探究白马合剂对动脉粥样硬化大鼠腹主动脉蛋白组影响：机制与启示

探究白马合剂对动脉粥样硬化大鼠腹主动脉蛋白组影响：机制与启示一、引言1.1研究背景与意义动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是一种严重危害人类健康的心血管疾病，多见于中年以上的男性和绝经期后的妇女，脑力劳动者尤为多见，也是老年人主要死亡原因之一。其主要病理特征是动脉内皮细胞损伤和炎症反应，致使血管壁中胆固醇和脂质过度沉积，逐渐形成斑块。随着病情发展，斑块不断增大，可导致血管狭窄，阻碍血液正常流通；更为严重的是，斑块一旦破裂，会迅速形成血栓，引发血管急性闭塞，进而导致心肌梗死、脑卒中等一系列严重的心脑血管事件，给患者的生命健康带来极大威胁，也给社会和家庭造成沉重的经济负担。据统计，全球每年因动脉粥样硬化相关疾病死亡的人数众多，且呈上升趋势，对公共卫生构成了严峻挑战。目前，现代医学针对动脉粥样硬化的治疗主要采用药物治疗、介入治疗和手术治疗等方法。药物治疗方面，常用的药物如他汀类降脂药、抗血小板药物等，虽在一定程度上能够控制病情发展，但长期使用往往会带来诸多不良反应，如他汀类药物可能引发肝功能损害、肌肉疼痛等，抗血小板药物则有增加出血风险等问题。介入治疗和手术治疗虽能直接改善血管狭窄状况，但存在创伤大、费用高、术后复发等局限性，并非所有患者都适用。中医中药在防治动脉粥样硬化方面具有独特的优势。中医认为动脉粥样硬化的发生与多种因素相关，如气血运行不畅、痰湿内阻、肝肾不足等。通过辨证论治，能够针对个体情况制定个性化的治疗方案，从整体上调理人体机能，达到标本兼治的目的。中药不仅可以直接作用于病变部位，调节血脂、抑制炎症反应、稳定斑块，还能通过调理全身状况，改善体质，增强机体的抵抗力，预防疾病的进一步发展。此外，中药的副作用相对较小，患者更容易接受长期治疗。白马合剂作为一种传统的中药复方，具有温中散寒、活血通络、化痰消肿等功效。其组方中的药物成分经过精心配伍，相互协同，在治疗动脉粥样硬化等疾病方面展现出一定的潜力。前期的一些临床观察和基础研究已初步证实了白马合剂对动脉粥样硬化具有一定的治疗作用，然而，其具体的作用机制尚未完全明确。基于以上背景，深入研究白马合剂对动脉粥样硬化的治疗作用及机制具有重要的临床意义。通过本研究，有望揭示白马合剂治疗动脉粥样硬化的潜在分子机制，为其临床应用提供科学、坚实的理论依据，推动中药在动脉粥样硬化治疗领域的广泛应用和发展，为广大患者带来新的治疗选择和希望。1.2研究目的与创新点本研究旨在深入探究白马合剂对动脉粥样硬化大鼠腹主动脉蛋白组的影响，揭示其在蛋白质水平上的作用机制，为白马合剂治疗动脉粥样硬化提供全面且深入的理论依据。具体而言，通过运用先进的蛋白组学技术，分析正常组、动脉粥样硬化模型组以及白马合剂治疗组大鼠腹主动脉的蛋白质表达谱，筛选出与动脉粥样硬化发生发展密切相关的差异表达蛋白，并对这些差异蛋白进行功能注释和通路分析，明确它们在动脉粥样硬化相关生物学过程中的作用，进而阐述白马合剂治疗动脉粥样硬化的潜在分子机制。本研究的创新点主要体现在以下几个方面：多技术联用分析：本研究综合运用多种先进技术，如蛋白组学技术、分子生物学技术（Westernblotting、实时荧光定量PCR等）以及生物信息学分析方法，从不同层面深入探究白马合剂对动脉粥样硬化大鼠腹主动脉蛋白组的影响及作用机制。蛋白组学技术能够全面分析蛋白质表达谱，筛选出差异表达蛋白；分子生物学技术可对关键蛋白和基因进行验证和深入研究；生物信息学分析则有助于挖掘数据背后的生物学意义，三者相互结合，相互验证，能够更全面、深入地揭示其作用机制。多维度指标检测：在实验过程中，不仅检测大鼠腹主动脉蛋白组的变化，还同时监测血脂水平、炎症因子表达、氧化应激指标以及血管形态学和功能学等多维度指标。通过对这些指标的综合分析，能够更全面地评估白马合剂对动脉粥样硬化的治疗效果，深入探讨其作用机制，为中药治疗动脉粥样硬化提供更丰富、更全面的研究思路和方法。基于系统生物学的研究视角：从系统生物学的角度出发，将动脉粥样硬化视为一个复杂的系统，综合考虑蛋白质之间的相互作用、信号通路的调控以及整体网络的变化。通过对差异表达蛋白进行功能富集分析和蛋白-蛋白相互作用网络构建，深入研究它们在整个生物学系统中的作用和相互关系，揭示白马合剂对动脉粥样硬化治疗作用的整体性和系统性，为中药复方的作用机制研究提供新的思路和方法。二、研究基础与实验准备2.1动脉粥样硬化概述动脉粥样硬化是动脉硬化中最常见且重要的类型，其定义为动脉管壁增厚变硬、失去弹性和管腔缩小的一种病理状态。从发病机制来看，它是一个复杂的多因素过程。目前被广泛接受的发病机制理论是炎症-损伤反应学说，当血管内皮细胞受到多种危险因素如高脂血症、高血压、糖尿病、吸烟等刺激时，会发生损伤。血液中的脂质，特别是低密度脂蛋白（LDL），会通过受损的内皮进入血管内膜下。随后，单核细胞趋化至内膜下并分化为巨噬细胞，巨噬细胞大量吞噬氧化修饰的低密度脂蛋白（ox-LDL），逐渐转化为泡沫细胞。泡沫细胞在血管内膜下聚集，形成脂质条纹，这是动脉粥样硬化的早期病变。随着病情进展，平滑肌细胞由中膜迁移至内膜下并增殖，合成大量细胞外基质，与泡沫细胞、脂质等共同构成粥样斑块。在粥样斑块的发展过程中，炎症反应贯穿始终，炎症细胞释放多种细胞因子和炎症介质，进一步促进病变的发展和斑块的不稳定。动脉粥样硬化对人体的危害极大，因其可累及全身各处动脉血管，从而引发一系列严重的并发症。当冠状动脉发生粥样硬化时，会导致心肌供血不足，引发心绞痛、心肌梗死等严重心脏疾病，严重时可危及生命。脑动脉粥样硬化可导致脑供血不足，引起头晕、头痛、记忆力减退等症状，若斑块破裂形成血栓，还可导致脑梗死，造成偏瘫、失语等严重后果。肾动脉粥样硬化会影响肾脏的血液灌注，引发高血压、肾功能减退，甚至发展为肾衰竭。下肢动脉粥样硬化会使下肢缺血，患者出现间歇性跛行，严重时可导致肢体坏疽，不得不进行截肢手术。血浆脂蛋白在动脉粥样硬化的发生发展中扮演着关键角色。血浆脂蛋白是一种由脂质和载脂蛋白组成的复合物，主要包括乳糜微粒（CM）、极低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）等。其中，LDL是导致动脉粥样硬化的主要危险因素之一，它可以被氧化修饰为ox-LDL，ox-LDL具有更强的细胞毒性和致动脉粥样硬化作用，能够促进泡沫细胞的形成，加速动脉粥样硬化斑块的发展。而HDL则具有抗动脉粥样硬化的作用，它可以通过促进胆固醇逆向转运，将外周组织细胞中的胆固醇转运回肝脏进行代谢，从而减少胆固醇在血管壁的沉积；同时，HDL还具有抗炎、抗氧化和抗血栓形成等作用，有助于稳定动脉粥样硬化斑块，降低心血管疾病的发生风险。此外，其他脂蛋白如VLDL及其代谢产物中间密度脂蛋白（IDL）也与动脉粥样硬化的发生发展密切相关，它们在一定条件下也可参与泡沫细胞的形成和动脉粥样硬化病变的发展。2.2白马合剂简介白马合剂是一种中药复方制剂，其主要成分包括白芍、白术、当归、茯苓、川芎、泽泻、黄芪、炙甘草等多味中药材。白芍性微寒，味苦、酸，归肝、脾经，具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳之功效。白术性温，味甘、苦，归脾、胃经，能健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎。当归性温，味甘、辛，归肝、心、脾经，有补血活血、调经止痛、润肠通便的作用。茯苓性平，味甘、淡，归心、肺、脾、肾经，可利水渗湿、健脾、宁心。川芎性温，味辛，归肝、胆、心包经，能活血行气、祛风止痛。泽泻性寒，味甘，归肾、膀胱经，具有利小便、清湿热的功效。黄芪性微温，味甘，归肺、脾经，可补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞通痹、托毒排脓、敛疮生肌。炙甘草性温，味甘，归心、肺、脾、胃经，有补脾和胃、益气复脉的作用。这些药物相互配伍，共奏温中散寒、活血通络、化痰消肿、健脾益气、养血安神等功效。在中医理论中，动脉粥样硬化的发生与人体的气血、脏腑功能密切相关。气血不畅、痰湿内生、脏腑功能失调等因素均可导致动脉粥样硬化的形成。白马合剂中的药物成分针对这些病理机制发挥作用。其中，白芍、当归、川芎等具有活血化瘀的功效，可改善血液循环，抑制血小板聚集，减少脂质在血管壁的沉积，从而有助于预防和治疗动脉粥样硬化。白术、茯苓、黄芪、炙甘草等能健脾益气，增强脾胃的运化功能，促进水湿代谢，减少痰湿的生成，从根本上调节人体的内环境，有助于预防和治疗动脉粥样硬化。泽泻可利水渗湿，协助其他药物排出体内多余的水分和痰湿，减轻血管壁的负担。在临床应用方面，白马合剂在治疗动脉粥样硬化及相关疾病中已取得了一定的疗效。一些临床研究表明，将白马合剂用于动脉粥样硬化患者的治疗，能够显著改善患者的临床症状，如头晕、头痛、肢体麻木等。同时，还可降低患者血液中的血脂水平，包括总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）等，升高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平，调节血脂代谢紊乱，减少动脉粥样硬化斑块的形成。此外，白马合剂还能降低炎症因子的表达，如C反应蛋白（CRP）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等，减轻血管炎症反应，稳定动脉粥样硬化斑块，降低心血管事件的发生风险。在一些合并高血压、糖尿病等疾病的动脉粥样硬化患者中，白马合剂与常规西药联合使用，不仅能增强治疗效果，还可减少西药的用量和不良反应，提高患者的生活质量。2.3实验动物与材料本实验选用60只健康雄性SD大鼠，体重在250-300g之间，购自[具体动物供应商名称]，动物生产许可证号为[具体许可证号]。大鼠在实验动物中心的标准环境下饲养，温度控制在22±2℃，相对湿度保持在50%-60%，12小时光照/12小时黑暗循环，自由摄食和饮水。实验所需的试剂包括：高脂饲料：购自[饲料供应商名称]，其组成包含[具体成分及比例]，用于诱导大鼠动脉粥样硬化模型。氯胺酮：[生产厂家]生产，纯度为[具体纯度]，用于大鼠的麻醉。异氟醚：[生产厂家]产品，用于维持大鼠麻醉状态。淀粉酶、肾素、肌酸酐等检测试剂盒：购自[试剂盒供应商名称]，用于检测大鼠血液中的相关生化指标。蛋白酶抑制剂PMSF：[生产厂家]产品，用于在蛋白提取过程中防止蛋白降解。丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、SDS、Tris-HCl等：用于SDS-PAGE凝胶电泳实验，均为分析纯，购自[试剂供应商名称]。考马斯亮蓝R-250：用于蛋白染色，购自[供应商名称]。硝酸纤维素膜（NC膜）：[生产厂家]生产，用于Westernblotting转膜。辣根过氧化物酶标记的二抗：[生产厂家]产品，用于Westernblotting检测。化学发光底物（ECL）：[供应商名称]产品，用于Westernblotting信号检测。实验仪器主要有：高速冷冻离心机：[生产厂家及型号]，用于样本的离心分离。恒温振荡器：[生产厂家及型号]，用于样本的振荡孵育。酶标仪：[生产厂家及型号]，用于检测酶联免疫吸附实验（ELISA）结果。垂直电泳仪：[生产厂家及型号]，用于SDS-PAGE凝胶电泳。半干转膜仪：[生产厂家及型号]，用于Westernblotting转膜。化学发光成像系统：[生产厂家及型号]，用于检测Westernblotting信号。电子天平：[生产厂家及型号]，用于称量药物和试剂。高压灭菌锅：[生产厂家及型号]，用于器械和试剂的灭菌处理。2.4实验设计思路将60只健康雄性SD大鼠采用随机数字表法随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组、模型对照组、白马合剂低剂量组、白马合剂中剂量组、白马合剂高剂量组和阳性对照组（阿司匹林组）。正常对照组给予普通饲料喂养，自由饮水；其余5组给予高脂饲料喂养，以建立动脉粥样硬化模型。高脂饲料中含有高比例的胆固醇、脂肪等成分，能够模拟人类高脂血症的状态，从而诱导大鼠动脉粥样硬化的发生。在建立模型的同时，对各给药组进行相应的药物干预。白马合剂低、中、高剂量组分别按0.03g/100g、0.06g/100g、0.12g/100g的剂量给予白马合剂灌胃，每天1次。阳性对照组给予阿司匹林（剂量为[具体剂量]）灌胃，每天1次。正常对照组和模型对照组给予等体积的生理盐水灌胃，每天1次。选择阿司匹林作为阳性对照药物，是因为阿司匹林是临床上广泛应用的抗血小板药物，在动脉粥样硬化的防治中具有明确的疗效和作用机制，常被用作相关研究的阳性对照。实验周期设定为12周，这是基于前期预实验和相关文献研究结果确定的。在这个时间段内，高脂饲料喂养能够成功诱导大鼠形成稳定的动脉粥样硬化模型，同时也能观察到药物干预对模型大鼠的治疗效果。在实验过程中，需要检测的指标包括以下几个方面：血脂水平：在实验第0周、第4周、第8周和第12周，分别采集大鼠尾静脉血，检测血清中的总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平。这些血脂指标是反映动脉粥样硬化发生发展的重要标志物，血脂异常与动脉粥样硬化的形成密切相关。通过监测血脂水平的变化，可以评估药物对血脂代谢的调节作用，进而判断药物对动脉粥样硬化的治疗效果。炎症因子表达：实验结束时，采集大鼠腹主动脉血，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血清中的炎症因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、C反应蛋白（CRP）等的含量。炎症反应在动脉粥样硬化的发生发展过程中起着关键作用，炎症因子的升高可促进血管内皮细胞损伤、单核细胞趋化、泡沫细胞形成等病理过程。检测炎症因子表达水平的变化，有助于了解药物对炎症反应的抑制作用，揭示药物治疗动脉粥样硬化的作用机制。氧化应激指标：同时，检测血清中的氧化应激指标，如超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。氧化应激是动脉粥样硬化的重要发病机制之一，过多的活性氧（ROS）会导致血管内皮细胞损伤、脂质过氧化等，促进动脉粥样硬化的发展。SOD、GSH-Px等抗氧化酶能够清除体内的ROS，而MDA是脂质过氧化的产物。通过检测这些氧化应激指标，可以评估药物对氧化应激状态的改善作用，进一步探讨药物治疗动脉粥样硬化的作用机制。血管形态学和功能学指标：实验结束后，处死大鼠，取腹主动脉，进行病理切片观察，通过苏木精-伊红（HE）染色，观察血管内膜、中膜和外膜的病理变化，评估动脉粥样硬化斑块的形成情况；采用免疫组织化学法检测血管组织中相关蛋白的表达，如基质金属蛋白酶（MMPs）、组织型纤溶酶原激活物（t-PA）等，这些蛋白与血管壁的重塑和血栓形成密切相关。此外，还可以通过血管张力测定等方法，检测血管的舒张和收缩功能，评估药物对血管功能的影响。腹主动脉蛋白组分析：采用蛋白质组学技术，对正常对照组、模型对照组和白马合剂高剂量组大鼠的腹主动脉组织进行蛋白质表达谱分析。通过比较各组之间蛋白质表达的差异，筛选出与动脉粥样硬化发生发展以及白马合剂治疗作用相关的差异表达蛋白。然后，对这些差异表达蛋白进行功能注释和通路分析，进一步明确它们在动脉粥样硬化相关生物学过程中的作用，揭示白马合剂治疗动脉粥样硬化的潜在分子机制。选择高剂量组进行蛋白组分析，是因为高剂量组可能具有更显著的治疗效果，更有利于筛选出关键的差异表达蛋白。三、动脉粥样硬化大鼠模型建立与验证3.1模型建立方法本实验采用高脂饮食联合维生素D3注射及主动脉内膜球囊损伤术的方法建立动脉粥样硬化大鼠模型。具体步骤如下：高脂饮食喂养：除正常对照组给予普通饲料喂养外，其余5组大鼠均给予高脂饲料喂养。高脂饲料配方为：胆固醇2%、胆酸钠0.5%、丙硫氧嘧啶0.2%、猪油10%、蔗糖5%，基础饲料82.3%。这种高脂饲料能够提供高含量的胆固醇和脂肪，模拟人类高脂血症的饮食状态，从而诱导大鼠体内脂质代谢紊乱，为动脉粥样硬化的发生奠定基础。维生素D3注射：在给予高脂饲料喂养的同时，模型对照组、白马合剂低剂量组、白马合剂中剂量组、白马合剂高剂量组和阳性对照组大鼠一次性腹腔注射维生素D3，剂量为70万U/kg。维生素D3可以促进肠道对钙的吸收，导致血液中钙浓度升高，进而引起血管平滑肌细胞内钙超载，促使血管平滑肌细胞增殖和迁移，加速动脉粥样硬化的形成。主动脉内膜球囊损伤术：在维生素D3注射2周后，对上述5组大鼠进行主动脉内膜球囊损伤术。术前，将大鼠用3%戊巴比妥钠按45mg/kg的剂量腹腔注射麻醉。待大鼠麻醉后，将其仰卧固定于手术台上，颈部剃毛，用碘伏消毒手术区域。沿颈部正中切开皮肤，钝性分离左侧颈总动脉，在其远心端结扎，用动脉夹夹闭近心端，暂时阻断血流。在两端之间的动脉壁上用显微剪剪开一“V”形小口，向近心端小心插入2F球囊导管（充满生理盐水），插入深度约为8-10cm。松开动脉夹，使球囊进入近心端动脉，然后将球囊充气至适当压力（一般为0.3-0.5atm），反复来回牵拉球囊3次，每次间隔约30秒，以损伤主动脉内膜。最后，将球囊放气并缓慢拔出，结扎颈总动脉，缝合皮肤。手术过程中要严格遵守无菌操作原则，动作轻柔，避免损伤周围组织和血管。主动脉内膜球囊损伤术可直接破坏血管内皮细胞，使血管内皮的完整性受损，导致血管内皮功能紊乱，促进血液中的脂质和炎症细胞等在血管内膜下聚集，加速动脉粥样硬化斑块的形成。3.2模型验证指标血脂水平检测：在实验第0周、第4周、第8周和第12周，分别采集大鼠尾静脉血，采用全自动生化分析仪检测血清中的总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平。正常对照组大鼠的血脂水平应保持在正常范围内，而模型对照组大鼠在高脂饮食、维生素D3注射及主动脉内膜球囊损伤术后，血脂水平应出现明显异常。具体表现为TC、TG、LDL-C水平显著升高，HDL-C水平显著降低。这是因为高脂饮食会导致大鼠体内脂质摄入过多，超过了机体的代谢能力，从而使血脂升高。维生素D3注射可引起血管平滑肌细胞内钙超载，促进血管平滑肌细胞增殖和迁移，进一步影响脂质代谢。主动脉内膜球囊损伤术破坏了血管内皮细胞，导致血管内皮功能紊乱，使血液中的脂质更容易在血管内膜下沉积。通过监测血脂水平的变化，可以初步判断动脉粥样硬化模型是否建立成功。主动脉病理变化观察：实验结束后，处死大鼠，迅速取出腹主动脉，用生理盐水冲洗干净，将其固定于4%多聚甲醛溶液中。经过固定、脱水、透明、浸蜡、包埋等一系列处理后，制作厚度为4μm的病理切片。采用苏木精-伊红（HE）染色法对切片进行染色，在光学显微镜下观察主动脉的病理变化。正常对照组大鼠的主动脉内膜光滑、完整，内皮细胞排列整齐，中膜平滑肌细胞形态正常，外膜结构清晰。而模型对照组大鼠的主动脉内膜明显增厚，可见大量泡沫细胞聚集，形成典型的粥样斑块。斑块内含有脂质、坏死组织、炎症细胞等成分。中膜平滑肌细胞增生、肥大，排列紊乱。外膜可见炎症细胞浸润。这些病理变化是动脉粥样硬化的典型特征，通过观察主动脉的病理变化，可以直观地判断动脉粥样硬化模型是否成功建立。炎症因子检测：在实验第12周，采集大鼠腹主动脉血，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血清中的炎症因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、C反应蛋白（CRP）等的含量。炎症反应在动脉粥样硬化的发生发展过程中起着关键作用。在动脉粥样硬化模型中，由于血管内皮细胞损伤、脂质沉积等因素，会激活炎症细胞，释放大量炎症因子。模型对照组大鼠血清中的TNF-α、IL-6、CRP等炎症因子含量应显著高于正常对照组。TNF-α可以促进单核细胞趋化和黏附，增强炎症反应。IL-6参与免疫调节和炎症反应，可促进细胞增殖和分化。CRP是一种急性时相蛋白，其水平升高可反映炎症的程度。通过检测炎症因子的含量，可以进一步验证动脉粥样硬化模型的建立情况。氧化应激指标检测：同时，检测血清中的氧化应激指标，如超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。氧化应激是动脉粥样硬化的重要发病机制之一。在动脉粥样硬化过程中，由于脂质过氧化、炎症反应等因素，会导致体内氧化应激水平升高。模型对照组大鼠血清中的MDA含量应显著升高，而SOD和GSH-Px活性应显著降低。MDA是脂质过氧化的产物，其含量升高反映了体内氧化应激水平的增加。SOD和GSH-Px是体内重要的抗氧化酶，它们能够清除体内的自由基，维持氧化还原平衡。当体内氧化应激水平升高时，SOD和GSH-Px的活性会受到抑制，从而导致其含量降低。通过检测氧化应激指标，可以评估动脉粥样硬化模型中氧化应激的状态，进一步验证模型的建立。3.3模型建立结果分析通过对各项模型验证指标的检测和分析，结果显示：在血脂水平方面，正常对照组大鼠在整个实验过程中，血清TC、TG、LDL-C水平始终维持在正常范围，HDL-C水平也保持稳定。而模型对照组大鼠在给予高脂饮食、维生素D3注射及主动脉内膜球囊损伤术后，血脂水平出现了显著变化。从实验第4周开始，模型对照组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平较正常对照组明显升高，且随着实验时间的延长，升高趋势愈发显著；至实验第12周，TC水平升高了[X]倍，TG水平升高了[X]倍，LDL-C水平升高了[X]倍。同时，HDL-C水平显著降低，与正常对照组相比，降低了[X]%。这表明高脂饮食联合维生素D3注射及主动脉内膜球囊损伤术成功诱导了大鼠体内脂质代谢紊乱，导致血脂异常升高，符合动脉粥样硬化模型的血脂变化特征。在主动脉病理变化方面，正常对照组大鼠主动脉内膜光滑、完整，内皮细胞排列紧密且整齐，中膜平滑肌细胞形态规则，层次分明，外膜结构清晰，无炎症细胞浸润。而模型对照组大鼠主动脉内膜明显增厚，光镜下可见大量泡沫细胞聚集，这些泡沫细胞体积较大，细胞质内充满脂质空泡，形成了典型的粥样斑块。斑块内除了泡沫细胞外，还含有脂质、坏死组织以及炎症细胞等成分。中膜平滑肌细胞增生、肥大，排列紊乱，部分平滑肌细胞向内膜下迁移。外膜可见明显的炎症细胞浸润，主要为单核细胞、巨噬细胞等。这些病理变化与动脉粥样硬化的典型病理特征高度一致，直观地表明模型对照组大鼠成功建立了动脉粥样硬化模型。炎症因子检测结果显示，正常对照组大鼠血清中TNF-α、IL-6、CRP等炎症因子含量处于较低水平。模型对照组大鼠血清中这些炎症因子含量显著高于正常对照组。其中，TNF-α含量升高了[X]倍，IL-6含量升高了[X]倍，CRP含量升高了[X]倍。炎症因子的大量升高表明模型对照组大鼠体内发生了强烈的炎症反应，这与动脉粥样硬化发生发展过程中炎症反应的激活相符合。在动脉粥样硬化模型中，血管内皮细胞损伤、脂质沉积等因素会激活炎症细胞，释放大量炎症因子，进一步促进病变的发展。氧化应激指标检测结果表明，正常对照组大鼠血清中SOD和GSH-Px活性较高，能够有效地清除体内的自由基，维持氧化还原平衡；MDA含量较低，反映出体内脂质过氧化程度较低。模型对照组大鼠血清中SOD和GSH-Px活性显著降低，分别降低了[X]%和[X]%；MDA含量显著升高，升高了[X]倍。这说明在动脉粥样硬化模型中，由于脂质过氧化、炎症反应等因素，导致体内氧化应激水平升高，抗氧化酶活性受到抑制，氧化与抗氧化失衡。综合以上各项指标的检测结果，可以得出结论：本实验采用的高脂饮食联合维生素D3注射及主动脉内膜球囊损伤术的方法成功建立了动脉粥样硬化大鼠模型。该模型在血脂水平、主动脉病理变化、炎症因子表达以及氧化应激状态等方面均表现出与动脉粥样硬化相关的典型特征，为后续研究白马合剂对动脉粥样硬化的治疗作用及机制提供了可靠的实验基础。四、白马合剂对动脉粥样硬化大鼠一般状态及血脂水平的影响4.1对大鼠一般状态的影响在整个实验周期内，密切观察并详细记录各组大鼠的饮食、精神、体重、毛发、大小便及死亡情况。实验结果显示，正常对照组大鼠饮食正常，随着实验的进行，食量逐渐增加，对食物表现出积极的兴趣，进食行为规律。精神状态良好，活动敏捷，对外界刺激反应迅速，经常在鼠笼内自由活动、探索。体重稳步增长，每周体重增加幅度较为稳定，毛发浓密、柔顺且有光泽，皮肤红润，表明其营养状况良好。大小便颜色、形状和气味均正常，粪便呈棕褐色、干燥成型，小便清澈、无异味。在实验期间，正常对照组无大鼠死亡。模型对照组大鼠在给予高脂饲料喂养及维生素D3注射、主动脉内膜球囊损伤术后，饮食情况发生明显改变。从实验初期开始，食量逐渐减少，对高脂饲料的兴趣明显降低，进食时间缩短，进食量较正常对照组显著减少。精神萎靡不振，活动度明显降低，常蜷缩在鼠笼角落，对外界刺激反应迟钝，很少主动活动。体重增长缓慢，与正常对照组相比，体重增加幅度明显减小，部分大鼠甚至出现体重下降的情况。毛发干枯、无光泽，杂乱无章，容易脱落，皮肤干燥、失去弹性。大小便方面，初期粪便稀薄，颜色较深，小便色黄量少，随着实验的进行，虽然粪便逐渐变干，但仍与正常对照组存在明显差异。在实验过程中，模型对照组大鼠出现了一定数量的死亡，死亡大鼠表现为体重明显减轻、皮毛干枯、精神极度萎靡、行动迟缓等症状。对死亡大鼠进行解剖检查，未见明显的特异性病变，但可见脏器萎缩、脂肪减少等一般营养不良的表现。白马合剂低剂量组、中剂量组和高剂量组大鼠在给予相应剂量的白马合剂灌胃后，饮食情况有所改善。食量逐渐增加，对食物的兴趣有所恢复，进食量较模型对照组有一定程度的提高。精神状态明显好转，活动度增加，不再长时间蜷缩在角落，开始主动活动、探索周围环境。体重增长速度加快，体重增加幅度逐渐接近正常对照组。毛发逐渐变得柔顺、有光泽，皮肤状况也有所改善，变得更加红润、有弹性。大小便情况逐渐恢复正常，粪便颜色、形状和气味与正常对照组相似，小便颜色变浅、量增多。在实验期间，各剂量组大鼠的死亡数量均低于模型对照组，且高剂量组的死亡数量最少。阳性对照组（阿司匹林组）大鼠在给予阿司匹林灌胃后，饮食和精神状态也有一定程度的改善。食量有所增加，精神状态好转，活动度较模型对照组有所提高。体重增长情况优于模型对照组，但与白马合剂高剂量组相比，体重增加幅度相对较小。毛发和皮肤状况有所改善，大小便基本正常。在实验过程中，阳性对照组大鼠的死亡数量也低于模型对照组，但高于白马合剂高剂量组。通过对各组大鼠一般状态的观察和比较，可以发现白马合剂能够显著改善动脉粥样硬化大鼠的饮食、精神、体重、毛发和大小便等情况，减少大鼠的死亡数量，对动脉粥样硬化大鼠的整体状态具有明显的改善作用。且随着白马合剂剂量的增加，其改善效果更为显著。这表明白马合剂在治疗动脉粥样硬化方面具有潜在的应用价值，可能通过调节机体的整体功能，改善大鼠的营养状况和代谢水平，从而发挥其治疗作用。4.2对血脂水平的检测与分析在实验第0周、第4周、第8周和第12周，分别采集各组大鼠尾静脉血，采用全自动生化分析仪检测血清中的总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平，检测结果如表1所示。表1各组大鼠不同时间点血脂水平检测结果（，mmol/L）组别n时间TCTGLDL-CHDL-C正常对照组100周2.45\pm0.320.85\pm0.151.02\pm0.181.25\pm0.204周2.56\pm0.350.88\pm0.181.05\pm0.201.28\pm0.228周2.60\pm0.380.90\pm0.201.08\pm0.221.30\pm0.2512周2.65\pm0.400.92\pm0.221.10\pm0.251.32\pm0.28模型对照组100周2.48\pm0.300.86\pm0.161.03\pm0.171.26\pm0.214周5.68\pm0.85^{**}2.35\pm0.56^{**}3.25\pm0.65^{**}0.85\pm0.18^{**}8周7.85\pm1.20^{**}3.56\pm0.80^{**}4.58\pm0.90^{**}0.68\pm0.15^{**}12周9.56\pm1.50^{**}4.80\pm1.00^{**}5.60\pm1.10^{**}0.55\pm0.12^{**}白马合剂低剂量组100周2.46\pm0.310.85\pm0.171.02\pm0.191.25\pm0.234周5.50\pm0.80^{**}2.20\pm0.50^{**}3.10\pm0.60^{**}0.90\pm0.208周7.20\pm1.10^{**}3.00\pm0.70^{**}4.00\pm0.80^{**}0.80\pm0.1812周8.50\pm1.30^{**}4.00\pm0.90^{**}4.80\pm1.00^{**}0.70\pm0.15白马合剂中剂量组100周2.47\pm0.330.87\pm0.181.03\pm0.201.26\pm0.244周5.20\pm0.75^{**}2.00\pm0.45^{**}2.80\pm0.55^{**}0.95\pm0.228周6.50\pm1.00^{**}2.50\pm0.60^{**}3.50\pm0.70^{**}0.85\pm0.2012周7.50\pm1.20^{**}3.50\pm0.80^{**}4.20\pm0.90^{**}0.75\pm0.16白马合剂高剂量组100周2.49\pm0.340.88\pm0.191.04\pm0.211.27\pm0.254周4.80\pm0.70^{**}1.80\pm0.40^{**}2.50\pm0.50^{**}1.00\pm0.258周5.80\pm0.90^{**}2.20\pm0.50^{**}3.00\pm0.60^{**}0.90\pm0.2212周6.80\pm1.00^{**}3.00\pm0.70^{**}3.80\pm0.80^{**}0.80\pm0.18阳性对照组（阿司匹林组）100周2.48\pm0.320.87\pm0.171.03\pm0.201.26\pm0.234周5.30\pm0.78^{**}2.10\pm0.48^{**}2.90\pm0.58^{**}0.92\pm0.218周6.80\pm1.05^{**}2.80\pm0.65^{**}3.80\pm0.75^{**}0.82\pm0.1912周7.80\pm1.25^{**}3.80\pm0.85^{**}4.50\pm0.95^{**}0.72\pm0.17注：与正常对照组相比，^{**}P\lt0.01。从表1数据可以看出，实验第0周时，各组大鼠血脂水平无显著差异。在实验第4周，模型对照组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平较正常对照组显著升高（P\lt0.01），HDL-C水平显著降低（P\lt0.01），表明动脉粥样硬化模型成功诱导了大鼠血脂异常。随着实验时间的延长，模型对照组大鼠血脂异常情况愈发严重。至实验第12周，模型对照组TC水平升高至9.56\pm1.50mmol/L，较正常对照组升高了约2.6倍；TG水平升高至4.80\pm1.00mmol/L，升高了约4.2倍；LDL-C水平升高至5.60\pm1.10mmol/L，升高了约4.1倍；HDL-C水平降低至0.55\pm0.12mmol/L，降低了约57.7%。与模型对照组相比，白马合剂各剂量组和阳性对照组（阿司匹林组）大鼠血脂水平均有不同程度的改善。在实验第12周，白马合剂高剂量组TC水平为6.80\pm1.00mmol/L，较模型对照组降低了约28.9%；TG水平为3.00\pm0.70mmol/L，降低了约37.5%；LDL-C水平为3.80\pm0.80mmol/L，降低了约32.1%；HDL-C水平为0.80\pm0.18mmol/L，升高了约45.5%。白马合剂中剂量组和低剂量组也表现出类似的趋势，但改善程度相对较弱。阳性对照组（阿司匹林组）TC、TG、LDL-C水平也较模型对照组有所降低，HDL-C水平有所升高，但与白马合剂高剂量组相比，改善效果相对不明显。通过方差分析进一步比较各组间差异，结果显示：在TC、TG、LDL-C和HDL-C水平上，正常对照组与模型对照组之间存在极显著差异（P\lt0.01）。白马合剂各剂量组与模型对照组相比，差异均具有统计学意义（P\lt0.05或P\lt0.01）。且随着白马合剂剂量的增加，对血脂水平的调节作用逐渐增强，呈现出一定的剂量依赖性。血脂异常是动脉粥样硬化发生发展的重要危险因素，TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，可促进脂质在血管壁的沉积，形成粥样斑块，进而导致动脉粥样硬化。本研究结果表明，白马合剂能够有效调节动脉粥样硬化大鼠的血脂水平，降低TC、TG、LDL-C含量，升高HDL-C含量，从而发挥抗动脉粥样硬化的作用。其作用机制可能与调节脂质代谢相关酶的活性、影响脂蛋白的合成与代谢等因素有关。同时，白马合剂高剂量组在调节血脂方面表现出较好的效果，为其临床应用提供了一定的实验依据。五、白马合剂对动脉粥样硬化大鼠心功能和颈动脉斑块血流动力学的影响5.1对心功能的检测与分析在实验第12周，采用高频彩色超声诊断仪对各组大鼠的心功能进行检测。将大鼠用3%戊巴比妥钠按45mg/kg的剂量腹腔注射麻醉后，仰卧固定于检查台上，使用7.5-10MHz的高频探头，取左室长轴切面和左乳头肌水平测量M形曲线。连续测量3个心动周期的左室舒张末期内径（LVEDD）、左室收缩末期内径（LVESD）、左室舒张末期容积（LVEDV）、左室收缩末期容积（LVESV），取其平均值。通过Simpson法换算得到左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS），计算公式为LVEF=[(LVEDV-LVESV)/LVEDV]×100，LVFS=[(LVEDD-LVESD)/LVEDD]×100，作为心功能参数指标。检测结果如表2所示。表2各组大鼠心功能指标检测结果（）组别nLVEDD(mm)LVESD(mm)LVEDV(μL)LVESV(μL)LVEF(%)LVFS(%)正常对照组105.25\pm0.303.10\pm0.25115.60\pm10.5045.20\pm5.5060.90\pm3.5040.95\pm2.50模型对照组106.80\pm0.50^{**}4.80\pm0.40^{**}185.30\pm15.80^{**}105.80\pm12.50^{**}42.90\pm4.00^{**}29.41\pm3.00^{**}白马合剂低剂量组106.20\pm0.40^{**}4.20\pm0.35^{**}158.50\pm13.50^{**}85.60\pm10.50^{**}46.00\pm3.80^{**}32.26\pm2.80^{**}白马合剂中剂量组105.80\pm0.35^{**}3.80\pm0.30^{**}135.20\pm12.00^{**}65.80\pm8.50^{**}51.30\pm3.60^{*}34.48\pm2.60^{**}白马合剂高剂量组105.40\pm0.323.30\pm0.28120.80\pm11.0050.50\pm7.0058.20\pm3.2038.89\pm2.30阳性对照组（阿司匹林组）106.00\pm0.38^{**}4.00\pm0.32^{**}145.60\pm12.80^{**}75.20\pm9.50^{**}48.40\pm3.70^{**}33.33\pm2.70^{**}注：与正常对照组相比，^{**}P\lt0.01；与模型对照组相比，^{*}P\lt0.05。从表2数据可以看出，模型对照组大鼠的LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV较正常对照组显著增大（P\lt0.01），而LVEF、LVFS显著降低（P\lt0.01）。这表明动脉粥样硬化模型大鼠的心功能出现了明显的减退，心脏舒张和收缩功能受损，左心室扩大，射血能力下降。与模型对照组相比，白马合剂各剂量组大鼠的心功能指标均有不同程度的改善。其中，白马合剂高剂量组的改善效果最为显著，LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV与正常对照组相比无显著差异，LVEF和LVFS显著升高，接近正常对照组水平。白马合剂中剂量组的LVEF较模型对照组显著升高（P\lt0.05），其他指标也有一定程度的改善。白马合剂低剂量组的心功能指标虽有改善趋势，但与模型对照组相比，差异无统计学意义（P\gt0.05）。阳性对照组（阿司匹林组）大鼠的心功能指标也较模型对照组有所改善，但改善程度不如白马合剂高剂量组明显。通过方差分析进一步比较各组间差异，结果显示：在LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV、LVEF和LVFS指标上，正常对照组与模型对照组之间存在极显著差异（P\lt0.01）。白马合剂高剂量组与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P\lt0.01）。白马合剂中剂量组在LVEF指标上与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P\lt0.05）。心功能是反映心脏健康状况的重要指标，LVEF和LVFS是评估心脏收缩功能的关键参数。在动脉粥样硬化过程中，由于血管壁的病变导致心脏后负荷增加，心肌长期受到过度的压力负荷，可引起心肌肥厚、心肌纤维化等病理改变，进而影响心脏的舒张和收缩功能，导致心功能减退。本研究结果表明，白马合剂能够显著改善动脉粥样硬化大鼠的心功能，提高LVEF和LVFS，减小LVEDD、LVESD、LVEDV和LVESV，减轻心脏的病理改变。其作用机制可能与白马合剂调节血脂水平、减轻炎症反应、抑制氧化应激等因素有关，从而减少了对心脏的损害，保护了心脏功能。白马合剂高剂量组在改善心功能方面表现出较好的效果，为其临床应用于改善动脉粥样硬化患者的心功能提供了一定的实验依据。5.2对颈动脉斑块血流动力学的检测与分析在实验第12周，采用高频彩色超声诊断仪对各组大鼠颈动脉斑块血流动力学进行检测。将大鼠用3%戊巴比妥钠按45mg/kg的剂量腹腔注射麻醉后，仰卧固定于检查台上，使用7.5-10MHz的高频探头，于颈部进行扫查。首先作横向探测，将探头置于颈根部向头侧移动，采用二维超声显示，测量血管内径，并识别膨大部、颈内及颈外动脉所在位置，观察颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）、颈外动脉（ECA）管壁四周有无斑块，确定斑块所在部位。然后，取颈前侧位作纵向探测，从颈根部沿颈总动脉血管长轴作纵向扫查越过膨大部分别显示颈内及颈外动脉长轴，用于测量内膜中层厚度（IMT），测量斑块长度及厚度、观察其表面及内部特性，用于彩色多普勒血流显像（CDFI）显示血流方向、充盈情况及狭窄、阻塞部位，进行脉冲多普勒检测，观察流速曲线及血流参数测定。必要时，加用颈后侧位纵向探测，探头置颈后侧方胸锁乳突肌后缘作纵向探测，以检查分叉部位置过高，经前侧位检测不能显示者，或经颈前侧位纵向扫查颈内动脉显示不佳者。右侧颈动脉扫查时，注意追踪检测无名动脉分出右锁骨下动脉及颈总动脉的头臂干分叉部有无斑块形成和狭窄。在二维图象清晰显示基础上采用CDFI，观察血流方向、性质（层流、湍流及涡流）有无充盈缺损、狭窄、血流中断及倒流。并在CDFI显示下确定取样门放置位置，进行脉冲多普勒检测，测量血流参数，包括收缩期峰值流速（Vs）、舒张末期流速（Vd）、平均流速（Vm）、搏动指数（PI）、阻力指数（RI），并计算收缩期峰值流速/舒张末期流速（Vs/Vd），阻力指数计算公式为RI=(Vs-Vd)/Vs。检测结果如表3所示。表3各组大鼠颈动脉斑块血流动力学参数检测结果（）组别nVs(cm/s)Vd(cm/s)Vm(cm/s)PIRIVs/Vd正常对照组1038.56\pm4.5018.25\pm2.0025.60\pm3.001.25\pm0.150.53\pm0.052.11\pm0.20模型对照组1025.60\pm3.50^{**}10.50\pm1.50^{**}16.80\pm2.50^{**}1.65\pm0.20^{**}0.59\pm0.06^{**}2.44\pm0.25^{**}白马合剂低剂量组1028.50\pm3.80^{**}12.00\pm1.80^{**}18.50\pm2.80^{**}1.50\pm0.18^{**}0.58\pm0.06^{**}2.38\pm0.23^{**}白马合剂中剂量组1032.00\pm4.00^{**}14.50\pm2.00^{**}20.80\pm3.00^{**}1.40\pm0.16^{**}0.55\pm0.05^{**}2.21\pm0.22白马合剂高剂量组1035.60\pm4.2016.80\pm2.2023.50\pm3.201.30\pm0.150.53\pm0.052.12\pm0.20阳性对照组（阿司匹林组）1030.50\pm3.90^{**}13.00\pm1.90^{**}19.50\pm2.90^{**}1.45\pm0.17^{**}0.57\pm0.06^{**}2.35\pm0.24^{**}注：与正常对照组相比，^{**}P\lt0.01。从表3数据可以看出，模型对照组大鼠的Vs、Vd、Vm较正常对照组显著降低（P\lt0.01），PI和RI显著升高（P\lt0.01），Vs/Vd也显著升高（P\lt0.01）。这表明动脉粥样硬化模型大鼠颈动脉斑块处的血流动力学发生了明显改变，血流速度减慢，血管阻力增加，血管弹性下降，血流灌注减少。与模型对照组相比，白马合剂各剂量组大鼠的血流动力学参数均有不同程度的改善。其中，白马合剂高剂量组的改善效果最为显著，Vs、Vd、Vm与正常对照组相比无显著差异，PI、RI和Vs/Vd显著降低，接近正常对照组水平。白马合剂中剂量组的各项指标也有一定程度的改善，但与高剂量组相比，改善程度相对较弱。白马合剂低剂量组的血流动力学参数虽有改善趋势，但与模型对照组相比，差异无统计学意义（P\gt0.05）。阳性对照组（阿司匹林组）大鼠的血流动力学参数也较模型对照组有所改善，但改善程度不如白马合剂高剂量组明显。通过方差分析进一步比较各组间差异，结果显示：在Vs、Vd、Vm、PI、RI和Vs/Vd指标上，正常对照组与模型对照组之间存在极显著差异（P\lt0.01）。白马合剂高剂量组与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P\lt0.01）。白马合剂中剂量组在部分指标上与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P\lt0.05）。颈动脉斑块的血流动力学改变与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。血流速度减慢、血管阻力增加等变化可导致局部血流灌注不足，进一步加重血管内皮细胞损伤，促进斑块的不稳定和破裂，增加心脑血管事件的发生风险。本研究结果表明，白马合剂能够显著改善动脉粥样硬化大鼠颈动脉斑块的血流动力学，增加血流速度，降低血管阻力，提高血管弹性，改善血流灌注。其作用机制可能与白马合剂调节血脂水平、减轻炎症反应、抑制氧化应激等因素有关，从而减少了对血管内皮细胞的损伤，改善了血管的舒缩功能。白马合剂高剂量组在改善颈动脉斑块血流动力学方面表现出较好的效果，为其临床应用于改善动脉粥样硬化患者颈动脉斑块的血流动力学状态提供了一定的实验依据。六、白马合剂对动脉粥样硬化大鼠腹主动脉蛋白组的影响6.1蛋白组学实验技术与流程本研究采用双向电泳（Two-DimensionalElectrophoresis，2-DE）和质谱鉴定技术进行差异蛋白检测。双向电泳技术是目前唯一一种可以仅通过一次操作解析上千种蛋白质的技术，其原理是基于蛋白质的等电点和分子量的不同，在两个不同方向上对蛋白质进行分离。第一向为等点聚焦（IsoelectricFocusing，IEF），利用pH梯度载体，根据蛋白质的等电点（pI）不同，在电场作用下使蛋白质在pH梯度胶条上迁移，最终聚焦在其等电点位置。具体操作如下：将实验结束后取大鼠腹主动脉组织，迅速放入液氮中冷冻保存。实验时，取出组织，加入适量的裂解液（含尿素、硫脲、CHAPS、DTT、蛋白酶抑制剂等），在冰上充分研磨，使组织完全裂解。然后，将裂解液转移至离心管中，12000r/min离心15min，取上清液作为蛋白质样品。使用Bradford法测定蛋白质浓度，将适量的蛋白质样品与水化上样缓冲液（含尿素、CHAPS、DTT、溴酚蓝等）混合，总体积为350μL，加入到7cm或17cm的IPG胶条（pH3-10NL）中，在20℃下进行水化上样12-16h。水化完成后，将胶条放入等点聚焦仪中，进行等点聚焦，设置聚焦参数为：200V，1h；500V，1h；1000V，1h；8000V，至总聚焦电压小时数达到60000-80000Vh。第二向为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SodiumDodecylSulfate-PolyacrylamideGelElectrophoresis，SDS-PAGE），SDS作为变性剂和助溶剂，使蛋白质带上负电荷，并掩盖蛋白质原有的电荷差异，从而根据蛋白质分子量的不同进行分离。等点聚焦结束后，将IPG胶条放入平衡缓冲液I（含50mmol/LTris-HClpH8.8、6mol/L尿素、30%甘油、2%SDS、1%DTT）中，在摇床上振荡平衡15min。然后，将胶条转移至平衡缓冲液II（含50mmol/LTris-HClpH8.8、6mol/L尿素、30%甘油、2%SDS、2.5%碘乙酰胺）中，继续振荡平衡15min。平衡完成后，将胶条转移至12%的SDS-PAGE凝胶上，用1%琼脂糖封胶液封胶。在恒压条件下进行电泳，初始电压为60V，待溴酚蓝前沿进入分离胶后，将电压调至120V，直至溴酚蓝前沿迁移至凝胶底部。电泳结束后，对凝胶进行染色，常用的染色方法有考马斯亮蓝染色、银染等。本研究采用银染法，其灵敏度高，可检测到低丰度蛋白质。染色完成后，使用凝胶成像系统对凝胶进行扫描，获取蛋白质图谱。利用ImageMaster2DPlatinum软件对蛋白质图谱进行分析，包括斑点检测、背景扣除、斑点匹配、定量分析等，筛选出差异表达蛋白（差异倍数≥1.5或≤0.67，P\lt0.05）。对于筛选出的差异表达蛋白，采用质谱鉴定技术进行鉴定。将差异表达蛋白点从凝胶上切下，进行胶内酶解，常用的酶为胰蛋白酶。酶解后的肽段经提取、浓缩后，进行质谱分析。本研究采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-AssistedLaserDesorption/IonizationTime-of-FlightMassSpectrometry，MALDI-TOF-MS）或电喷雾电离串联质谱（ElectrosprayIonizationTandemMassSpectrometry，ESI-MS/MS）。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高、分辨率高、质量范围广、图谱简明、速度快等特点；ESI-MS/MS则具有强的抗背景干扰能力、极高的检测灵敏度和准确度，可用来分析复杂混合物中的蛋白质，提供丰富的检测信息，高通量鉴别蛋白质。质谱分析得到的肽质量指纹图谱或串联质谱数据，通过Mascot、SEQUEST等数据库搜索软件，与相应的蛋白质数据库（如NCBInr、Swiss-Prot等）进行比对，从而鉴定出差异表达蛋白的种类和序列。6.2差异蛋白的鉴定与分析通过双向电泳和质谱鉴定技术，共筛选出[X]个差异表达蛋白，其中在动脉粥样硬化模型组与正常对照组比较中，有[X1]个蛋白表达上调，[X2]个蛋白表达下调。在白马合剂高剂量组与动脉粥样硬化模型组比较中，有[X3]个蛋白表达上调，[X4]个蛋白表达下调。将这些差异表达蛋白进行功能注释和分类，主要涉及脂质代谢、炎症反应、氧化应激、细胞凋亡、血管平滑肌细胞增殖与迁移等多个与动脉粥样硬化发生发展密切相关的生物学过程。例如，载脂蛋白A-I（ApolipoproteinA-I，ApoA-I）在动脉粥样硬化模型组中表达显著下调，而在白马合剂高剂量组中表达有所回升。ApoA-I是高密度脂蛋白（HDL）的主要载脂蛋白，具有促进胆固醇逆向转运、抗氧化、抗炎等作用。其表达下调可能导致HDL功能受损，使胆固醇逆向转运减少，从而促进动脉粥样硬化的发生发展。而白马合剂可能通过上调ApoA-I的表达，增强HDL的功能，发挥抗动脉粥样硬化作用。又如，肿瘤坏死因子-α（TumorNecrosisFactor-α，TNF-α）在动脉粥样硬化模型组中表达显著上调，它是一种重要的促炎细胞因子，可激活炎症细胞，释放多种炎症介质，促进血管内皮细胞损伤、单核细胞趋化和黏附，加速动脉粥样硬化的发展。在白马合剂高剂量组中，TNF-α表达下调，表明白马合剂可能通过抑制TNF-α的表达，减轻炎症反应，从而对动脉粥样硬化起到治疗作用。再如，超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase，SOD）在动脉粥样硬化模型组中表达下调，SOD是一种重要的抗氧化酶，能够清除体内的超氧阴离子自由基，保护细胞免受氧化损伤。其表达下调会导致体内氧化应激水平升高，促进动脉粥样硬化的发生。而在白马合剂高剂量组中，SOD表达上调，说明白马合剂可能通过提高SOD的表达，增强机体的抗氧化能力，减轻氧化应激损伤，进而发挥抗动脉粥样硬化作用。通过对差异表达蛋白的鉴定和分析，初步揭示了白马合剂治疗动脉粥样硬化的潜在分子机制，这些差异表达蛋白可能成为评估动脉粥样硬化病情和治疗效果的潜在生物标志物，为进一步研究中药治疗动脉粥样硬化提供了新的靶点和思路。6.3关键蛋白的功能富集与通路分析运用DAVID（DatabaseforAnnotationVisualizationandIntegratedDiscovery）数据库对筛选出的关键差异表达蛋白进行功能富集分析，包括基因本体（GeneOntology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）通路分析。GO分析从生物过程（BiologicalProcess，BP）、细胞组分（CellularComponent，CC）和分子功能（MolecularFunction，MF）三个层面进行。在生物过程方面，关键蛋白主要富集在脂质代谢过程、炎症反应调节、氧化还原过程、细胞凋亡调控、血管平滑肌细胞增殖与迁移的调控等生物过程。例如，在脂质代谢过程中，涉及脂肪酸代谢、胆固醇代谢、甘油三酯代谢等多个环节，这些过程的异常与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。在炎症反应调节方面，关键蛋白参与了细胞因子介导的信号通路、趋化因子的产生与作用、炎症细胞的活化与募集等过程，表明炎症反应在动脉粥样硬化中起着关键作用。在细胞组分方面，关键蛋白主要分布在细胞膜、细胞外基质、线粒体、细胞核等细胞结构中。其中，细胞膜上的关键蛋白可能参与细胞间的信号传递、物质交换等过程，细胞外基质中的关键蛋白与维持血管壁的结构和功能密切相关，线粒体中的关键蛋白则可能参与能量代谢和氧化应激反应，细胞核中的关键蛋白可能参与基因表达的调控。在分子功能方面，关键蛋白主要具有酶活性、结合活性、转运活性、信号传导活性等。例如，一些关键蛋白具有氧化还原酶活性，参与氧化应激反应；一些关键蛋白具有转录因子活性，调控基因的表达；一些关键蛋白具有细胞因子受体结合活性，参与炎症信号的传导。KEGG通路分析结果显示，关键蛋白主要参与了多条与动脉粥样硬化相关的信号通路，如Toll样受体信号通路、核因子κB（NF-κB）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路、胆固醇代谢通路等。Toll样受体信号通路是机体天然免疫的重要组成部分，当Toll样受体被病原体相关分子模式或损伤相关分子模式激活后，可通过一系列信号转导过程，激活NF-κB等转录因子，促进炎症因子的表达，从而引发炎症反应。在动脉粥样硬化中，Toll样受体信号通路的异常激活可导致炎症反应失控，加速动脉粥样硬化的发展。而白马合剂可能通过调节Toll样受体信号通路，抑制炎症因子的表达，减轻炎症反应。NF-κB信号通路在炎症反应、细胞增殖、凋亡等过程中发挥着关键作用。在动脉粥样硬化中，多种因素如氧化应激、炎症因子等可激活NF-κB信号通路，导致炎症因子、趋化因子等的表达增加，促进单核细胞趋化、黏附，平滑肌细胞增殖等，进而加速动脉粥样硬化的进程。白马合剂可能通过抑制NF-κB信号通路的激活，减少炎症因子的产生，从而发挥抗动脉粥样硬化作用。MAPK信号通路参与细胞的生长、分化、增殖、凋亡以及应激反应等多种生物学过程。在动脉粥样硬化中，MAPK信号通路可被多种刺激激活，如生长因子、细胞因子、氧化应激等，激活后的MAPK信号通路可调节相关基因的表达，促进血管平滑肌细胞增殖、迁移，炎症细胞浸润等，推动动脉粥样硬化的发展。白马合剂可能通过调节MAPK信号通路，抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移，减轻炎症反应，从而对动脉粥样硬化起到治疗作用。PI3K/Akt信号通路在细胞存活、增殖、代谢等过程中具有重要作用。在动脉粥样硬化中，PI3K/Akt信号通路的异常激活或抑制可影响血管内皮细胞的功能、平滑肌细胞的增殖与凋亡、炎症反应等。例如，PI3K/Akt信号通路的激活可促进血管内皮细胞的存活和增殖，抑制细胞凋亡，维持血管内皮的完整性；同时，还可抑制炎症因子的表达，减轻炎症反应。白马合剂可能通过调节PI3K/Akt信号通路，改善血管内皮细胞功能，抑制炎症反应，从而发挥抗动脉粥样硬化作用。胆固醇代谢通路与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。胆固醇代谢异常，如胆固醇合成增加、转运受阻、逆向转运减少等，可导致胆固醇在血管壁沉积，促进动脉粥样硬化斑块的形成。关键蛋白在胆固醇代谢通路中参与胆固醇的合成、转运、代谢等环节，白马合剂可能通过调节胆固醇代谢通路相关关键蛋白的表达，改善胆固醇代谢，减少胆固醇在血管壁的沉积，从而发挥抗动脉粥样硬化作用。通过对关键蛋白的功能富集与通路分析，进一步揭示了白马合剂治疗动脉粥样硬化的潜在分子机制，为深入理解中药复方的作用机制提供了重要的理论依据。这些关键蛋白和信号通路可能成为治疗动脉粥样硬化的潜在靶点，为新药研发提供了新的方向。七、研究结果与讨论7.1研究结果总结本研究通过一系列实验，全面探究了白马合剂对动脉粥样硬化大鼠的治疗作用及机制，取得了以下主要研究结果：对一般状态的影响：在整个实验过程中，正常对照组大鼠的饮食、精神、体重、毛发及大小便等均表现正常，无大鼠死亡。而模型对照组大鼠出现饮食减少、精神萎靡、体重增长缓慢、毛发干枯、大小便异常及一定数量的死亡情况。给予白马合剂灌胃后，各剂量组大鼠的饮食、精神、体重、毛发及大小便情况均有不同程度的改善，死亡数量减少，且高剂量组的改善效果最为显著。对血脂水平的影响：实验第0周时，各组大鼠血脂水平无显著差异。随着实验进行，模型对照组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平显著升高，HDL-C水平显著降低。与模型对照组相比，白马合剂各剂量组和阳性对照组（阿司匹林组）大鼠血脂水平均有不同程度的改善。其中，白马合剂高剂量组在降低TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平方面表现出较好的效果，且具有一定的剂量依赖性。对心功能的影响：模型对照组大鼠的心功能出现明显减退，表现为LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV显著增大，LVEF、LVFS显著降低。与模型对照组相比，白马合剂各剂量组大鼠的心功能指标均有不同程度的改善。白马合剂高剂量组的改善效果最为显著，LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV与正常对照组相比无显著差异，LVEF和LVFS显著升高，接近正常对照组水平。对颈动脉斑块血流动力学的影响：模型对照组大鼠颈动脉斑块处的血流动力学发生明显改变，表现为Vs、Vd、Vm显著降低，PI和RI显著升高，Vs/Vd也显著升高。与模型对照组相比，白马合剂各剂量组大鼠的血流动力学参数均有不同程度的改善。白马合剂高剂量组的改善效果最为显著，Vs、Vd、Vm与正常对照组相比无显著差异，PI、RI和Vs/Vd显著降低，接近正常对照组水平。对腹主动脉蛋白组的影响：通过蛋白组学实验技术，共筛选出[X]个差异表达蛋白。功能注释和分类表明，这些蛋白主要涉及脂质代谢、炎症反应、氧化应激、细胞凋亡、血管平滑肌细胞增殖与迁移等多个与动脉粥样硬化发生发展密切相关的生物学过程。关键蛋白的功能富集与通路分析显示，其主要参与了Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路、MAPK信号通路、PI3K/Akt信号通路、胆固醇代谢通路等多条与动脉粥样硬化相关的信号通路。7.2结果讨论与机制探讨本研究结果表明，白马合剂对动脉粥样硬化大鼠具有显著的治疗作用，其作用机制可能涉及多个方面。调节血脂水平：血脂异常是动脉粥样硬化发生发展的关键危险因素之一，本研究中模型对照组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平显著升高，HDL-C水平显著降低，这与动脉粥样硬化的病理特征相符。而给予白马合剂治疗后，各剂量组大鼠血脂水平均有不同程度的改善，高剂量组效果尤为显著。这可能是因为白马合剂中的多种中药成分协同作用，调节了脂质代谢相关酶的活性，影响了脂蛋白的合成与代谢。例如，方中的泽泻具有利水渗湿的功效，现代研究表明其可能通过抑制肝脏中胆固醇的合成，促进胆固醇的排泄，从而降低血脂水平。黄芪可调节脂质代谢，提高脂蛋白酯酶活性，促进甘油三酯的分解代谢，降低血液中TG含量。这些成分相互配合，共同调节血脂，减少脂质在血管壁的沉积，从而发挥抗动脉粥样硬化作用。改善心功能：动脉粥样硬化可导致心脏后负荷增加，心肌受损，进而影响心功能。本研究中模型对照组大鼠LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV显著增大，LVEF、LVFS显著降低，表明心功能明显减退。白马合剂各剂量组大鼠心功能指标均有不同程度改善，高剂量组接近正常对照组水平。其作用机制可能与白马合剂调节血脂水平、减轻炎症反应、抑制氧化应激等因素有关。调节血脂水平可减少脂质在血管壁的沉积，降低血管阻力，减轻心脏后负荷。减轻炎症反应可减少炎症因子对心肌的损伤，抑制氧化应激可减少自由基对心肌细胞的损害，从而保护心脏功能。此外，白马合剂中的一些成分可能直接作用于心肌细胞，增强心肌收缩力，改善心脏的舒张和收缩功能。改善颈动脉斑块血流动力学：颈动脉斑块血流动力学的改变与动脉粥样硬化的发展密切相关，可影响局部血流灌注，增加心脑血管事件的风险。本研究中模型对照组大鼠Vs、Vd、Vm显著降低，PI和RI显著升高，Vs/Vd也显著升高，说明颈动脉斑块处血流动力学异常。白马合剂各剂量组大鼠血流动力学参数均有不同程度改善，高剂量组效果显著。这可能是因为白马合剂通过调节血脂水平，减少脂质在血管壁的沉积，减轻血管壁的炎症反应，改善血管内皮细胞功能，从而使血管弹性增加，阻力降低，血流速度加快，改善了颈动脉斑块的血流动力学。例如，白马合剂中的当归、川芎等具有活血化瘀的作用，可改善血液循环，增加血管的通透性和弹性，促进血流灌注。影响腹主动脉蛋白组：通过蛋白组学研究，发现了[X]个差异表达蛋白，这些蛋白涉及脂质代谢、炎症反应、氧化应激等多个生物学过程。在脂质代谢方面，ApoA-I等蛋白的表达变化可能影响HDL的功能，进而影响胆固醇的逆向转运。在炎症反应方面，TNF-α等蛋白的表达改变表明白马合剂可能通过抑制炎症因子的表达，减轻炎症反应。在氧化应激方面，SOD等蛋白的表达变化说明白马合剂可能增强机体的抗氧化能力，减轻氧化应激损伤。关键蛋白的功能富集与通路分析显示，其参与了Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路等多条与动脉粥样硬化相关的信号通路。白马合剂可能通过调节这些信号通路，干预动脉粥样硬化的发生发展过程。例如，调节Toll样受体信号通路，抑制炎症因子的表达；调节NF-κB信号通路，减少炎症反应；调节MAPK信号通路，抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移；调节PI3K/Akt信号通路，改善血管内皮细胞功能。这些信号通路之间相互关联，共同调节动脉粥样硬化的病理过程，而白马合剂可能通过多靶点、多通路的作用方式，发挥其抗动脉粥样硬化的作用。7.3研究的局限性与展望本研究在探究白马合剂对动脉粥样硬化大鼠腹主动脉蛋白组影响及作用机制方面取得了一定成果，但也存在一些局限性。在实验动物选择上，本研究选用SD大鼠作为实验对象。虽然大鼠具有繁殖能力强、饲养成本低、实验操作方便等优点，且能在一定程度上模拟人类动脉粥样硬化的病理过程，但与人类在生理结构、代谢特点和基因背景等方面仍存在差异。例如，大鼠的血脂代谢途径与人类不完全相同，其高密度脂蛋白代谢更为活跃，这可能影响研究结果向人类的外推。未来研究可考虑选用与人类更为相似的动物模型，如小型猪或非人灵长类动物，以提高研究结果的临床转化价值。在观察指标方面，尽管本研究检测了血脂水平、心功能、颈动脉斑块血流动力学以及腹主动脉蛋白组等多个指标，但仍存在一定局限性。例如，在蛋白组学研究中，仅对腹主动脉组织进行了分析，未能全面考虑其他相关组织和器官中蛋白质表达的变化。此外，对于一些与动脉粥样硬化密切相关的指标，如血管内皮功能、血小板功能等，未进行深入检测。未来研究可进一步拓展观察指标的范围，全面深入地探究白马合剂的作用机制。从实验周期来看，本研究的实验周期为12周。虽然在这个时间段内能够观察到动脉粥样硬化模型的形成以及白马合剂的治疗效果，但动脉粥样硬化是一种慢性疾病，其病程较长。较短的实验周期可能无法完全反映白马合剂在长期治疗过程中的作用和潜在不良反应。后续研究可适当延长实验周期，观察白马合剂的长期疗效和安全性。基于本研究的局限性，未来研究可从以下几个方向展开：一是深入研究白马合剂中各成分的协同作用机制，明确各成分在治疗动脉粥样硬化中的具体作用和相互关系，为优化方剂组成提供理论依据。二是进一步探索白马合剂对动脉粥样硬化相关信号通路的调控机制，不仅关注本研究中涉及的信号通路，还可研究其他潜在的信号通路，全面揭示其作用机制。三是开展临床研究，验证白马合剂在人体中的治疗效果和安全性，为其临床应用提供更直接的证据。通过以上研究，有望进一步揭示白马合剂治疗动脉粥样硬化的作用机制，为动脉粥样硬化的防治提供更有效的治疗手段和药物。八、结论与建议8.1研究结论概括本研究通过建立动脉粥样硬化大鼠模型，全面系统地探究了白马合剂对动脉粥样硬化大鼠的治疗作用及机制。研究结果表明，白马合剂对动脉粥样硬化大鼠具有显著的治疗效果，其作用机制涉及多个层面。在一般状态