DB13T 1721-2013 辣椒轻斑驳病毒检验检测技术规程

DB13DB13/T1721—2013辣椒轻斑驳病毒检验检测技术规程TechnicalRegulationsforDetectionofPeppermildmottlevirus2013-05-27发布2013-06-15实施河北省质量技术监督局发布I本标准主要起草人：王亚南、曹克强、王树桐12术语和定义依据PMMoV具有很强的免疫原性，可采用ELISA或免疫胶体金试纸条方法进行检测；依据PMMoV基因4材料、仪器、用具及药品4.1材料4.2仪器、用具）；）；）；2各种量程的可调移液器（1000L、200L、20L、10L、5L各种吸头（1000L、200L、20L、10L、5L4.3主要试剂5调查与取样5.2种子取样在11月～翌年2月份对市场销售的甜（辣）椒种子进行扦样（数量以满足检测鉴定所需为限），然的样品应放入超低温冰箱中（-80℃)保存，要尽早进行检测与鉴定。6检测与鉴定免疫胶体金试纸条适用于田间快速诊断，DAS-ELISA适合于样品批量检测，RT-PCR技术适用于3完整的实验记录包括：样品来源、品种、时间、地点、方法和结果等。PCR检测需要有电泳结果照4A.1分类和命名A.1.2分类地位A.2病原特征A.2.1病毒粒子A.2.2核酸A.2.3蛋白A.2.4致病型L3、L4等抗性基因群。烟草花叶病毒属病毒能否克服L基因介导的抗性能力由其自身的致病型决定，分5辣椒轻斑驳病毒的寄主范围、地理分布、生物学特性、为害症状、传播辣椒轻斑驳病毒的稀释限点为10-6mL/L～10-8m6PMMoV有多种传播方式：1.种子传播；2.接触传染（包括）；用作肥料的牛粪）。其中带毒种子是远距离传播B.6.3昆诺藜（ChenopodiumquB.6.6珊西烟（NicotianaXanth7使用前将试纸条恢复至室温（15℃~30℃)。从包装中取出试纸条，有“箭头”标记端为样品端。样品端垂直向下，插入准备好的样品液中。样品液不要超过胶体金试纸条上的MAX线。在检测过程中，无效结果：质控线和测试点线均未显色，说明试纸条失效，C.4.2试纸条应在2℃~8℃冰箱内密封干燥保存。使用时注意未用的要密封。以免吸湿而失效。使用温度应在15℃~30℃。C.4.3样品制备对检测结果影响明显。如样品液中有大量组织块，会影响检测条吸取样品液；如样品8PVP（MW24,000～40,000）20.0g，亚硫酸钠1.3g，叠氮化钠0.2g，调整pH至7.4，溶解于1L1碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，叠氮化钠0.2g，调整pg，氯化钾0.2g，吐温-200牛血清蛋白（BSA）或脱脂奶粉2.0g，PVP（MW24,000～40,000）20.0g二乙醇胺97.0mL，氯化镁0.1g，叠氮化钠0.2g将PMMoV抗体按试剂盒说明进行稀释，加入酶联板孔中，每孔加100µL9取样品按1:10（W/V）加入提取缓冲液研磨匀浆。2000r/在酶联板中加入待测样品，同时加入阳性对照、阴性对照和空白对照，每孔加100µL，放入保湿将酶标抗体按照试剂盒说明用酶标抗体缓冲液稀释，加入酶联板中，于每孔100µL，放入保湿盒将NPP加入底物缓冲液使终浓度为1mg/mL（现配现用），混合均匀，加入酶联板，每孔100µL。OD405值应小于0.15，当阴性对照OD405值小于0.05按0以微孔中阴性对照的2倍为标准，大于这个数值的辣椒轻斑驳病毒反转录聚合酶链式反应检测（TrizolReagent购自Invitrogen植株叶片组织0.1g，加入1mlTrizol裂解液充分研磨，室温放置5min；荡15sec，室温放置2min～3min；12000rpm，4℃离心15min；取上层水相至新管中，加入2/3体积上游引物（5’-引物5′-atttgccttcaaattgatcccg-3′；下游引物（3’-引物5′-tacatgtgtgacgtgtatttgcgPCR扩增体系及程序反应程序：94℃预变性4min；94℃变性1min，55℃退火1min，取8μL扩增产物加6×loadingbuffe