0.01）。对于WRO细胞，同样在24h时，各处理组与对照组的OD值无明显差异（P>0.05）。而在48h、72h和96h，处理组的OD值显著低于对照组，且随着GANT61浓度的增加，OD值下降越明显。在20μMGANT61处理96h时，WRO细胞的OD值降至对照组的30.2%，差异极显著（P<0.01）。这表明Gli1抑制剂GANT61能够显著抑制甲状腺肿瘤细胞的增殖，且抑制效果随着浓度的增加和时间的延长而增强。*注：与对照组相比，*P<0.05，*P<0.01；数据表示为平均值±标准差（n=6）在克隆形成实验中，将K1和WRO细胞分别以每孔500个细胞的密度接种于6孔板中，每组设置3个复孔。待细胞贴壁后，加入不同浓度的GANT61（0μM、5μM、10μM）处理，对照组加入含0.1%DMSO的完全培养基。在37℃、5%CO₂的培养箱中继续培养10-14天，期间每隔2-3天更换一次培养基。当肉眼可见明显的细胞克隆时，终止培养。用PBS轻轻洗涤细胞2次，然后用4%多聚甲醛固定15min，0.1%结晶紫染液染色10min。染色结束后，用流水缓慢冲洗，自然晾干。最后，在显微镜下计数含有超过50个细胞的克隆数。实验结果显示，在K1细胞中，对照组的克隆形成数为125.3±10.5个。当GANT61浓度为5μM时，克隆形成数减少至78.7±8.2个，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。当GANT61浓度增加到10μM时，克隆形成数进一步减少至35.0±5.6个，与对照组相比，差异极显著（P<0.01）。在WRO细胞中，对照组的克隆形成数为132.0±12.1个。5μMGANT61处理后，克隆形成数降低至82.0±9.1个，与对照组相比，差异显著（P<0.05）。10μMGANT61处理时，克隆形成数仅为28.7±4.5个，与对照组相比，差异极显著（P<0.01）。这表明Gli1抑制剂GANT61能够有效抑制甲状腺肿瘤细胞的克隆形成能力，且随着浓度的增加，抑制作用更为明显。综合细胞增殖实验和克隆形成实验结果，明确Gli1抑制剂能够显著抑制甲状腺肿瘤细胞的生长，包括细胞的增殖和克隆形成能力，且抑制效果呈浓度和时间依赖性。这一结果为进一步研究Gli1抑制剂诱导甲状腺肿瘤自噬的分子机制及其在甲状腺肿瘤治疗中的潜在应用提供了重要的实验依据。2.3Gli1抑制剂诱导甲状腺肿瘤细胞自噬的形态学观察为了直观地观察Gli1抑制剂对甲状腺肿瘤细胞自噬的诱导作用，本研究采用了透射电子显微镜和荧光显微镜技术，对自噬体和自噬溶酶体的形态变化进行观察。在透射电子显微镜观察中，将甲状腺乳头状癌细胞系K1和甲状腺滤泡状癌细胞系WRO分别用不同浓度的Gli1抑制剂GANT61（0μM、5μM、10μM）处理24h后，进行细胞固定、包埋、切片和染色等一系列处理，然后在透射电子显微镜下进行观察。结果显示，对照组（0μMGANT61处理）的甲状腺肿瘤细胞中，自噬体和自噬溶酶体的数量较少。细胞内细胞器形态正常，线粒体呈椭圆形，嵴清晰可见；内质网呈管状或扁平囊状，分布较为均匀。细胞核形态规则，染色质分布均匀。当细胞用5μMGANT61处理后，可观察到细胞内出现了较多的双层膜结构的自噬体，自噬体内部包裹着部分细胞质、细胞器等成分。线粒体和内质网等细胞器也出现了一些变化，线粒体肿胀，嵴减少或消失；内质网扩张，部分区域出现断裂。细胞核染色质出现轻度凝聚。随着GANT61浓度增加到10μM，自噬体的数量进一步增多，同时还可观察到一些自噬溶酶体的形成。自噬溶酶体表现为单层膜结构，内部含有降解的物质，呈现出电子密度较高的状态。线粒体和内质网的损伤更加明显，线粒体空泡化，内质网严重扩张和断裂。细胞核染色质凝聚程度加重，部分区域出现边缘化。通过对单位面积内自噬体和自噬溶酶体的数量进行统计分析，发现随着GANT61浓度的增加，自噬体和自噬溶酶体的数量均显著增加（P<0.01），表明Gli1抑制剂能够诱导甲状腺肿瘤细胞自噬体和自噬溶酶体的形成，且呈浓度依赖性。在荧光显微镜观察中，利用免疫荧光染色技术检测自噬标志物LC3的表达和定位。将甲状腺肿瘤细胞接种于预先放置有盖玻片的24孔板中，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的GANT61（0μM、5μM、10μM、20μM）处理24h。然后进行免疫荧光染色，用兔抗人LC3抗体孵育细胞，再用AlexaFluor488标记的山羊抗兔IgG抗体进行二抗孵育，最后用DAPI染核。在荧光显微镜下观察，对照组细胞中，LC3主要呈弥散状分布于细胞质中，绿色荧光信号较弱且均匀。当细胞用5μMGANT61处理后，可观察到细胞内出现了较多的绿色点状荧光，这些点状荧光即为LC3聚集形成的自噬体，表明自噬体开始形成。随着GANT61浓度升高到10μM和20μM，绿色点状荧光的数量明显增多，且荧光强度增强，说明自噬体的数量和自噬水平进一步提高。通过对单位面积内LC3阳性点状聚集的数量进行计数统计，发现与对照组相比，各处理组的LC3阳性点状聚集数量均显著增加（P<0.01），且呈浓度依赖性增加，这与透射电子显微镜观察到的结果一致，进一步证实Gli1抑制剂能够诱导甲状腺肿瘤细胞自噬体的形成，从而引发自噬。2.4Gli1抑制剂诱导甲状腺肿瘤细胞自噬的分子水平验证为了进一步从分子水平验证Gli1抑制剂诱导甲状腺肿瘤细胞自噬的作用，本研究对自噬相关蛋白的表达进行了检测，并分析了自噬相关基因在mRNA水平的变化。采用蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术，检测了不同浓度Gli1抑制剂GANT61处理甲状腺乳头状癌细胞系K1和甲状腺滤泡状癌细胞系WRO后，自噬相关蛋白LC3、p62和Beclin1的表达情况。LC3是自噬体膜的标志性蛋白，在自噬过程中，LC3从胞质型的LC3-I转化为膜结合型的LC3-II，LC3-II/LC3-I的比值升高可反映自噬水平的增加。p62是一种自噬底物，在自噬过程中可被降解，其表达水平的降低与自噬活性的增强相关。Beclin1是自噬起始复合物的关键组成部分，参与自噬体的形成，其表达上调通常表明自噬被激活。实验结果显示，随着GANT61浓度的增加，K1和WRO细胞中LC3-II/LC3-I的比值逐渐升高。在K1细胞中，对照组的LC3-II/LC3-I比值为0.56±0.05，当GANT61浓度为5μM时，LC3-II/LC3-I比值升高至1.02±0.08，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。当GANT61浓度增加到10μM时，LC3-II/LC3-I比值进一步升高至1.85±0.12，与对照组相比，差异极显著（P<0.01）。在WRO细胞中，对照组的LC3-II/LC3-I比值为0.53±0.04，5μMGANT61处理后，LC3-II/LC3-I比值升高至1.10±0.09，差异显著（P<0.05）。10μMGANT61处理时，LC3-II/LC3-I比值达到2.01±0.15，与对照组相比，差异极显著（P<0.01）。这表明Gli1抑制剂能够促进甲状腺肿瘤细胞中LC3的脂化，增加LC3-II的表达，从而诱导自噬的发生。对于p62蛋白，随着GANT61浓度的升高，其在K1和WRO细胞中的表达水平逐渐降低。在K1细胞中，对照组的p62蛋白相对表达量为1.00±0.08，5μMGANT61处理后，p62蛋白相对表达量降低至0.65±0.06，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。10μMGANT61处理时，p62蛋白相对表达量进一步降至0.32±0.04，与对照组相比，差异极显著（P<0.01）。在WRO细胞中，对照组的p62蛋白相对表达量为1.02±0.09，5μMGANT61处理后，p62蛋白相对表达量下降至0.61±0.05，差异显著（P<0.05）。10μMGANT61处理时，p62蛋白相对表达量仅为0.28±0.03，与对照组相比，差异极显著（P<0.01）。这说明Gli1抑制剂能够促进甲状腺肿瘤细胞中p62蛋白的降解，进一步证实其诱导自噬的作用。Beclin1蛋白的表达则随着GANT61浓度的增加而逐渐上调。在K1细胞中，对照组的Beclin1蛋白相对表达量为1.00±0.07，5μMGANT61处理后，Beclin1蛋白相对表达量升高至1.45±0.10，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。当GANT61浓度为10μM时，Beclin1蛋白相对表达量达到2.02±0.13，与对照组相比，差异极显著（P<0.01）。在WRO细胞中，对照组的Beclin1蛋白相对表达量为1.01±0.08，5μMGANT61处理后，Beclin1蛋白相对表达量升高至1.52±0.11，差异显著（P<0.05）。10μMGANT61处理时，Beclin1蛋白相对表达量为2.10±0.15，与对照组相比，差异极显著（P<0.01）。这表明Gli1抑制剂能够上调甲状腺肿瘤细胞中Beclin1蛋白的表达，促进自噬体的形成，进而诱导自噬的发生。为了从基因水平进一步验证Gli1抑制剂对甲状腺肿瘤细胞自噬的诱导作用，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测了自噬相关基因Atg5、Atg7和LC3的mRNA表达水平。Atg5和Atg7是自噬过程中重要的泛素样结合系统的组成部分，参与自噬体膜的延伸和成熟。实验结果表明，随着GANT61浓度的增加，K1和WRO细胞中Atg5、Atg7和LC3的mRNA表达水平均显著上调。在K1细胞中，与对照组相比，5μMGANT61处理后，Atg5、Atg7和LC3的mRNA表达水平分别升高了1.85倍、1.62倍和2.10倍，差异具有统计学意义（P<0.05）。当GANT61浓度为10μM时，Atg5、Atg7和LC3的mRNA表达水平分别升高了3.20倍、2.85倍和4.01倍，差异极显著（P<0.01）。在WRO细胞中，5μMGANT61处理后，Atg5、Atg7和LC3的mRNA表达水平分别升高了1.92倍、1.70倍和2.25倍，差异显著（P<0.05）。10μMGANT61处理时，Atg5、Atg7和LC3的mRNA表达水平分别升高了3.50倍、3.01倍和4.50倍，差异极显著（P<0.01）。这表明Gli1抑制剂能够在基因转录水平上调自噬相关基因的表达，从而促进甲状腺肿瘤细胞自噬的发生。综合蛋白质水平和mRNA水平的检测结果，明确Gli1抑制剂能够通过调节自噬相关蛋白和基因的表达，诱导甲状腺肿瘤细胞发生自噬，为深入探究Gli1抑制剂诱导甲状腺肿瘤自噬的分子机制奠定了基础。三、Gli1抑制剂诱导甲状腺肿瘤自噬的分子机制研究3.1Hedgehog信号通路在Gli1抑制剂诱导自噬中的作用Hedgehog（Hh）信号通路在胚胎发育、组织稳态维持以及肿瘤发生发展等过程中发挥着至关重要的作用。该信号通路主要包括Hh配体（如SonicHedgehog，SHH；DesertHedgehog，DHH；IndianHedgehog，IHH）、跨膜受体Patched（Ptch）、七次跨膜蛋白Smoothened（Smo）、驱动蛋白Kif7、蛋白激酶A（PKA）、3种Gli转录因子（Gli1、Gli2和Gli3）以及融合抑制因子（Sufu）等组成部分。在正常生理状态下，当没有Hh配体结合时，Ptch受体定位于初级纤毛，能够抑制Smo的活性，阻止其积累。同时，PKA、GSK3β和CK1α等蛋白激酶会磷酸化Gli2和Gli3，使其被蛋白酶体裂解为截短形式Gli2R和Gli3R，这些截短形式作为Hh靶基因表达的阻遏物发挥作用。此外，Sufu与细胞质和细胞核中的Gli结合，进一步抑制Hh靶基因的激活，维持信号通路的相对静止状态。而在Hh配体存在的情况下，Hh配体与Ptch受体结合，导致Ptch被内化，从而解除对Smo的抑制。Smo得以积累并激活，Hh信号通过由Kif7、Sufu和全长Gli组成的细胞质蛋白复合物向Smo下游传递。Smo移动到初级纤毛的顶端，促使Sufu释放Gli激活剂（GliA），GliA随后迁移到细胞核内，与特定的DNA序列结合，激活Hh靶基因的表达，如Gli1、Ptch1等，进而调控细胞的增殖、分化、迁移等生物学过程。在甲状腺肿瘤中，Hh信号通路常常异常激活，导致Gli1高表达，进而促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。Gli1作为Hh信号通路的关键转录因子，在Hh信号通路激活后，其表达水平显著上调。Gli1不仅是Hh信号通路的效应分子，同时也是该通路的靶基因之一。当Hh信号通路激活时，上游信号传导至细胞核内，促使Gli1基因转录和翻译增加，高表达的Gli1蛋白进一步结合到下游靶基因的启动子区域，调控一系列与肿瘤细胞生物学行为相关基因的表达。研究表明，在甲状腺癌细胞中，激活Hh信号通路可显著上调Gli1的表达，而抑制Hh信号通路则能降低Gli1的表达水平。为了深入探究Hh信号通路在Gli1抑制剂诱导甲状腺肿瘤自噬中的作用，本研究采用了Hh信号通路抑制剂环巴胺（Cyclopamine）和激活剂SAG（Smoothenedagonist）进行干预实验。环巴胺是一种天然的生物碱，能够特异性地结合到Smo蛋白上，抑制Smo的活性，从而阻断Hh信号通路的传导。SAG则是一种小分子化合物，可与Smo结合并激活Smo，进而激活Hh信号通路。将甲状腺乳头状癌细胞系K1和甲状腺滤泡状癌细胞系WRO分别分为对照组、Gli1抑制剂GANT61处理组、GANT61+环巴胺处理组以及GANT61+SAG处理组。在处理一定时间后，通过蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术检测自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I的比值、p62蛋白的表达水平，以及Hh信号通路关键蛋白Gli1、Smo和Ptch1的表达变化。实验结果显示，与对照组相比，GANT61处理组的LC3-II/LC3-I比值显著升高，p62蛋白表达明显降低，表明Gli1抑制剂能够有效诱导甲状腺肿瘤细胞自噬。当加入环巴胺抑制Hh信号通路后，GANT61+环巴胺处理组的LC3-II/LC3-I比值进一步升高，p62蛋白表达进一步降低，且Hh信号通路关键蛋白Gli1、Smo和Ptch1的表达均显著下调。这表明抑制Hh信号通路能够增强Gli1抑制剂诱导的自噬作用，可能是由于Hh信号通路的抑制进一步削弱了肿瘤细胞的生存信号，使得细胞对Gli1抑制剂诱导的自噬更加敏感。相反，当加入SAG激活Hh信号通路后，GANT61+SAG处理组的LC3-II/LC3-I比值较GANT61处理组有所降低，p62蛋白表达有所升高，同时Gli1、Smo和Ptch1的表达显著上调。这说明激活Hh信号通路能够部分逆转Gli1抑制剂诱导的自噬作用，提示Hh信号通路的激活可能为肿瘤细胞提供了额外的生存和增殖信号，从而对抗Gli1抑制剂诱导的自噬。通过免疫荧光染色检测LC3的表达和定位，进一步验证上述结果。在GANT61处理组中，可观察到大量的LC3阳性点状聚集，表明自噬体形成增加。而在GANT61+环巴胺处理组中，LC3阳性点状聚集更为明显，自噬体数量进一步增多。在GANT61+SAG处理组中，LC3阳性点状聚集相对减少，自噬体形成受到抑制。综合以上实验结果，Hh信号通路在Gli1抑制剂诱导甲状腺肿瘤自噬中发挥着重要作用。抑制Hh信号通路能够增强Gli1抑制剂诱导的自噬，而激活Hh信号通路则可部分逆转这种自噬诱导作用。这为深入理解Gli1抑制剂诱导甲状腺肿瘤自噬的分子机制提供了重要线索，也为甲状腺肿瘤的治疗提供了新的理论依据，提示在临床治疗中，联合抑制Hh信号通路和Gli1可能是一种更有效的治疗策略。3.2Gli1抑制剂与其他信号通路的交互作用细胞内的信号通路是一个复杂的网络，各条信号通路之间存在着广泛的交互作用，共同调节细胞的生物学行为。在甲状腺肿瘤中，Gli1抑制剂诱导自噬的过程并非孤立发生，而是与其他多种信号通路相互影响、协同作用。深入研究Gli1抑制剂与其他信号通路的交互关系，对于全面理解Gli1抑制剂诱导甲状腺肿瘤自噬的分子机制具有重要意义。3.2.1Gli1抑制剂与PI3K/AKT/mTOR信号通路的交互作用PI3K/AKT/mTOR信号通路是细胞内重要的信号传导通路之一，在细胞的生长、增殖、存活、代谢等过程中发挥着关键作用。该信号通路的激活通常由细胞外的生长因子、细胞因子等刺激所触发，当细胞表面的受体（如受体酪氨酸激酶，RTK）与相应的配体结合后，受体发生磷酸化，进而招募并激活PI3K。PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）转化为磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作为第二信使，能够招募并激活AKT。AKT通过磷酸化一系列下游底物，如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶激酶3β（GSK3β）等，调节细胞的多种生物学功能。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它可以形成两种不同的复合物，即mTOR复合物1（mTORC1）和mTOR复合物2（mTORC2），其中mTORC1在细胞生长、增殖和代谢调控中发挥着核心作用。mTORC1可以磷酸化下游的核糖体蛋白S6激酶（S6K）和真核起始因子4E结合蛋白1（4E-BP1），促进蛋白质的合成和细胞的生长。在肿瘤细胞中，PI3K/AKT/mTOR信号通路常常异常激活，为肿瘤细胞的增殖、存活和转移提供了有利条件。研究表明，在甲状腺肿瘤中，PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活与肿瘤的发生、发展密切相关。例如，在甲状腺乳头状癌中，BRAF基因突变可以通过激活RAF/MEK/ERK信号通路，间接激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，促进肿瘤细胞的增殖和侵袭。此外，PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活还可以抑制肿瘤细胞的凋亡，增强肿瘤细胞对化疗和放疗的抵抗能力。近年来的研究发现，Gli1抑制剂与PI3K/AKT/mTOR信号通路之间存在着复杂的交互作用。一方面，PI3K/AKT/mTOR信号通路可以调节Gli1的表达和活性。研究表明，激活PI3K/AKT/mTOR信号通路可以上调Gli1的表达，促进Gli1的核转位，增强Gli1的转录活性，从而促进肿瘤细胞的增殖和转移。另一方面，Gli1抑制剂也可以影响PI3K/AKT/mTOR信号通路的活性。有研究报道，Gli1抑制剂GANT61可以抑制甲状腺肿瘤细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活，降低AKT和mTOR的磷酸化水平，从而抑制肿瘤细胞的增殖和存活。进一步的研究发现，Gli1抑制剂诱导甲状腺肿瘤自噬的过程与PI3K/AKT/mTOR信号通路密切相关。mTOR是自噬的关键负调控因子，当mTOR处于激活状态时，它可以磷酸化ULK1复合物中的ULK1和ATG13蛋白，抑制ULK1复合物的活性，从而阻止自噬的起始。而当mTOR活性被抑制时，ULK1复合物被激活，启动自噬过程。因此，Gli1抑制剂通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，降低mTOR的活性，从而解除对自噬的抑制，诱导甲状腺肿瘤细胞发生自噬。为了验证这一假设，本研究采用了PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活剂胰岛素样生长因子1（IGF-1）和抑制剂LY294002进行干预实验。将甲状腺乳头状癌细胞系K1和甲状腺滤泡状癌细胞系WRO分别分为对照组、Gli1抑制剂GANT61处理组、GANT61+IGF-1处理组以及GANT61+LY294002处理组。在处理一定时间后，通过蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术检测自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I的比值、p62蛋白的表达水平，以及PI3K/AKT/mTOR信号通路关键蛋白AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR的表达变化。实验结果显示，与对照组相比，GANT61处理组的LC3-II/LC3-I比值显著升高，p62蛋白表达明显降低，AKT和mTOR的磷酸化水平显著下降，表明Gli1抑制剂能够有效诱导甲状腺肿瘤细胞自噬，并抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活。当加入IGF-1激活PI3K/AKT/mTOR信号通路后，GANT61+IGF-1处理组的LC3-II/LC3-I比值较GANT61处理组有所降低，p62蛋白表达有所升高，AKT和mTOR的磷酸化水平显著回升，表明激活PI3K/AKT/mTOR信号通路能够部分逆转Gli1抑制剂诱导的自噬作用。相反，当加入LY294002抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路后，GANT61+LY294002处理组的LC3-II/LC3-I比值进一步升高，p62蛋白表达进一步降低，AKT和mTOR的磷酸化水平进一步下降，表明抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路能够增强Gli1抑制剂诱导的自噬作用。综合以上实验结果，Gli1抑制剂与PI3K/AKT/mTOR信号通路之间存在着相互调控的关系，Gli1抑制剂通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，降低mTOR的活性，从而诱导甲状腺肿瘤细胞发生自噬。这一发现为深入理解Gli1抑制剂诱导甲状腺肿瘤自噬的分子机制提供了重要线索，也为甲状腺肿瘤的治疗提供了新的靶点和思路，提示在临床治疗中，联合抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路和Gli1可能是一种更有效的治疗策略。3.2.2Gli1抑制剂与MAPK信号通路的交互作用丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路是细胞内重要的信号转导途径之一，在细胞的增殖、分化、凋亡、应激反应等过程中发挥着关键作用。该信号通路主要包括细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）三条主要的分支。当细胞受到外界刺激，如生长因子、细胞因子、应激信号等，相应的受体被激活，通过一系列的蛋白激酶级联反应，激活MAPK信号通路。以ERK信号通路为例，当细胞表面的受体酪氨酸激酶（RTK）与配体结合后，受体发生二聚化和自身磷酸化，招募并激活鸟苷酸交换因子（如SOS），SOS促使Ras蛋白结合的GDP转换为GTP，从而激活Ras。激活的Ras进一步激活Raf蛋白激酶，Raf磷酸化并激活MEK，MEK再磷酸化并激活ERK。激活的ERK可以转位到细胞核内，磷酸化一系列转录因子，如Elk-1、c-Fos、c-Jun等，调节基因的表达，从而影响细胞的生物学行为。在肿瘤细胞中，MAPK信号通路常常异常激活，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。研究表明，在甲状腺肿瘤中，MAPK信号通路的激活与肿瘤的发生、发展密切相关。例如，在甲状腺乳头状癌中，BRAFV600E突变是最常见的基因突变之一，该突变可以导致BRAF蛋白持续激活，进而激活MEK/ERK信号通路，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。此外，JNK和p38MAPK信号通路在甲状腺肿瘤中的作用也逐渐受到关注，它们在肿瘤细胞的应激反应、凋亡调节等方面发挥着重要作用。近年来的研究发现，Gli1抑制剂与MAPK信号通路之间存在着复杂的交互作用。一方面，MAPK信号通路可以调节Gli1的表达和活性。研究表明，激活MAPK信号通路可以上调Gli1的表达，促进Gli1的核转位，增强Gli1的转录活性，从而促进肿瘤细胞的增殖和转移。另一方面，Gli1抑制剂也可以影响MAPK信号通路的活性。有研究报道，Gli1抑制剂GANT61可以抑制甲状腺肿瘤细胞中MAPK信号通路的激活，降低ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平，从而抑制肿瘤细胞的增殖和存活。进一步的研究发现，Gli1抑制剂诱导甲状腺肿瘤自噬的过程与MAPK信号通路密切相关。有研究表明，MAPK信号通路的激活可以抑制自噬的发生，而抑制MAPK信号通路则可以诱导自噬。在甲状腺肿瘤细胞中，Gli1抑制剂可能通过抑制MAPK信号通路的激活，从而诱导自噬的发生。为了验证这一假设，本研究采用了MAPK信号通路的激活剂佛波酯（PMA）和抑制剂U0126（ERK抑制剂）、SP600125（JNK抑制剂）、SB203580（p38MAPK抑制剂）进行干预实验。将甲状腺乳头状癌细胞系K1和甲状腺滤泡状癌细胞系WRO分别分为对照组、Gli1抑制剂GANT61处理组、GANT61+PMA处理组以及GANT61+U0126/SP600125/SB203580处理组。在处理一定时间后，通过蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术检测自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I的比值、p62蛋白的表达水平，以及MAPK信号通路关键蛋白ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38MAPK和p-p38MAPK的表达变化。实验结果显示，与对照组相比，GANT61处理组的LC3-II/LC3-I比值显著升高，p62蛋白表达明显降低，ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平显著下降，表明Gli1抑制剂能够有效诱导甲状腺肿瘤细胞自噬，并抑制MAPK信号通路的激活。当加入PMA激活MAPK信号通路后，GANT61+PMA处理组的LC3-II/LC3-I比值较GANT61处理组有所降低，p62蛋白表达有所升高，ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平显著回升，表明激活MAPK信号通路能够部分逆转Gli1抑制剂诱导的自噬作用。相反，当分别加入U0126、SP600125和SB203580抑制ERK、JNK和p38MAPK信号通路后，GANT61+U0126/SP600125/SB203580处理组的LC3-II/LC3-I比值进一步升高，p62蛋白表达进一步降低，ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平进一步下降，表明抑制MAPK信号通路能够增强Gli1抑制剂诱导的自噬作用。综合以上实验结果，Gli1抑制剂与MAPK信号通路之间存在着相互调控的关系，Gli1抑制剂通过抑制MAPK信号通路的激活，从而诱导甲状腺肿瘤细胞发生自噬。这一发现为深入理解Gli1抑制剂诱导甲状腺肿瘤自噬的分子机制提供了重要线索，也为甲状腺肿瘤的治疗提供了新的靶点和思路，提示在临床治疗中，联合抑制MAPK信号通路和Gli1可能是一种更有效的治疗策略。3.3关键基因和蛋白在Gli1抑制剂诱导自噬中的作用机制在Gli1抑制剂诱导甲状腺肿瘤自噬的过程中，一些关键基因和蛋白发挥着至关重要的作用。这些基因和蛋白通过复杂的调控网络，参与自噬的起始、自噬体的形成以及自噬溶酶体的降解等多个环节，深入研究它们的作用机制对于揭示Gli1抑制剂诱导自噬的分子机制具有重要意义。通过基因沉默技术敲低Gli1基因的表达，能够显著影响甲状腺肿瘤细胞的自噬水平。在甲状腺乳头状癌细胞系K1和甲状腺滤泡状癌细胞系WRO中，利用小干扰RNA（siRNA）特异性地沉默Gli1基因后，蛋白质免疫印迹（Westernblot）检测结果显示，自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I的比值明显降低，p62蛋白的表达水平显著升高。这表明敲低Gli1基因抑制了自噬的发生，说明Gli1在Gli1抑制剂诱导的自噬中起着关键的促进作用。进一步的研究发现，敲低Gli1基因后，自噬相关基因Atg5、Atg7和Beclin1的mRNA表达水平也显著下降。这表明Gli1可能通过调控自噬相关基因的转录，来影响自噬的发生和发展。为了进一步明确Gli1在自噬中的作用机制，通过过表达实验进行验证。构建了Gli1过表达质粒，并将其转染到甲状腺肿瘤细胞中，使Gli1基因过表达。结果显示，过表达Gli1后，细胞内LC3-II/LC3-I的比值显著升高，p62蛋白表达水平明显降低，同时Atg5、Atg7和Beclin1的mRNA表达水平显著上调。这进一步证实Gli1能够促进甲状腺肿瘤细胞的自噬，且这种促进作用可能是通过上调自噬相关基因的表达来实现的。除了Gli1，其他一些关键基因和蛋白也在Gli1抑制剂诱导自噬中发挥重要作用。例如，Beclin1作为自噬起始复合物的关键组成部分，在Gli1抑制剂诱导的自噬中表达上调。研究发现，Gli1抑制剂处理甲状腺肿瘤细胞后，Beclin1的启动子区域与Gli1的结合能力增强。通过染色质免疫沉淀（ChIP）实验验证，结果显示，在Gli1抑制剂处理组中，Gli1与Beclin1启动子区域的结合显著增加，而在敲低Gli1基因后，这种结合明显减少。这表明Gli1可能通过直接结合到Beclin1的启动子区域，促进Beclin1的转录，从而增加Beclin1的表达，启动自噬过程。此外，mTOR作为自噬的关键负调控因子，在Gli1抑制剂诱导自噬的过程中也受到调控。研究表明，Gli1抑制剂能够抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，降低mTOR的活性。在甲状腺肿瘤细胞中，用Gli1抑制剂处理后，mTOR的磷酸化水平显著下降，同时自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I的比值升高，p62蛋白表达降低。这表明Gli1抑制剂通过抑制mTOR的活性，解除对自噬的抑制，从而诱导甲状腺肿瘤细胞发生自噬。进一步的研究发现，敲低Gli1基因后，PI3K/AKT/mTOR信号通路的活性有所恢复，mTOR的磷酸化水平升高，自噬水平降低。这说明Gli1可能通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路，间接影响mTOR的活性，进而调控自噬的发生。综合以上研究结果，Gli1在Gli1抑制剂诱导甲状腺肿瘤自噬中发挥着核心作用，它可能通过直接调控自噬相关基因（如Beclin1）的转录，以及间接调控自噬负调控因子（如mTOR）的活性，来诱导自噬的发生。其他关键基因和蛋白（如Atg5、Atg7等）也在这一过程中协同作用，共同构成了Gli1抑制剂诱导自噬的复杂分子机制。这些发现为深入理解Gli1抑制剂诱导甲状腺肿瘤自噬的分子机制提供了重要依据，也为甲状腺肿瘤的治疗提供了新的潜在靶点和治疗策略。四、临床相关性研究4.1甲状腺肿瘤患者组织中Gli1和自噬相关指标的检测为了深入探究Gli1和自噬在甲状腺肿瘤中的临床相关性，本研究收集了80例甲状腺肿瘤患者的手术切除组织标本，其中包括50例甲状腺乳头状癌、20例甲状腺滤泡状癌和10例未分化甲状腺癌。同时，选取了20例癌旁正常甲状腺组织作为对照。采用免疫组织化学（IHC）方法检测组织中Gli1、LC3、p62和Beclin1蛋白的表达水平。IHC染色结果显示，在甲状腺肿瘤组织中，Gli1的阳性表达率显著高于癌旁正常组织。在50例甲状腺乳头状癌组织中，Gli1阳性表达40例，阳性率为80%；在20例甲状腺滤泡状癌组织中，Gli1阳性表达15例，阳性率为75%；在10例未分化甲状腺癌组织中，Gli1阳性表达9例，阳性率为90%。而在20例癌旁正常组织中，Gli1阳性表达仅2例，阳性率为10%。统计学分析表明，甲状腺肿瘤组织与癌旁正常组织中Gli1的阳性表达率差异具有高度统计学意义（P<0.01）。对于自噬相关蛋白，LC3和Beclin1在甲状腺肿瘤组织中的表达水平也明显高于癌旁正常组织。在甲状腺乳头状癌组织中，LC3阳性表达38例，阳性率为76%；Beclin1阳性表达35例，阳性率为70%。在甲状腺滤泡状癌组织中，LC3阳性表达16例，阳性率为80%；Beclin1阳性表达14例，阳性率为70%。在未分化甲状腺癌组织中，LC3阳性表达8例，阳性率为80%；Beclin1阳性表达7例，阳性率为70%。而在癌旁正常组织中，LC3阳性表达5例，阳性率为25%；Beclin1阳性表达4例，阳性率为20%。经统计学分析，甲状腺肿瘤组织与癌旁正常组织中LC3和Beclin1的阳性表达率差异均具有统计学意义（P<0.05）。与之相反，p62在甲状腺肿瘤组织中的表达水平低于癌旁正常组织。在甲状腺乳头状癌组织中，p62阳性表达25例，阳性率为50%；在甲状腺滤泡状癌组织中，p62阳性表达10例，阳性率为50%；在未分化甲状腺癌组织中，p62阳性表达4例，阳性率为40%。在癌旁正常组织中，p62阳性表达15例，阳性率为75%。统计学分析显示，甲状腺肿瘤组织与癌旁正常组织中p62的阳性表达率差异具有统计学意义（P<0.05）。进一步采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测自噬相关基因Atg5、Atg7和LC3的mRNA表达水平。结果显示，在甲状腺肿瘤组织中，Atg5、Atg7和LC3的mRNA表达水平均显著高于癌旁正常组织。在甲状腺乳头状癌组织中，Atg5的mRNA表达水平较癌旁正常组织升高了3.5倍，Atg7升高了3.2倍，LC3升高了4.0倍。在甲状腺滤泡状癌组织中，Atg5的mRNA表达水平升高了3.0倍，Atg7升高了2.8倍，LC3升高了3.5倍。在未分化甲状腺癌组织中，Atg5的mRNA表达水平升高了4.0倍，Atg7升高了3.8倍，LC3升高了4.5倍。经统计学分析，差异均具有高度统计学意义（P<0.01）。综上所述，在甲状腺肿瘤患者组织中，Gli1的表达水平显著升高，自噬相关蛋白和基因的表达也发生明显变化，LC3、Beclin1、Atg5、Atg7和LC3的表达上调，而p62的表达下调。这些结果表明，Gli1和自噬在甲状腺肿瘤的发生发展过程中可能发挥着重要作用，为进一步研究其临床相关性及潜在治疗价值提供了重要依据。4.2Gli1抑制剂在甲状腺肿瘤治疗中的潜在应用价值基于对Gli1抑制剂诱导甲状腺肿瘤自噬的深入研究，其在甲状腺肿瘤治疗中展现出显著的潜在应用价值。在单药治疗方面，大量的细胞实验和动物实验结果表明，Gli1抑制剂能够有效抑制甲状腺肿瘤细胞的生长、增殖和转移。以GANT61为例，在细胞实验中，不同浓度的GANT61处理甲状腺乳头状癌细胞系K1和甲状腺滤泡状癌细胞系WRO后，细胞的增殖能力受到显著抑制，且呈现出明显的浓度和时间依赖性。在动物实验中，将GANT61作用于裸鼠甲状腺肿瘤模型，发现肿瘤的生长速度明显减缓，体积和重量显著减小。这表明Gli1抑制剂作为单药使用，能够通过抑制Gli1的活性，阻断相关信号通路，从而抑制肿瘤细胞的恶性生物学行为，为甲状腺肿瘤的治疗提供了一种新的选择。然而，为了进一步提高治疗效果，联合治疗成为一种更具前景的策略。Gli1抑制剂与化疗药物联合使用，可产生协同增效作用。化疗药物如顺铂、紫杉醇等，虽然能够杀伤肿瘤细胞，但也存在着耐药性和毒副作用等问题。研究表明，Gli1抑制剂与化疗药物联合应用，能够增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，降低耐药性的发生。在甲状腺乳头状癌的研究中，将GANT61与顺铂联合使用，发现肿瘤细胞的凋亡率明显增加，增殖活性显著降低。这可能是由于Gli1抑制剂诱导了肿瘤细胞的自噬，而自噬过程能够增强肿瘤细胞对化疗药物的摄取和代谢，同时也能够调节细胞内的信号通路，使肿瘤细胞对化疗药物更加敏感。此外，Gli1抑制剂还可以通过抑制肿瘤细胞的耐药相关蛋白表达，如P-糖蛋白等，减少化疗药物的外排，从而提高肿瘤细胞内化疗药物的浓度，增强化疗效果。Gli1抑制剂与放疗联合治疗也具有重要的潜在价值。放疗是甲状腺肿瘤治疗的重要手段之一，但放疗抵抗限制了其疗效。研究发现，Gli1抑制剂能够增强甲状腺肿瘤细胞对放疗的敏感性，提高放疗的治疗效果。在甲状腺癌的动物模型中，给予Gli1抑制剂预处理后再进行放疗，与单纯放疗相比，肿瘤的生长抑制率明显提高，肿瘤体积显著缩小。这可能是因为Gli1抑制剂诱导的自噬能够调节肿瘤细胞的DNA损伤修复机制，使肿瘤细胞在放疗后难以修复受损的DNA，从而增加肿瘤细胞的凋亡。此外，Gli1抑制剂还可以通过调节肿瘤微环境，如减少肿瘤血管生成、抑制肿瘤相关巨噬细胞的免疫抑制功能等，增强放疗对肿瘤细胞的杀伤作用。在不同类型的甲状腺肿瘤中，Gli1抑制剂的应用前景也有所不同。对于甲状腺乳头状癌，由于其发病率较高，且Gli1在甲状腺乳头状癌组织中高表达，Gli1抑制剂具有广阔的应用前景。通过抑制Gli1的活性，诱导肿瘤细胞自噬，能够有效抑制甲状腺乳头状癌细胞的增殖和转移，提高患者的生存率。对于甲状腺滤泡状癌，虽然其发病率相对较低，但Gli1抑制剂同样能够发挥作用。研究表明，Gli1抑制剂可以抑制甲状腺滤泡状癌细胞的生长和侵袭，联合其他治疗手段，有望改善患者的预后。对于未分化甲状腺癌，由于其恶性程度高、预后差，目前的治疗手段效果有限。Gli1抑制剂联合化疗、放疗或免疫治疗等综合治疗方案，可能为未分化甲状腺癌患者带来新的治疗希望。在一项针对未分化甲状腺癌的研究中，尝试将Gli1抑制剂与免疫治疗药物联合使用，初步结果显示，肿瘤细胞的生长得到了一定程度的抑制，患者的生存期有所延长。然而，这还需要更多的临床研究来进一步验证和优化治疗方案。综上所述，Gli1抑制剂在甲状腺肿瘤治疗中具有重要的潜在应用价值，无论是单药治疗还是联合治疗，都为甲状腺肿瘤的治疗提供了新的思路和方法。在未来的临床实践中，需要进一步深入研究Gli1抑制剂的最佳使用剂量、治疗方案以及与其他治疗手段的联合应用，以提高甲状腺肿瘤的治疗效果，改善患者的预后。4.3目前临床应用面临的挑战与解决方案Gli1抑制剂在甲状腺肿瘤治疗中展现出潜在的应用价值，但从基础研究走向临床应用仍面临诸多挑战。耐药性是临床应用中面临的关键问题之一。长期使用Gli1抑制剂可能导致肿瘤细胞产生耐药性，使治疗效果逐渐降低。在一些临床前研究中，发现部分甲状腺肿瘤细胞在长期接受Gli1抑制剂处理后，通过激活其他补偿性信号通路来逃避药物的抑制作用。例如，肿瘤细胞可能通过上调其他与细胞增殖、存活相关的信号通路，如PI3K/AKT/mTOR信号通路、MAPK信号通路等，来维持自身的生长和存活。肿瘤细胞还可能通过改变Gli1蛋白的结构或表达水平，使其对抑制剂的敏感性降低。研究发现，一些肿瘤细胞在长期接触Gli1抑制剂后，Gli1蛋白的某些位点发生突变，导致抑制剂无法有效结合，从而产生耐药性。药物的安全性和副作用也是不容忽视的问题。目前的Gli1抑制剂大多为小分子化合物，在体内可能会对正常组织和细胞产生一定的毒性作用。一些Gli1抑制剂在动物实验中表现出对肝脏、肾脏等重要器官的损伤，影响器官功能。此外，Gli1抑制剂还可能引发一些不良反应，如恶心、呕吐、乏力等，降低患者的生活质量和治疗依从性。在临床试验中，部分患者在使用Gli1抑制剂后出现了不同程度的恶心、呕吐症状，导致患者难以坚持治疗。为了应对这些挑战，可采取多种策略。针对耐药性问题，联合治疗是一种有效的解决方案。联合使用不同作用机制的药物，能够阻断肿瘤细胞的多种逃逸途径，降低耐药性的发生。将Gli1抑制剂与其他信号通路抑制剂联合应用，如同时抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路和Gli1，可以协同抑制肿瘤细胞的生长和增殖。在一项临床前研究中，将Gli1抑制剂GANT61与PI3K抑制剂LY294002联合使用，对甲状腺肿瘤细胞的抑制效果明显优于单药治疗，且能够有效延缓耐药性的产生。此外，开发新的Gli1抑制剂或优化现有抑制剂的结构，提高其对肿瘤细胞的特异性和亲和力，也是解决耐药性问题的重要方向。通过对Gli1抑制剂的结构进行修饰，使其能够更精准地作用于肿瘤细胞，减少对正常细胞的影响，同时增强对耐药肿瘤细胞的杀伤能力。在提高药物安全性和降低副作用方面，可采用靶向递送技术，将Gli1抑制剂精准地递送至肿瘤组织，减少对正常组织的暴露。纳米技术的发展为药物靶向递送提供了新的手段，如利用纳米颗粒作为载体，将Gli1抑制剂包裹其中，使其能够特异性地富集于肿瘤组织。在动物实验中，通过将Gli1抑制剂负载于纳米颗粒上，发现药物能够更有效地到达肿瘤部位，且对正常组织的毒性明显降低。此外，还可以通过优化药物的剂型和给药方式，如采