3.1重组DNA技术的基本工具课件-高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章第1节重组DNA技术的基本工具一/限制性内切核酸酶—“分子手术刀”1/DNA连接酶—“分子缝合针”2/基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”3/DNA粗提取和鉴定探究.实践实现这一精确的操作过程至少需要三种“分子工具”，即准确切割DNA分子的“分子手术刀”、将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”和将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”。旧知重拾1.DNA的结构脱氧核苷酸脱氧核苷酸旧知重拾1.DNA的结构1′2′4′5′3′磷酸基团脱氧核糖含氮碱基旧知重拾1.DNA的结构DNA平面结构图DNA立体结构图TCGATGGTCTCAGCTACCAGAG旧知重拾1.DNA的结构DNA平面结构图①DNA的骨架：脱氧核糖和磷酸交替排列在外侧②内侧：碱基配对，通过氢键连接③配对方式：AT、GC，A和T两个氢键，G和C三个氢键④G、C比例越大，DNA相对越稳定旧知重拾2.关于基因TCGATGGTCTCAGCTACCAGAGTCGATGGTCTCAGCTACCAGAG.............概念：基因通常是有遗传效应的DNA片段BY3’5’5’3’旧知重拾2.关于基因概念：基因通常是有遗传效应的DNA片段生物以DNA为遗传物质（RNA病毒除外）.DNA的基本组成单位相同（都是四种脱氧核苷酸）.都遵循碱基互补配对原则.不同生物的DNA都具有相同的双螺旋结构.以碱基排列顺序储存遗传信息为不同来源的DNA片段拼接提供了理论依据旧知重拾3.关于基因和蛋白质的关系旧知重拾3.关于基因和蛋白质的关系生物都遵循中心法则：DNA能够自我复制，复制方式相同为外源DNA在细胞中稳定存在提供了理论依据旧知重拾3.关于基因和蛋白质的关系生物都遵循中心法则：几乎一切生物共用一套遗传密码（密码子相同）为外源基因的表达提供了理论依据旧知重拾3.关于基因和蛋白质的关系生物通过蛋白质控制性状：.

基因控制蛋白质的结构直接控制生物体的性状.

基因控制酶的合成来控制代谢过程进而控制生物体的性状一限制性内切核酸酶-”分子手术刀“任务一：阅读教材P71关于限制性内切核酸酶-”分子手术刀“，回答下列问题。1.切割DNA分子的工具是什么？2.”分子手术刀“从什么生物中分离纯化出来的？3.限制性内切核酸酶识别的对象是什么？切割的化学键是什么？4.切割后产生的末端有哪些类型？5.请根据限制性内切核酸酶名字猜测它可以从DNA的两端切割DNA吗？一1.切割DNA分子的工具是什么2.”分子手术刀“从什么生物中分离纯化出来的？限制性内切核酸酶（限制酶）主要是从原核生物（细菌等）中分离纯化出来的任务一：阅读教材P71关于限制性内切核酸酶-”分子手术刀“，回答下列问题。它能破坏外源DNA，如侵染细菌的噬菌体DNA，“限制”病毒在细菌内的寄生，而细菌自身DNA经过相应的化学修饰则不会被限制酶破坏。限制酶的保护作用是细菌等进化出的一种防御机制限制性内切核酸酶-”分子手术刀“一3.限制性内切核酸酶识别的对象是什么？切割的化学键是什么？能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开任务一：阅读教材P71关于限制性内切核酸酶-”分子手术刀“，回答下列问题。例如，EcoRⅠ限制酶的识别序列为从5’→3’方向的识别序列均为GAATTC，并切断G和A之间的磷酸二酯键5’3’5’3’中轴线限制性内切核酸酶-”分子手术刀“一5’3’5’3’从5’→3’方向的识别序列均为GAATTC，并切断G和A之间的磷酸二酯键3’5’5’3’黏性末端黏性末端当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；注意：限制酶切割磷酸二酯键后氢键会自动断裂！例如，EcoRⅠ限制酶的识别序列为任务一：阅读教材P71关于限制性内切核酸酶-”分子手术刀“，回答下列问题。限制性内切核酸酶-”分子手术刀“一4.切割后产生的末端有哪些类型？黏性末端任务一：阅读教材P71关于限制性内切核酸酶-”分子手术刀“，回答下列问题。例如，SmaⅠ限制酶的识别序列为从5’→3’方向的识别序列均为CCCGGG，并切断C和G之间的磷酸二酯键5’3’5’3’中轴线限制性内切核酸酶-”分子手术刀“一4.切割后产生的末端有哪些类型？黏性末端任务一：阅读教材P71关于限制性内切核酸酶-”分子手术刀“，回答下列问题。例如，SmaⅠ限制酶的识别序列为从5’→3’方向的识别序列均为CCCGGG，并切断C和G之间的磷酸二酯键5’3’5’3’平末端当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。3’5’5’3’平末端限制性内切核酸酶-”分子手术刀“一任务一：阅读教材P71关于限制性内切核酸酶-”分子手术刀“，回答下列问题。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。例如，EcoRⅠ、SmaⅠ限制酶的识别序列均为6个核苷酸，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。限制性内切核酸酶-”分子手术刀“一限制性内切核酸酶-”分子手术刀“一限制性内切核酸酶-”分子手术刀“①每一限制酶都有各自特异性的识别序列限制性内切核酸酶（限制酶）特点Ⅰ.大多数限制酶识别序列6个核苷酸，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成为什么？限制酶的识别序列越短，酶切位点在基因组中的分布频率就越高若基因组DNA的碱基序列是完全随机排列的，4个碱基的识别序列，平均44即256个碱基就会出现一次一限制性内切核酸酶-”分子手术刀“一限制性内切核酸酶-”分子手术刀“①每一限制酶都有各自特异性的识别序列限制性内切核酸酶（限制酶）特点Ⅱ.回文结构/回文序列回文序列特点：以中线为纵轴，一侧核苷酸序列以横线为轴旋转180°后，纵轴两侧的序列成左右对称，称为旋转对称。一限制性内切核酸酶-”分子手术刀“①每一限制酶都有各自特异性的识别序列限制性内切核酸酶（限制酶）特点Ⅱ.回文结构/回文序列识别序列的一条链从左往右的碱基序列和另一条链从右往左的碱基序列相同即两条链从5‘--3’的碱基序列相同一限制性内切核酸酶-”分子手术刀“问题2：尝试写出EcoRⅠ、BamHⅠ、SmaⅠ、AluⅠ限制酶酶切后的结果一限制性内切核酸酶-”分子手术刀“EcoRⅠ3’-CTTAA5’-GAATTC-3’G-5’读法:5’向3’黏性末端BamHⅠ3’-CCTAG5’-GGATCC-3’G-5’黏性末端SmaⅠ3’-GGG5’-CCCGGG-3’CCC-5’平末端AluⅠ3’-TCGG5’-AGCT-3’-5’黏性末端一限制性内切核酸酶-”分子手术刀“ATGCATATGCGCGCATTATA5’3’3’5’ATGCATATGCGCGCATTATA5’3’3’5’AAAGCGCTTTA3’5’5’3’AATTGCAATA5’3’GC3’5’AGCCTTTA3’GC5’5’3’AEcoRⅠEcoRⅠATGCTTGCA5’3’3’5’A一限制性内切核酸酶-”分子手术刀“酶切后获得的黏性末端不但互补而且相同，因此用相同的限制酶处理得到的黏性末端之间可以通过碱基互补配对关系相互“识别”ATGCATATGCGCGCATTATA5’3’3’5’3’5’5’3’ATATGCGCCATATTATA5’3’3’GCGC5’3’5’5’3’ATTGCAATA5’3’GCAGCGCTTTA3’5’A一限制性内切核酸酶-”分子手术刀“问题3：比较BamHⅠ、BgIⅡ限制酶酶切后的结果，进行比较。3’-CCTAG5’-GGATCC-3’G-5’3’-TCTAG5’-AGATCT-3’A-5’一限制性内切核酸酶-”分子手术刀“问题4：BamHⅠ、BgIⅡ等几种限制酶的识别序列和切割位点均不同，但能切出相同的DNA黏性末端（序列5’-GATC-3’）3’-CCTAG5’-GGATCC-3’G-5’3’-TCTAG5’-AGATCT-3’A-5’这样切割产生的黏性末端是否可以通过酶相连？黏性末端相连后，原来的限制酶是否还能对其识别并切割？3’-CCTAG5’-GGATCT-3’A-5’可以相连，有相同的黏性末端，碱基可以互补配对不同酶切割的DNA产生的相同黏性末端连接后形成的新位点即所谓杂交位点，一般不能被原来的限制酶各自识别一限制性内切核酸酶-”分子手术刀“拓展①同尾酶：不同限制酶识别不同序列，产生相同的黏性末端3’-CTAG5’-GATC-3’-5’3’-CCTAG5’-GGATCC-3’G-5’3’-CTAG5’-GATCC-3’G-5’Sau3AⅠBamHⅠ识别X一限制性内切核酸酶-”分子手术刀“拓展②同裂酶：不同限制酶识别相同序列，产生相同的黏性末端不同限制酶识别相同序列，不同位点切割，产生不同的黏性末端一限制性内切核酸酶-”分子手术刀“拓展同裂酶其实是一种酶，但是由于限制酶是根据来源命名的，如BamHⅠ和BstⅠ的识别序列和切割位点都是GGATCC一限制性内切核酸酶-”分子手术刀“AATTC------G-----------G-----CTTAA目的基因-----G-----CTTAAAATTC------G------4个黏性末端一限制性内切核酸酶-”分子手术刀“1个片段2个片段二DNA连接酶-“分子缝合针”任务二：阅读教材P72关于DNA连接酶-“分子缝合针”，回答下列问题。1.DNA连接酶的作用什么？2.DNA连接酶连接形成什么化学键？3.E.coliDNA连接片段具有什么特点？4.T4DNA连接酶连接的片段具有什么特点？5.黏性末端和平末端的连接效率哪个高？原因是什么？1.DNA连接酶的作用什么？连接的对象具有什么特点？2.DNA连接酶连接形成什么化学键？3.E.coliDNA连接片段具有什么特点？连接两个DNA片段磷酸二酯键互补的黏性末端、平末端任务二：阅读教材P72关于DNA连接酶-“分子缝合针”，回答下列问题。二DNA连接酶-“分子缝合针”两个片段之间碱基能够互补配对5.黏性末端和平末端的连接效率哪个高？原因是什么？黏性末端效率较高，4.T4DNA连接酶连接的片段具有什么特点？互补的黏性末端、平末端平末端没有氢键的连接和维持。思考：与核酸相关酶，你知道哪些？二DNA连接酶-“分子缝合针”任务二：阅读教材P72关于DNA连接酶-“分子缝合针”，回答下列问题。小结：与核酸相关酶DNA（水解）酶限制性内切核酸酶二DNA连接酶-“分子缝合针”使DNA水解成基本单位--脱氧核苷酸对特定序列的特定位点进行切割，可得到DNA片段，是基因工程的重要工具酶DNA聚合酶在DNA复制时利用母链为模板，将脱氧核苷酸连接成单链DNA连接酶连接被限制酶切割形成的黏性末端或平末端，是基因工程的重要工具酶解旋酶DNA复制时将DNA解旋，需要消耗能量自然形成遵循碱基互补配对原则二DNA连接酶-“分子缝合针”小结：与核酸相关酶二DNA连接酶-“分子缝合针”都是催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键不需要需要双链单链两个DNA片段单个核苷酸加到已存在的核苷酸片段基因表达载体构建DNA复制（扩增）三基因进入受体细胞的载体-“分子运输车”任务三：阅读教材P72关于基因进入受体细胞的载体-“分子运输车”，回答下列问题。1.“分子运输车”通常利用的是什么？2.质粒的本质什么？质粒存在在哪里？3.质粒有什么特点？4.作为“分子运输车”需要什么条件？三三基因进入受体细胞的载体-“分子运输车”任务三：阅读教材P72关于基因进入受体细胞的载体-“分子运输车”，回答下列问题。1.“分子运输车”常利用的是什么？质粒2.质粒的本质什么？质粒存在在哪里？补充：噬菌体、动植物病毒（灭活后使用）环状的DNA分子真核细胞核或原核细胞拟核之外3.质粒有什么特点？双链、一个至多个酶切位点、自我复制4.作为“分子运输车”需要什么条件？三三基因进入受体细胞的载体-“分子运输车”任务三：阅读教材P72关于基因进入受体细胞的载体-“分子运输车”，回答下列问题。4.作为“分子运输车”需要什么条件？Ⅰ、能够在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上目的：使目的基因在受体细胞中稳定地存在（复制）复制的原点：质粒含有控制环状质粒在细菌细胞中复制的基因，称为复制原点（Ori）三三基因进入受体细胞的载体-“分子运输车”任务三：阅读教材P72关于基因进入受体细胞的载体-“分子运输车”，回答下列问题。4.作为“分子运输车”需要什么条件？Ⅱ、具有多个酶切位点，以便与外源基因连接目的：多个酶切位点以便连接外源基因三三基因进入受体细胞的载体-“分子运输车”任务三：阅读教材P72关于基因进入受体细胞的载体-“分子运输车”，回答下列问题。4.作为“分子运输车”需要什么条件？Ⅲ、具有特殊的标记基因目的：便于重组DNA的筛选标记基因通常有①抗生素的抗性基因如：抗氨苄青霉素基因（ampr）、抗四环素基因（tetr)②荧光蛋白基因如：绿色荧光蛋白基因（GFP）、红色荧光蛋白基因（RFP）三基因进入受体细胞的载体-“分子运输车”任务三：阅读教材P72关于基因进入受体细胞的载体-“分子运输车”，回答下列问题。4.作为“分子运输车”需要什么条件？Ⅲ、具有特殊的标记基因目的：便于重组DNA的筛选③生化标记基因如：lacZ(β半乳糖苷酶基因）④营养缺陷型基因如：合成某些氨基酸标记基因通常有①抗生素的抗性基因②荧光蛋白基因三基因进入受体细胞的载体-“分子运输车”含目的基因的DNA片段导入三基因进入受体细胞的载体-“分子运输车”载体携带目的基因导入受体细胞的成功率不高，因此需要筛选出导入目的基因的受体细胞存活并增殖死亡在含有抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞三基因进入受体细胞的载体-“分子运输车”任务三：阅读教材P72关于基因进入受体细胞的载体-“分子运输车”，回答下列问题。在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行人工改造的。例如：酶切位点、抗性基因、复制原点等。三基因进入受体细胞的载体-“分子运输车”三基因进入受体细胞的载体-“分子运输车”胶带胶带三基因进入受体细胞的载体-“分子运输车”讨论：问题1：剪刀和胶条分别代表哪种“分子工具”？剪刀代表限制酶；胶带代表DNA连接酶。问题2：插入DNA片段能称得上一个基因吗？不能，因为基因的长度一般在100个碱基以上三三拓展：目的基因与运载体连接的酶切问题分析思考：目的基因是要与运载体结合的，那如何处理质粒？用相同的限制酶切割目的基因与运载体。产生相同的末端，便于连接。EcoRⅠ酶切后EcoRⅠ酶切后拓展：目的基因与运载体连接的酶切问题分析重组质粒的形成：（1）单酶切割法：思考：将被同一种限制酶切的质粒和目的基因片段混合，加入DNA连接酶，两两连接的产物有几种？EcoRⅠ酶切后EcoRⅠ酶切后×拓展：目的基因与运载体连接的酶切问题分析重组质粒的形成：（1）单酶切割法：单一相同黏性末端存在以下问题:目的基因双向插入载体（即正向或反向）容易出现目的基因的自身环化和载体的自身环化拓展：目的基因与运载体连接的酶切问题分析重组质粒的形成：（2）双酶切割法：使用两种不同的限制酶切同一种DNA分子切割产生的DNA片段的两个末端是不同优点：定向插入目的基因练习获取目的基因和切割载体时，通常使用同种限制酶，目的是为了

。但是使用该方法的缺点是容易发生

以及

，为了避免上述情况发生，可采取的措施是

。产生相同的黏性末端，便于连接目的基因、质粒的自身环化目的基因与质粒的反向连接分别使用两种限制酶取切割目的基因和运载体练习练习练习氨苄青霉素抗性基因四环素抗性基因能够切下目的基因不破坏目的基因至少保留一个完整的标记基因，便于筛选DNA粗提取和鉴定任务四：阅读教材P74-75关于DNA粗提取与鉴定”，回答下列问题。1.DNA和蛋白质如何分开？2.DNA如何鉴定？3.你能归纳DNA提取的步骤吗？4.研磨后取上清液还是沉淀？5.上清液加入预冷95%酒精的目的是？DNA粗提取和鉴定任务四：阅读教材P74-75关于DNA粗提取与鉴定”，回答下列问题。1.DNA和蛋白质如何分开？2.DNA如何鉴定？3.你能归纳DNA提取的步骤吗？DNA、RNA、蛋白质、脂质等的物理性质和化学性质不同DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精，初步分离DNA和蛋白质DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/l的NaCl溶液中DNA+二苯胺试剂蓝色沸水浴取材过滤分离鉴定DNA粗提取和鉴定不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。新鲜洋葱（也可以选择香蕉、菠菜、菜花或猪肝等作为实验材料，提取DNA的方法可能稍有不同）用洋葱做材料，为什么要充分研磨？充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核，不适合；鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。P117DNA粗提取和鉴定SDS（十二烷基疏酸钠）可使蛋白质变性与DNA分离EDTA（乙二胺四乙酸）DNA酶抑制剂，可防止细胞破碎后DNA降解DNATris（三羟甲基氨基甲烷）提供缓冲体系，使DNA在缓冲体系中呈稳定状态研磨液DNA粗提取和鉴定任务四：阅读教材P74-75关于DNA粗提取与鉴定”，回答下列问题。注意：（1）研磨时间不宜太长防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量（2）上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？可能含有核蛋白、多糖等杂质4.研磨后取上清液还是沉淀？上清液(1)研磨的目的破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中(2)研磨时间不宜太长防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量(3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶研磨效果好（有利于充分研磨）(4)研磨不宜太用力（3)低温放置几分钟的作用可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂；任务四：阅读教材P74-75关于DNA粗提取与鉴定”，回答下列问题。5.上清液加入预冷