固定化酶和细胞课件

固定化酶和細胞

酶應用過程中的一些不足酶的穩定性較差：除了某些耐高溫的酶，如α-澱粉酶、Taq酶等；和胃蛋白酶等可以耐受較低的pH條件以外，大多數的酶在高溫、強酸、強鹼和重金屬離子等外界因素影響下，都容易變性失活。酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中與底物反應，這樣酶在反應系統中，與底物和產物混在一起，反應結束後，即使酶仍有很高的活力，也難於回收利用。這種一次性使用酶的方式，不僅使生產成本提高，而且難於連續化生產。產物的分離純化較困難：酶反應後成為雜質與產物混在一起，無疑給產物的進一步的分離純化帶來一定的困難。固定化技術5.1什麼是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術化學偶聯酶固定化間歇可溶交聯包埋吸附間歇連續酶的固定化技術和固定化酶固定化酶：經提取和分離純化後的酶固定化菌體(死細胞)：含酶菌體或菌體碎片固定化細胞：在一定的空間範圍內進行生命活動的細胞優點：不溶於水，易於與產物分離；可反復使用；可連續化生產；穩定性好。缺點： 固定化過程中往往會引起酶的失活本章目錄固定化酶的研究從50年代開始，1953年德國的Grubhofer和Schleith採用聚氨基苯乙烯樹脂為載體與羧肽酶、澱粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等結合，製成固定化酶。60年代後期，固定化技術迅速發展起來。1969年，日本的千煙一郎首次在工業上生產應用固定化氨基醯化酶從DL-氨基酸連續生產L-氨基酸，實現了酶應用史上的一大變革。在1971年召開的第一次國際酶工程學術會議上，確定固定化酶的統一英文名稱為Immobilizedenzyme。5.2固定化酶的研究歷史隨著固定化技術的發展，出現固定化菌體。1973年，日本首次在工業上應用固定化大腸桿菌菌體中的天門冬氨酸酶，由反丁烯二酸連續生產L-天門冬氨酸。在固定化酶和固定化菌體的基礎上，70年代後期出現了固定化細胞技術。1976年，法國首次用固定化酵母細胞生產啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草桿菌生產澱粉酶，開始了用固定化細胞生產酶的先例。1982年，日本首次研究用固定化原生質體生產谷氨酸，取得進展。固定化原生質體由於解除了細胞壁的障礙，更有利於胞內物質的分泌，這為胞內酶生產技術路線的變革提供了新的方向。本章目錄5.3酶固定化技術活性中心：保護酶的催化作用，並使酶的活性中心的氨基酸基團固有的高級結構不受到損害，在製備固定化酶時，需要在非常嚴密的條件下進行。功能基團：如游離的氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基等，當這些功能基團位於酶的活性中心時，要求不參與酶的固定化結合酶的高級結構：要避免用高溫、強酸、強鹼等處理，而且有機溶劑、高濃度的鹽也會使酶變性、失活，因此，操作應儘量在非常溫和的條件下進行。固定化酶操作的注意事項1、吸附法

利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。常用的固體吸附劑有活性炭、氧化鋁、矽藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、矽膠、羥基磷灰石等。操作簡便，條件溫和，不會引起酶變性失活，載體廉價易得，而且可反復使用。由於靠物理吸附作用，結合力較弱，酶與載體結合不牢固而容易脫落，所以使用受到一定的限制。2、包埋法

將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法。包埋法使用的多孔載體主要有：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠、聚丙烯醯胺、光交聯樹脂、聚醯胺、火棉膠等。根據載體材料和方法的不同，可分為：凝膠包埋法：將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內部的微孔中，製成一定形狀的固定化酶或固定化含酶菌體。大多數為球狀或片狀，也可按需要製成其他形狀。常用的凝膠有瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠等天然凝膠以及聚丙烯醯胺凝膠、光交聯樹脂等合成凝膠。半透膜包埋法：將酶包埋在由各種高分子聚合物製成的小球內，製成固定化酶。常用於製備固定化酶的半透膜有聚醯胺膜、火棉膠膜等首先被採用包埋法的是：固定化胰蛋白酶木瓜蛋白酶

－澱粉酶Enzyme+N,N-甲叉雙丙烯醯胺，丙烯醯胺，引發劑海藻酸鈣包埋法裝置將水溶性的海藻酸鈉配成水溶液，並把酶或細胞分散在其中，然後將其滴入凝固浴中（常用CaCl2溶液），使海藻酸鈉中的Na+，部分被Ca2+所取代而形成由多價離子交聯的離子網路凝膠。顆粒大小可即時監控脂質體包裹3、結合法

選擇適宜的載體，使之通過共價鍵或離子鍵與酶結合在一起的固定化方法。根據酶與載體結合的化學鍵不同，可分為：離子鍵結合法：通過離子鍵使酶與載體結合的固定化方法稱為離子鍵結合法。離子鍵結合法所使用的載體是某些不溶於水的離子交換劑。常用的有DEAE-纖維素、TEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等。共價鍵結合法：通過共價鍵將酶與載體結合的固定化方法稱為共價鍵結合法。共價鍵結合法所採用的載體主要有：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。酶分子中可以形成共價鍵的基團主要有：氨基、羧基、巰基、羥基、酚基和咪唑基等。要使載體與酶形成共價鍵，必須首先使載體活化，第一個離子結合法固定化酶：

DEAE-Cellulose

固定化過氧化氫酶第一個工業化的固定化酶：

DEAE-SephadexA-50

固定化氨基醯化酶4、交聯法借助雙功能試劑使酶分子之間發生交聯作用，製成網狀結構的固定化酶的方法。戊二醛有兩個醛基，這兩個醛基都可與酶或蛋白質的游離氨基反應，形成席夫（Schiff）堿，而使酶或菌體蛋白交聯，製成固定化酶或固定化菌體。交聯法制備的固定化酶或固定化菌體結合牢固，可以長時間使用。但由於交聯反應條件較激烈，酶分子的多個基團被交聯，致使酶活力損失較大，而且製備成的固定化酶或固定化菌體的顆粒較小，給使用帶來不便。為此，可將交聯法與吸附法或包埋法聯合使用，以取長補短。常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。其中應用最廣泛的是戊二醛。酶分子之間共價交聯和與水不溶性載體共價偶聯酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團的化學交聯試劑相互交聯成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶本章目錄5.4固定化酶的特性：將酶或含酶菌體固定化製成固定化酶或固定化菌體以後，由於受到載體等的影響，酶的特性可能會有些變化。固定化酶的穩定性一般比游離酶的穩定性好。固定化酶的最適作用溫度一般與游離酶差不多，活化能也變化不大。酶經過固定化後，其作用的最適pH值往往會發生一些變化。這一點在使用固定化酶時，必須引起注意。影響固定化酶最適pH值的因素主要有兩個，一個是載體的帶電性質，另一個是酶催化反應產物的性質。固定化酶的底物特異性與游離酶比較可能有些不同，其變化與底物分子量的大小有一定關係。固定化酶底物特異性的改變，是由於載體的空間位阻作用引起的。本章目錄乙醯-DL—AlaL—Ala+乙酸 乙醯-D—AlaAminoacylase

氨基醯化酶5.5固定化酶的應用世界上第一種工業化生產的固定化酶。1969年，日本田邊制藥公司將從米麯黴中提取分離得到的氨基醯化酶，用DEAE-葡聚糖凝膠為載體通過離子鍵結合法制成固定化酶，將L-乙醯氨基酸水解生成L-氨基酸，用來拆分DL-乙醯氨基酸，連續生產L-氨基酸。剩餘的D-乙醯氨基酸經過消旋化，生成DL-乙醯氨基酸，再進行拆分。生產成本僅為用游離酶生產成本的60％左右。泵儲罐反應產物離心機消旋反應器固定化酶柱子晶體L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala高果糖漿的生產世界上生產規模最大的一種固定化酶。將培養好的含葡萄糖異構酶的放線菌細胞用60～65℃熱處理15min，該酶就固定在菌體上，製成固定化酶，催化葡萄糖異構化生成果糖，用於連續生產果葡糖漿。青黴素醯化酶轉化流程圖酶感測器酶感測器是由固定化酶與傳感元件兩部分組成的，其中酶是與適當的載體結合形成的不溶於水的固定化酶膜。最常用的酶感測器是酶電極，即將固定化酶膜與轉換電極做在一起，當酶膜與被測物發生催化反應而生成電極活性物質後，電極測定活性物質並將其轉換為電信號輸出。酶電極酶電極是由固定化酶與各種電極密切結合的傳感裝置。1962年Clark和Lyons提出模型，1967年Updike和Hicks首先製造出酶電極並把它用於葡萄糖的定量分析。酶電極一般可根據電極檢測物理量的不同分為電流型和電壓型，前者一般有氧電極、H2O2電極等，後者有NH3、CO2、H2電極等。較典型的一種酶電極為葡萄糖酶電極。葡萄糖＋醌＋H2O 葡萄糖酸＋氫醌葡萄糖氧化酶氫醌 醌＋2H＋＋2e－Pt鉑電極葡萄糖酶電極結構示意圖

葡萄糖酶電極的敏感膜是葡萄糖氧化酶（GOD），它被固定在聚乙烯醯胺凝膠上。在酶膜的作用下葡萄糖發生氧化反應，消耗掉氧而生成葡萄糖酸和過氧化氫。通過用電極測量被消耗的氧或生成的過氧化氫就可瞭解葡萄糖濃度。

手掌型葡萄糖(glucose)分析儀脲電極Urea+2H2O 2NH4++2HCO3-脲酶產生的2NH4+為陽離子電極感應。此外還有： 氨基酸電極 醇電極 尿酸電極 乳酸電極 青黴素電極 亞硝酸離子電極：菠菜亞硝酸還原酶產生NH3一些常見的酶電極底物酶電極5′－腺苷酸5′－腺苷酸脫氨酶NH4+乙醇，醇乙醇脫氫酶Pt過氧化物過氧化氫酶Pt(O2)磷酸葡萄硫酸酯酶+葡萄糖氧化酶Pt(O2)D-氨基酸D－氨基酸氧化酶NH4+L-氨基酸L－氨基酸氧化酶NH3蔗糖蔗糖酶+葡萄糖氧化酶Pt(H2O