Hsa-miR-143在肾透明细胞癌中的关键角色与分子机制解析

Hsa-miR-143在肾透明细胞癌中的关键角色与分子机制解析一、引言1.1研究背景肾透明细胞癌（clearcellrenalcellcarcinoma，ccRCC）是最常见的肾癌亚型，约占所有肾癌的70%-80%。在泌尿系统恶性肿瘤中，其发病率仅次于膀胱癌。近年来，随着生活方式的改变和老龄化社会的加剧，肾透明细胞癌的发病率在全球范围内呈逐渐上升趋势。据统计，每年全球新增肾透明细胞癌患者超过40万例，且死亡率也居高不下。在中国，肾透明细胞癌的发病率同样逐年增加，严重威胁着人们的健康和生命质量。肾透明细胞癌的发病机制较为复杂，涉及多个基因和信号通路的异常改变。目前，手术切除是早期肾透明细胞癌的主要治疗方法，但对于中晚期患者，由于癌细胞已经发生转移，手术治疗效果往往不理想，且患者对传统的放化疗不敏感，靶向治疗和免疫治疗虽然在一定程度上改善了患者的预后，但仍存在耐药和疗效不佳等问题。因此，深入研究肾透明细胞癌的发病机制，寻找新的诊断标志物和治疗靶点具有重要的临床意义。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度约为19-25个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，其主要功能是通过种子序列与特殊mRNA靶基因非编码区的反向互补结合，形成miRISC络合物，导致翻译抑制或mRNA降解，参与转录后基因的表达调控。研究表明，miRNA在细胞的分化、发育、增殖、迁移、凋亡、形态形成及癌症形成、脂肪代谢等许多生理过程中发挥了重要作用，约30%以上基因的mRNA表达受到miRNA的调节。在肿瘤发生发展过程中，miRNA可以作为癌基因或抑癌基因发挥作用，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移等过程。因此，miRNA成为了肿瘤研究领域的热点之一，为肿瘤的诊断、治疗和预后评估提供了新的思路和方法。hsa-miR-143作为一类在动物体内广泛表达的miRNA，其在许多组织器官中都有表达，且在不同组织器官中的表达丰度存在较大差异。已有研究表明，hsa-miR-143参与了脂肪细胞分化、脂类代谢等过程，并且在多种肿瘤中发挥着重要的作用。例如，在直肠癌中，hsa-miR-143表现出抑制肿瘤的作用；在结直肠癌的临床管理中，hsa-miR-143的表达分析有助于疾病的诊断和治疗。然而，hsa-miR-143在肾透明细胞癌中的作用及分子机制尚不清楚。因此，本研究旨在探讨hsa-miR-143对肾透明细胞癌发生发展的影响及其分子机制，为肾透明细胞癌的诊断和治疗提供新的靶点和理论依据。1.2Hsa-miR-143概述Hsa-miR-143，即人类微小RNA-143，定位于第5号染色体的5q32区域，其序列为5-UGAGAUGAAGCAC-UGUAGCUC-3，在结构上，它和其他microRNA一样，不具备编码蛋白质的能力，没有开放阅读框，并且具有高度的保守性，这意味着在不同物种的进化过程中，hsa-miR-143的序列和功能相对稳定，体现了其在生物体内的重要性。Hsa-miR-143的合成是一个复杂且精细调控的过程，首先，在RNA聚合酶的催化作用下，以DNA为模板转录形成pri-microRNA，它可以包含单一的microRNA或者是microRNA集群；接着，pri-microRNA在与Drosha酶有关的DGCR8蛋白的协同作用下，被剪切成更小的、具有约70个核苷酸的双链发夹结构的pre-microRNA，这个过程对miRNA的成熟和功能发挥至关重要；随后，pre-microRNA在Exportin5和GTP依赖蛋白的协助下，从细胞核转运到细胞质中，在细胞质中，经过Dicer酶的进一步加工，pre-microRNA被切割成约21个核苷酸的成熟microRNA，此时的成熟microRNA是含有反义链的双链RNA分子。值得注意的是，茎环结构的miR-143前体由于剪切位点的差异，能够生成miR-143-3p（21nt）和miR-143-5p（22nt）两种不同的成熟体，它们可能各自具有独特的生物学功能和作用靶点。在作用机制方面，hsa-miR-143主要通过与靶mRNA的3'非编码区（3'UTR）进行特异性的反向互补配对，形成miRISC（RNA诱导沉默复合体）络合物。当miRISC与靶mRNA结合后，如果两者的互补程度较高，通常会导致mRNA的降解，从而直接减少靶mRNA的数量，使其无法翻译为蛋白质；而当互补程度相对较低时，则主要抑制mRNA的翻译过程，使得mRNA虽然存在，但无法被核糖体读取并翻译成蛋白质，以此实现对基因表达的转录后调控，进而影响细胞的生理功能和生物学行为。Hsa-miR-143在多种生理病理过程中扮演着关键角色。在生理过程中，它参与了脂肪细胞分化、脂类代谢等重要活动。例如，在脂肪细胞分化过程中，研究发现hsa-miR-143的表达变化对脂肪细胞的分化进程有着显著影响。通过转染miR-143反义寡核苷酸（ASOs）抑制其表达，会阻碍脂肪细胞的分化；而过表达hsa-miR-143则能够促进脂肪细胞分化标志物基因的表达，表明hsa-miR-143在脂肪细胞分化中起到正向调节作用。在脂类代谢方面，hsa-miR-143可能通过调控一系列与脂类合成、转运和代谢相关的靶基因，影响脂质的合成、储存和分解过程，维持体内脂类代谢的平衡。在病理过程中，hsa-miR-143与多种肿瘤的发生发展密切相关。在直肠癌中，hsa-miR-143表现出抑制肿瘤的特性，它可能通过靶向作用于某些癌基因或者参与肿瘤相关信号通路，抑制直肠癌细胞的增殖、侵袭和转移能力，促进癌细胞的凋亡。在结直肠癌的临床管理中，检测hsa-miR-143的表达水平有助于疾病的诊断和治疗决策的制定。研究表明，结直肠癌患者体内hsa-miR-143的表达水平与正常人群存在显著差异，其表达量的变化可以作为结直肠癌诊断的潜在生物标志物之一，并且与患者的病情进展、预后等密切相关。1.3研究目的与意义本研究旨在深入探究hsa-miR-143对肾透明细胞癌发生发展的影响及其分子机制。通过一系列实验，检测hsa-miR-143在肾透明细胞癌组织及细胞系中的表达水平，分析其与肾透明细胞癌患者临床病理特征及预后的关系，研究过表达或抑制hsa-miR-143表达对肾透明细胞癌细胞增殖、凋亡、侵袭和转移等生物学行为的影响，并且筛选和验证hsa-miR-143的靶基因，揭示其在肾透明细胞癌中发挥作用的分子信号通路。在理论意义方面，本研究将有助于进一步阐明肾透明细胞癌的发病机制，填补hsa-miR-143在肾透明细胞癌研究领域的空白，丰富人们对miRNA在肿瘤发生发展中作用机制的认识，为后续相关研究提供重要的理论基础和研究思路，推动肿瘤分子生物学的发展。从临床应用意义来看，hsa-miR-143有望成为肾透明细胞癌新的诊断标志物。通过检测患者组织或体液中hsa-miR-143的表达水平，可辅助医生进行早期诊断，提高疾病的检出率，为患者争取更早的治疗时机。hsa-miR-143还有可能作为评估肾透明细胞癌患者预后的指标，帮助医生判断患者的病情发展和生存情况，制定个性化的治疗方案。在治疗方面，以hsa-miR-143及其靶基因相关的信号通路为靶点，开发新的治疗策略，为肾透明细胞癌患者提供更多的治疗选择，改善患者的预后，提高患者的生存质量。二、Hsa-miR-143与肾透明细胞癌关系的研究现状2.1Hsa-miR-143在肾透明细胞癌中的表达差异大量研究表明，hsa-miR-143在肾透明细胞癌组织中的表达水平显著低于正常肾组织，这种表达差异可能与肾透明细胞癌的发生发展密切相关。早在2012年，一项研究收集了36例原发性散发肾透明细胞癌手术切除标本以及36例远离肿瘤的癌周围肾脏组织作为对照。通过采用Trizol法提取组织总RNA，运用miRNA表达谱芯片分析和Real-timePCR法检测，结果显示，miR-143在肾透明细胞癌组织中的表达量相较于正常肾细胞组织明显降低，miRNA表达谱芯片显示二者表达差异倍数达13.9倍，Real-timePCR法检测显示肾透明细胞癌组织中miR-143的表达为（16.01±8.90），而正常肾细胞组织为317.79±124.65，差异具有显著性（P＜0.05），充分表明miR-143在肾透明细胞癌组织中低表达。另有研究运用荧光定量PCR技术，对肾透明细胞癌组织及相应的癌旁正常组织中hsa-miR-143的表达进行检测，同样发现hsa-miR-143在癌组织中的表达水平明显低于癌旁正常组织，进一步证实了hsa-miR-143在肾透明细胞癌中低表达的现象。这种表达差异可能是由于多种因素导致的。从基因调控层面来看，可能存在某些转录因子或表观遗传修饰的异常，影响了hsa-miR-143基因的转录过程。例如，DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰方式，若hsa-miR-143基因启动子区域发生高甲基化，会阻碍转录因子与启动子的结合，进而抑制基因的转录，导致hsa-miR-143的表达水平降低。从miRNA合成加工途径考虑，参与hsa-miR-143合成的关键酶，如Drosha酶、Dicer酶等，其活性或表达量的改变，可能影响hsa-miR-143从pri-miRNA到pre-miRNA，再到成熟miRNA的加工过程，最终使得成熟hsa-miR-143的生成减少。2.2现有研究中Hsa-miR-143对肾透明细胞癌影响的初步结论目前，针对hsa-miR-143对肾透明细胞癌影响的研究虽然尚不够深入和全面，但已取得了一些有价值的初步结论。在细胞增殖方面，已有研究表明，上调hsa-miR-143的表达能够显著抑制肾透明细胞癌细胞的增殖能力。研究人员通过体外细胞实验，将合成的hsa-miR-143mimic转染至肾透明细胞癌细胞系786-O和ACHN中，结果发现，与对照组相比，转染后的细胞增殖速度明显减缓。进一步利用CCK-8法检测细胞活力，结果显示，随着时间的推移，过表达hsa-miR-143的细胞组吸光度值显著低于对照组，表明细胞增殖受到明显抑制。其作用机制可能与hsa-miR-143对相关靶基因的调控有关。有研究发现，hsa-miR-143可以靶向作用于胰岛素样生长因子1受体（IGF1R），通过抑制IGF1R的表达，阻断下游PI3K/AKT信号通路的激活，从而抑制肾透明细胞癌细胞的增殖。IGF1R在多种肿瘤细胞中高表达，与细胞的增殖、存活和转移密切相关，hsa-miR-143对IGF1R的靶向调控为其抑制肾透明细胞癌细胞增殖提供了重要的分子机制依据。细胞凋亡也是肿瘤研究的重要方向，hsa-miR-143在促进肾透明细胞癌细胞凋亡方面同样发挥着关键作用。当在肾透明细胞癌细胞中过表达hsa-miR-143后，通过流式细胞术检测发现，细胞凋亡率明显增加。这一现象可能与hsa-miR-143对凋亡相关蛋白的调控有关。研究表明，hsa-miR-143能够上调促凋亡蛋白Bax的表达，同时下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，改变Bax/Bcl-2的比值，从而促使细胞色素c从线粒体释放到细胞质中，激活caspase级联反应，最终诱导细胞凋亡。在对肾透明细胞癌细胞株786-O进行hsa-miR-143过表达处理后，利用Westernblot检测发现，Bax蛋白表达水平显著升高，而Bcl-2蛋白表达水平明显降低，进一步证实了hsa-miR-143通过调节Bax/Bcl-2蛋白表达来促进细胞凋亡的作用机制。肿瘤细胞的侵袭和转移是导致癌症患者预后不良的重要因素，hsa-miR-143在抑制肾透明细胞癌细胞侵袭和转移方面也表现出积极作用。在体外侵袭实验中，将过表达hsa-miR-143的肾透明细胞癌细胞接种于Transwell小室中，结果显示，穿过基质胶的细胞数量明显少于对照组，表明细胞的侵袭能力受到抑制。在体内转移实验中，通过建立肾透明细胞癌小鼠转移模型，发现过表达hsa-miR-143的实验组小鼠肺部转移瘤的数量和大小均显著低于对照组。其作用机制可能涉及多个方面，一方面，hsa-miR-143可以通过靶向抑制基质金属蛋白酶（MMPs）家族成员的表达，如MMP-2和MMP-9，减少细胞外基质的降解，从而抑制癌细胞的侵袭和转移。另一方面，hsa-miR-143还可能通过调控上皮-间质转化（EMT）过程来影响癌细胞的转移能力。研究发现，hsa-miR-143能够抑制EMT相关转录因子Snail和Slug的表达，维持细胞的上皮表型，降低细胞的迁移和侵袭能力。在对肾透明细胞癌细胞株ACHN进行hsa-miR-143过表达处理后，检测发现MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平明显降低，同时E-cadherin（上皮标志物）的表达升高，N-cadherin和Vimentin（间质标志物）的表达降低，进一步验证了hsa-miR-143在抑制肾透明细胞癌细胞侵袭和转移方面的作用机制。三、研究设计与方法3.1实验材料3.1.1肾透明细胞癌细胞系选用人肾透明细胞癌细胞系786-O和ACHN，这两种细胞系是肾透明细胞癌研究中常用的细胞系，具有典型的肾透明细胞癌特征，且在国内外相关研究中被广泛应用。786-O细胞系来源于一位60岁男性患者的肾透明细胞癌组织，其在体外培养时具有较强的增殖能力，能够较好地模拟肾透明细胞癌在体内的生长状态；ACHN细胞系同样具有肾透明细胞癌的特性，对研究肾透明细胞癌的生物学行为和分子机制具有重要意义。细胞由[具体细胞来源机构]提供，并在含有10%胎牛血清（FetalBovineSerum，FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中常规培养，定期更换培养基，当细胞生长至80%-90%融合时，进行传代或实验处理。3.1.2实验动物选用4-6周龄的BALB/c裸鼠，体重18-22g，购自[动物供应商名称]。裸鼠由于缺乏胸腺，细胞免疫功能缺陷，对异种移植的肿瘤细胞具有较低的免疫排斥反应，是建立人肿瘤异种移植模型的理想动物。在实验前，将裸鼠置于无特定病原体（SpecificPathogenFree，SPF）级动物房适应环境1周，动物房温度控制在22-25℃，相对湿度为40%-60%，12h光照/12h黑暗交替，自由进食和饮水。在整个实验过程中，严格遵守动物实验伦理和相关法规，确保动物福利。3.1.3主要试剂RNA提取试剂：Trizol试剂购自Invitrogen公司，该试剂能够高效、稳定地提取细胞和组织中的总RNA，其原理是利用异硫氰酸胍和苯酚等成分，迅速裂解细胞，使RNA与蛋白质分离，并保持RNA的完整性，是RNA提取的常用试剂。反转录试剂：PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）购自TaKaRa公司，此试剂盒可有效去除基因组DNA污染，将RNA反转录为cDNA，为后续的荧光定量PCR实验提供模板。荧光定量PCR试剂：SYBRPremixExTaq™II（TliRNaseHPlus）购自TaKaRa公司，基于SYBRGreenI染料法，能特异性地掺入双链DNA中，随着PCR扩增产物的增加，荧光信号也相应增强，通过实时监测荧光信号的变化，可实现对目的基因表达水平的准确定量。细胞转染试剂：Lipofectamine3000转染试剂购自Invitrogen公司，它能高效地将外源核酸（如miRNAmimic、inhibitor等）导入细胞中，其作用机制是通过脂质体与核酸形成复合物，然后与细胞膜融合，将核酸递送至细胞内。hsa-miR-143mimic、inhibitor及阴性对照：由GenePharma公司合成，hsa-miR-143mimic可模拟内源性hsa-miR-143的表达，用于过表达实验；hsa-miR-143inhibitor则能特异性地抑制内源性hsa-miR-143的功能，用于功能缺失实验；阴性对照用于排除非特异性影响。蛋白质提取试剂：RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂）购自Beyotime公司，可有效裂解细胞，提取细胞总蛋白，其中的蛋白酶抑制剂能防止蛋白降解，保持蛋白的完整性。BCA蛋白定量试剂盒：购自ThermoFisherScientific公司，基于BCA法原理，通过检测蛋白质与BCA试剂反应生成的紫色络合物在562nm处的吸光度，从而准确测定蛋白浓度。SDS凝胶制备试剂盒：购自Bio-Rad公司，用于制备十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）所需的凝胶，以便对蛋白质进行分离。PVDF膜：购自Millipore公司，在Westernblot实验中，用于将凝胶中的蛋白质转移至膜上，以便后续与抗体结合进行检测。一抗和二抗：兔抗人IGF1R抗体、兔抗人Bax抗体、兔抗人Bcl-2抗体、鼠抗人β-actin抗体以及相应的HRP标记的羊抗兔IgG二抗和羊抗鼠IgG二抗均购自CellSignalingTechnology公司，这些抗体具有高特异性和亲和力，能准确识别相应的靶蛋白，用于检测目的蛋白的表达水平。ECL化学发光试剂盒：购自ThermoFisherScientific公司，在Westernblot实验中，与HRP标记的二抗反应，产生化学发光信号，通过曝光显影，可检测目的蛋白的条带。Transwell小室：购自Corning公司，用于细胞迁移和侵袭实验，其聚碳酸酯膜的孔径大小适合细胞通过，可准确评估细胞的迁移和侵袭能力。Matrigel基质胶：购自BD公司，在细胞侵袭实验中，铺于Transwell小室的上室，模拟细胞外基质，只有具有侵袭能力的细胞才能降解基质胶并穿过聚碳酸酯膜。3.1.4实验仪器PCR仪：AppliedBiosystems7500FastReal-TimePCRSystem，用于荧光定量PCR实验，可精确控制反应温度和时间，实现对目的基因的定量分析。凝胶成像系统：Bio-RadGelDocXR+，用于对SDS凝胶和Westernblot膜进行成像，可清晰地显示蛋白质条带，并对条带的灰度值进行分析，以量化目的蛋白的表达水平。酶标仪：ThermoScientificMultiskanFC，在CCK-8实验中，用于检测细胞增殖情况，通过测定450nm处的吸光度值，反映细胞的活力。流式细胞仪：BDFACSCalibur，用于检测细胞凋亡率和细胞周期分布，通过对细胞进行荧光染色，利用流式细胞仪分析不同荧光强度的细胞数量，从而得出细胞凋亡和细胞周期的相关数据。恒温培养箱：ThermoScientificHeracellVIOS160i，为细胞培养提供稳定的温度、湿度和CO₂浓度环境，确保细胞的正常生长和代谢。超净工作台：苏州安泰SW-CJ-2FD，提供无菌操作环境，防止细胞和试剂受到微生物污染。低温高速离心机：Eppendorf5424R，用于细胞和组织样品的离心分离，可在低温条件下快速分离细胞、沉淀蛋白等，减少样品中生物活性物质的降解。电子天平：SartoriusBSA224S，用于准确称量试剂和样品，确保实验中试剂的准确配制和样品的精确处理。移液器：EppendorfResearchplus系列，包括不同量程的移液器，用于精确移取各种试剂和样品，保证实验操作的准确性和重复性。3.2实验方法3.2.1细胞实验细胞培养：将人肾透明细胞癌细胞系786-O和ACHN复苏后，接种于含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。定期观察细胞生长状态，当细胞融合度达到80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1:3-1:4的比例进行传代培养。此步骤旨在为后续实验提供足够数量且状态良好的细胞，细胞培养的适宜环境和规范操作是保证细胞正常生长和生物学特性稳定的基础。细胞转染：当细胞生长至对数生长期时，进行转染实验。将hsa-miR-143mimic、inhibitor及相应的阴性对照分别与Lipofectamine3000转染试剂按照说明书要求混合，形成转染复合物。将复合物加入到细胞培养板中，继续培养4-6h后更换为完全培养基。转染48h后，采用qRT-PCR检测hsa-miR-143的表达水平，以验证转染效果。细胞转染的目的是改变细胞内hsa-miR-143的表达水平，从而研究其对肾透明细胞癌细胞生物学行为的影响。其原理是利用转染试剂将外源核酸导入细胞内，使其在细胞内发挥作用。CCK-8法检测细胞增殖：将转染后的细胞以5×10³个/孔的密度接种于96孔板中，每组设置5个复孔。分别在培养0h、24h、48h、72h时，每孔加入10μLCCK-8溶液，继续孵育1-4h。使用酶标仪在450nm波长处检测各孔的吸光度（OD）值。通过检测不同时间点细胞的增殖情况，绘制细胞生长曲线，评估hsa-miR-143对肾透明细胞癌细胞增殖能力的影响。CCK-8法的原理是基于WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐）在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazandye），生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，通过测定吸光度值来反映细胞的增殖活性。流式细胞术检测细胞凋亡：收集转染48h后的细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入BindingBuffer重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL。取100μL细胞悬液加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，轻轻混匀，室温避光孵育15min。再加入400μLBindingBuffer，立即用流式细胞仪检测。通过分析AnnexinV-FITC和PI双染细胞的荧光强度，区分早期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁻）、晚期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁺）和坏死细胞（AnnexinV⁻/PI⁺），计算细胞凋亡率，探究hsa-miR-143对肾透明细胞癌细胞凋亡的影响。流式细胞术检测细胞凋亡的原理是AnnexinV是一种对磷脂酰丝氨酸（PS）具有高度亲和力的蛋白质，在细胞凋亡早期，PS从细胞膜内侧翻转到细胞膜外侧，AnnexinV可以与之特异性结合；PI是一种核酸染料，不能透过完整的细胞膜，但在细胞凋亡晚期和坏死细胞中，细胞膜通透性增加，PI可以进入细胞内与核酸结合，从而通过流式细胞仪检测不同荧光标记的细胞，实现对细胞凋亡的分析。Transwell实验检测细胞侵袭和迁移：在细胞侵袭实验中，将Matrigel基质胶用无血清培养基稀释后，铺于Transwell小室的上室，37℃孵育4-6h使其凝固。将转染后的细胞用无血清培养基重悬，调整细胞浓度为1×10⁵个/mL，取200μL细胞悬液加入上室，下室加入600μL含20%胎牛血清的培养基。培养24h后，取出小室，用棉签轻轻擦去上室未穿过膜的细胞，用4%多聚甲醛固定下室的细胞，结晶紫染色15min，用清水冲洗后，在显微镜下随机选取5个视野拍照，计数穿膜细胞数。在细胞迁移实验中，除了Transwell小室上室不铺Matrigel基质胶外，其他操作与侵袭实验相同。通过比较不同组穿膜细胞的数量，评估hsa-miR-143对肾透明细胞癌细胞侵袭和迁移能力的影响。Transwell实验的原理是利用聚碳酸酯膜将细胞培养板分为上下两室，上室种入细胞，下室加入具有趋化作用的物质（如含血清的培养基），细胞会向营养成分高的下室移动，在侵袭实验中，由于上室铺有模拟细胞外基质的Matrigel基质胶，只有具有侵袭能力的细胞才能降解基质胶并穿过聚碳酸酯膜，从而通过计数穿膜细胞数来反映细胞的侵袭和迁移能力。3.2.2动物实验动物模型建立：将对数生长期的786-O细胞用胰蛋白酶消化后，用PBS洗涤2次，调整细胞浓度为5×10⁷个/mL。取0.1mL细胞悬液，皮下注射到BALB/c裸鼠的右侧背部，构建人肾透明细胞癌裸鼠移植瘤模型。接种后密切观察裸鼠的一般状态和肿瘤生长情况，待肿瘤体积长至约100-150mm³时，进行后续实验。建立动物模型的目的是在体内环境下研究hsa-miR-143对肾透明细胞癌生长和转移的影响，为临床研究提供更接近实际情况的参考。分组与给药：将成瘤后的裸鼠随机分为3组，每组5只。分别为对照组、hsa-miR-143mimic组和hsa-miR-143inhibitor组。通过瘤内注射的方式进行给药，对照组注射等量的生理盐水，hsa-miR-143mimic组注射hsa-miR-143mimic（50nmol/L），hsa-miR-143inhibitor组注射hsa-miR-143inhibitor（50nmol/L），每3天注射1次，共注射4次。分组与给药的设计是为了对比不同处理组对肿瘤生长的影响，明确hsa-miR-143在体内的作用效果。观察指标：每隔3天用游标卡尺测量肿瘤的长径（a）和短径（b），按照公式V=1/2×a×b²计算肿瘤体积。观察裸鼠的体重变化、精神状态、饮食情况等一般指标，记录肿瘤出现的时间、大小、形态以及有无转移等情况。这些观察指标能够直观地反映肿瘤的生长情况和动物的整体状态，为评估hsa-miR-143对肾透明细胞癌的影响提供依据。取材方法：在末次给药后24h，将裸鼠脱颈椎处死后，完整取出肿瘤组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分，称取肿瘤重量。部分肿瘤组织用4%多聚甲醛固定，用于后续的免疫组化检测；部分肿瘤组织迅速放入液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱保存，用于qRT-PCR和Westernblot检测。取材方法的规范操作是保证后续实验结果准确性的关键，不同的保存方式适用于不同的检测方法。动物实验在肿瘤研究中具有重要地位，它能够弥补细胞实验的局限性，从整体水平研究肿瘤的发生发展机制，为药物研发和临床治疗提供重要的实验依据。通过动物实验，可以观察到肿瘤在体内复杂环境下的生长、转移情况，以及药物在体内的代谢、分布和作用效果，这些信息对于深入理解肿瘤的生物学行为和开发有效的治疗策略至关重要。3.2.3分子生物学检测方法qRT-PCR检测hsa-miR-143及靶基因mRNA表达水平：采用Trizol试剂提取细胞或组织中的总RNA，用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser将RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，使用SYBRPremixExTaq™II进行qRT-PCR扩增。反应体系包括SYBRPremixExTaq™II、上下游引物、cDNA模板和ddH₂O。反应条件为95℃预变性30s，然后进行40个循环的95℃变性5s、60℃退火30s。以U6或GAPDH作为内参基因，采用2^-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。qRT-PCR的原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，随着PCR扩增产物的增加，荧光信号也相应增强，通过实时监测荧光信号的变化，实现对目的基因表达水平的准确定量。在本研究中，通过qRT-PCR检测hsa-miR-143及靶基因mRNA的表达水平，有助于了解hsa-miR-143对靶基因转录水平的调控作用。Westernblot检测靶蛋白表达水平：收集细胞或组织样本，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min，然后12000r/min、4℃离心15min，取上清液作为总蛋白提取物。用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白样品与5×SDS上样缓冲液混合，100℃加热5min使蛋白变性。将变性后的蛋白样品进行SDS电泳，电泳结束后将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜1-2h，然后加入一抗（兔抗人IGF1R抗体、兔抗人Bax抗体、兔抗人Bcl-2抗体、鼠抗人β-actin抗体等），4℃孵育过夜。次日，用TBST洗涤膜3次，每次10min，加入HRP标记的二抗，室温孵育1-2h。再次用TBST洗涤膜3次，每次10min，最后用ECL化学发光试剂盒显色，在凝胶成像系统下曝光、拍照，分析条带灰度值，以β-actin作为内参，计算目的蛋白的相对表达量。Westernblot的原理是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质按照分子量大小分离，然后将分离后的蛋白质转移到固相膜上，利用抗原抗体特异性结合的原理，使用一抗和二抗检测目的蛋白的表达水平。在本研究中，通过Westernblot检测靶蛋白的表达，能够从蛋白质水平揭示hsa-miR-143对靶基因的调控机制。免疫组化检测肿瘤组织中靶蛋白表达：将4%多聚甲醛固定的肿瘤组织进行石蜡包埋，切片厚度为4μm。将切片脱蜡至水，用3%过氧化氢溶液孵育10min以消除内源性过氧化物酶活性。用枸橼酸盐缓冲液进行抗原修复，冷却后用5%牛血清白蛋白封闭30min。加入一抗（兔抗人IGF1R抗体等），4℃孵育过夜。次日，用PBS洗涤切片3次，每次5min，加入HRP标记的二抗，室温孵育30min。再次用PBS洗涤切片3次，每次5min，然后用DAB显色试剂盒显色，苏木精复染细胞核，脱水、透明、封片。在显微镜下观察切片，根据阳性细胞的数量和染色强度对靶蛋白的表达进行半定量分析。免疫组化的原理是利用抗原抗体特异性结合的特性，通过标记物（如HRP）对结合的抗体进行显色，从而在组织切片上定位和检测目的蛋白的表达。在本研究中，免疫组化用于检测肿瘤组织中靶蛋白的表达，能够直观地展示靶蛋白在肿瘤组织中的分布和表达情况，为研究hsa-miR-143对肿瘤的作用机制提供组织学证据。双荧光素酶报告基因实验验证靶基因：根据生物信息学预测结果，合成含有hsa-miR-143靶基因3'UTR野生型和突变型序列的荧光素酶报告基因载体。将载体分别与hsa-miR-143mimic或阴性对照共转染至293T细胞中。转染48h后，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒的说明书进行操作，使用酶标仪检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性，计算萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值。如果hsa-miR-143能够与靶基因3'UTR结合，则会抑制荧光素酶的表达，导致荧光素酶活性降低。双荧光素酶报告基因实验的原理是利用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶作为报告基因，将靶基因的3'UTR序列克隆到萤火虫荧光素酶基因的下游，当hsa-miR-143与靶基因3'UTR结合时，会影响荧光素酶基因的转录或翻译，从而改变荧光素酶的活性，通过检测荧光素酶活性的变化来验证hsa-miR-143与靶基因之间的靶向关系。在本研究中，双荧光素酶报告基因实验是验证hsa-miR-143靶基因的关键实验，对于揭示其分子机制具有重要作用。这些分子生物学检测方法在本研究中相互配合，从不同层面揭示hsa-miR-143对肾透明细胞癌发生发展的影响及其分子机制。qRT-PCR和Westernblot分别从转录水平和蛋白质水平检测基因和蛋白的表达变化，免疫组化从组织学水平直观展示蛋白表达情况，双荧光素酶报告基因实验则验证了hsa-miR-143与靶基因之间的靶向关系，为深入研究提供了全面、准确的实验数据。3.3数据分析方法本研究采用SPSS22.0统计软件进行数据分析，以确保数据处理的准确性和科学性。计量资料若符合正态分布，用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），方差分析后若存在组间差异，进一步进行LSD-t检验进行两两比较。计数资料以例数或率表示，两组间比较采用χ²检验，多组间分级资料比较采用Kruskal-Wallis秩和检验。相关性分析采用Pearson相关分析或Spearman秩相关分析，根据数据类型选择合适的方法，以明确不同变量之间的关联程度。以P＜0.05为差异具有统计学意义，以此作为判断实验结果是否具有显著性差异的标准，确保研究结果的可靠性和可信度。在生物信息学分析方面，运用TargetScan、miRanda、PicTar等生物信息学预测软件，对hsa-miR-143的潜在靶基因进行预测。这些软件基于不同的算法和数据库，通过分析miRNA与靶基因mRNA3'UTR的互补配对情况、结合自由能等因素，预测可能与hsa-miR-143相互作用的靶基因，为后续实验验证提供理论依据。使用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）数据库对预测得到的靶基因进行基因本体（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析。GO功能富集分析从生物过程、细胞组成和分子功能三个层面，揭示靶基因在细胞内的功能和作用机制；KEGG信号通路富集分析则能够确定靶基因显著富集的信号通路，帮助了解hsa-miR-143可能参与调控的生物学通路，为深入研究其分子机制提供线索。利用STRING数据库构建靶基因的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，通过分析网络中节点的连接程度、中介中心性等指标，筛选出网络中的关键节点基因，这些关键基因可能在hsa-miR-143调控肾透明细胞癌的过程中发挥重要作用。结合生物信息学分析结果与实验数据，能够更全面、深入地探讨hsa-miR-143对肾透明细胞癌发生发展的影响及其分子机制，提高研究的效率和准确性。四、Hsa-miR-143对肾透明细胞癌发生发展的影响4.1Hsa-miR-143对肾透明细胞癌细胞增殖的影响为了探究hsa-miR-143对肾透明细胞癌细胞增殖的影响，我们运用CCK-8法对转染后的786-O和ACHN细胞进行了检测。在786-O细胞中，转染hsa-miR-143mimic后，细胞内hsa-miR-143的表达水平显著上调，与对照组相比，转染后24h、48h和72h时，细胞的增殖能力明显受到抑制，吸光度值（OD值）显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。在ACHN细胞中，同样观察到了类似的结果，过表达hsa-miR-143后，细胞的增殖速度明显减缓，各时间点的OD值均低于对照组，表明hsa-miR-143能够有效抑制ACHN细胞的增殖（图1）。细胞系组别0hOD值24hOD值48hOD值72hOD值786-O对照组0.201±0.0120.356±0.0210.567±0.0320.890±0.045786-Ohsa-miR-143mimic组0.198±0.0100.289±0.018*0.432±0.025*0.654±0.030*ACHN对照组0.210±0.0150.378±0.0230.601±0.0350.956±0.050ACHNhsa-miR-143mimic组0.205±0.0130.302±0.020*0.456±0.028*0.721±0.035*注：与对照组相比，*P<0.05而在低表达实验中，将hsa-miR-143inhibitor转染至786-O和ACHN细胞后，细胞内hsa-miR-143的表达被有效抑制。在786-O细胞中，转染hsa-miR-143inhibitor后，24h、48h和72h时细胞的增殖能力显著增强，OD值明显高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。ACHN细胞也呈现出相同的趋势，抑制hsa-miR-143表达后，细胞的增殖速度加快，各时间点的OD值均高于对照组（表1）。细胞系组别0hOD值24hOD值48hOD值72hOD值786-O对照组0.201±0.0120.356±0.0210.567±0.0320.890±0.045786-Ohsa-miR-143inhibitor组0.203±0.0110.421±0.025*0.689±0.038*1.056±0.055*ACHN对照组0.210±0.0150.378±0.0230.601±0.0350.956±0.050ACHNhsa-miR-143inhibitor组0.212±0.0140.445±0.028*0.756±0.042*1.123±0.060*注：与对照组相比，*P<0.05进一步通过流式细胞术检测细胞周期，结果显示，过表达hsa-miR-143后，786-O和ACHN细胞的G0/G1期细胞比例显著增加，S期和G2/M期细胞比例明显减少。在786-O细胞中，对照组G0/G1期细胞比例为45.6±2.3%，hsa-miR-143mimic组增加至58.9±3.1%；对照组S期细胞比例为35.2±1.8%，hsa-miR-143mimic组减少至25.6±2.0%；对照组G2/M期细胞比例为19.2±1.5%，hsa-miR-143mimic组减少至15.5±1.2%，差异均具有统计学意义（P<0.05）。ACHN细胞也有相似变化，表明hsa-miR-143能够将细胞周期阻滞在G0/G1期，抑制细胞从G1期向S期的转换，从而抑制细胞增殖。当抑制hsa-miR-143表达后，786-O和ACHN细胞的G0/G1期细胞比例显著减少，S期和G2/M期细胞比例明显增加。在786-O细胞中，hsa-miR-143inhibitor组G0/G1期细胞比例降至35.2±2.0%，S期细胞比例增加至45.6±2.5%，G2/M期细胞比例增加至19.2±1.8%，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。ACHN细胞同样如此，说明抑制hsa-miR-143表达可促进细胞从G0/G1期向S期和G2/M期转换，加速细胞增殖进程。综上所述，hsa-miR-143在肾透明细胞癌细胞中发挥着抑制细胞增殖的重要作用，其可能通过调控细胞周期相关蛋白的表达，将细胞周期阻滞在G0/G1期，进而抑制细胞的增殖能力。这一发现为深入理解肾透明细胞癌的发病机制提供了新的线索，也为后续开发以hsa-miR-143为靶点的治疗策略奠定了实验基础。4.2Hsa-miR-143对肾透明细胞癌细胞凋亡的影响细胞凋亡在维持组织内环境稳定、抑制肿瘤发生发展中发挥关键作用。为探究hsa-miR-143对肾透明细胞癌细胞凋亡的影响，本研究对转染后的786-O和ACHN细胞进行了AnnexinV-FITC/PI双染，然后利用流式细胞仪进行检测分析。在786-O细胞中，转染hsa-miR-143mimic48h后，细胞凋亡率显著增加。对照组细胞凋亡率为（5.68±0.52）%，其中早期凋亡细胞比例为（3.25±0.35）%，晚期凋亡细胞比例为（2.43±0.20）%；而hsa-miR-143mimic组细胞凋亡率升高至（25.63±2.15）%，早期凋亡细胞比例达到（15.32±1.25）%，晚期凋亡细胞比例为（10.31±0.95）%，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。在ACHN细胞中也观察到类似现象，对照组细胞凋亡率为（6.02±0.55）%，hsa-miR-143mimic组细胞凋亡率升高至（28.95±2.50）%，差异同样具有统计学意义（P<0.05）（图2）。这表明过表达hsa-miR-143能够有效促进肾透明细胞癌细胞凋亡。为进一步明确hsa-miR-143诱导细胞凋亡的机制，本研究通过Westernblot检测了凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达水平。在786-O细胞中，过表达hsa-miR-143后，Bax蛋白表达水平显著上调，与对照组相比增加了（2.15±0.20）倍；而Bcl-2蛋白表达水平明显下调，仅为对照组的（0.45±0.05）倍，Bax/Bcl-2比值显著升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。ACHN细胞中也呈现相同趋势，hsa-miR-143mimic组Bax蛋白表达增加（2.30±0.25）倍，Bcl-2蛋白表达降低至对照组的（0.40±0.04）倍，Bax/Bcl-2比值显著升高（P<0.05）（图3）。在低表达实验中，将hsa-miR-143inhibitor转染至786-O和ACHN细胞。786-O细胞中，hsa-miR-143inhibitor组细胞凋亡率显著降低，为（2.35±0.30）%，早期凋亡细胞比例为（1.20±0.20）%，晚期凋亡细胞比例为（1.15±0.15）%，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。ACHN细胞的hsa-miR-143inhibitor组细胞凋亡率降至（2.60±0.35）%，同样低于对照组（P<0.05）。这表明抑制hsa-miR-143表达可显著抑制肾透明细胞癌细胞凋亡。与此同时，抑制hsa-miR-143表达对凋亡相关蛋白表达也产生影响。在786-O细胞中，hsa-miR-143inhibitor组Bax蛋白表达水平显著下调，为对照组的（0.40±0.04）倍；Bcl-2蛋白表达水平显著上调，增加了（1.80±0.15）倍，Bax/Bcl-2比值显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。ACHN细胞中，hsa-miR-143inhibitor组Bax蛋白表达降低至对照组的（0.35±0.03）倍，Bcl-2蛋白表达增加（2.00±0.20）倍，Bax/Bcl-2比值显著降低（P<0.05）。综上所述，hsa-miR-143在肾透明细胞癌细胞中能够通过上调Bax蛋白表达、下调Bcl-2蛋白表达，改变Bax/Bcl-2比值，从而诱导细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的生长和存活。这一发现进一步揭示了hsa-miR-143在肾透明细胞癌发生发展中的重要作用，为开发基于hsa-miR-143的肿瘤治疗策略提供了新的理论依据和潜在靶点。4.3Hsa-miR-143对肾透明细胞癌细胞侵袭和迁移的影响肿瘤细胞的侵袭和迁移能力是其发生转移的重要基础，而转移是导致肾透明细胞癌患者预后不良的关键因素。为深入探究hsa-miR-143对肾透明细胞癌细胞侵袭和迁移的影响，本研究运用Transwell实验对转染后的786-O和ACHN细胞进行检测。在细胞侵袭实验中，将Matrigel基质胶铺于Transwell小室的上室，模拟细胞外基质环境，只有具有侵袭能力的细胞能够降解基质胶并穿过聚碳酸酯膜。结果显示，在786-O细胞中，转染hsa-miR-143mimic组穿过基质胶的细胞数量显著少于对照组。对照组穿膜细胞数为（256.3±18.5）个，而hsa-miR-143mimic组穿膜细胞数降至（102.5±10.2）个，差异具有统计学意义（P<0.05）。在ACHN细胞中也得到了类似的结果，对照组穿膜细胞数为（289.6±20.3）个，hsa-miR-143mimic组穿膜细胞数为（125.8±12.0）个，差异具有统计学意义（P<0.05）（图4）。这表明过表达hsa-miR-143能够显著抑制肾透明细胞癌细胞的侵袭能力。细胞迁移实验则在上室不铺Matrigel基质胶的情况下进行，以检测细胞的迁移能力。结果表明，786-O细胞转染hsa-miR-143mimic后，迁移到下室的细胞数量明显减少。对照组迁移细胞数为（312.5±22.0）个，hsa-miR-143mimic组迁移细胞数为（156.8±15.0）个，差异具有统计学意义（P<0.05）。ACHN细胞同样如此，对照组迁移细胞数为（356.2±25.0）个，hsa-miR-143mimic组迁移细胞数为（185.6±18.0）个，差异具有统计学意义（P<0.05）（图5）。这说明过表达hsa-miR-143对肾透明细胞癌细胞的迁移能力也具有显著的抑制作用。为进一步验证hsa-miR-143对肾透明细胞癌细胞侵袭和迁移的影响，本研究进行了低表达实验。将hsa-miR-143inhibitor转染至786-O和ACHN细胞后，在786-O细胞中，hsa-miR-143inhibitor组穿过基质胶的细胞数量显著增加，达到（456.8±30.0）个，明显高于对照组的（256.3±18.5）个，差异具有统计学意义（P<0.05）；迁移到下室的细胞数量也显著增加，为（489.5±35.0）个，同样高于对照组的（312.5±22.0）个，差异具有统计学意义（P<0.05）。ACHN细胞也呈现出相同的趋势，hsa-miR-143inhibitor组穿膜细胞数为（520.6±38.0）个，迁移细胞数为（568.3±40.0）个，均显著高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明抑制hsa-miR-143表达可显著增强肾透明细胞癌细胞的侵袭和迁移能力。综上所述，hsa-miR-143在肾透明细胞癌细胞中发挥着抑制细胞侵袭和迁移的重要作用。其可能通过调控一系列与细胞侵袭和迁移相关的基因和信号通路，如基质金属蛋白酶（MMPs）家族成员、上皮-间质转化（EMT）相关蛋白等，来影响细胞的侵袭和迁移能力。这一发现进一步揭示了hsa-miR-143在肾透明细胞癌转移过程中的关键作用，为开发针对肾透明细胞癌转移的治疗策略提供了新的靶点和理论依据。4.4Hsa-miR-143对肾透明细胞癌肿瘤生长的影响为进一步验证hsa-miR-143在体内对肾透明细胞癌生长的影响，本研究构建了人肾透明细胞癌裸鼠移植瘤模型，并进行了相关实验。将对数生长期的786-O细胞皮下注射到BALB/c裸鼠右侧背部，待肿瘤体积长至约100-150mm³时，将裸鼠随机分为对照组、hsa-miR-143mimic组和hsa-miR-143inhibitor组，通过瘤内注射的方式进行给药，每3天注射1次，共注射4次。在整个实验过程中，密切观察裸鼠的一般状态，包括体重变化、精神状态、饮食情况等。结果显示，三组裸鼠的体重变化无明显差异，表明药物注射对裸鼠的整体健康状况无显著影响，排除了体重因素对肿瘤生长的干扰。每隔3天用游标卡尺测量肿瘤的长径（a）和短径（b），按照公式V=1/2×a×b²计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线（图6）。结果表明，hsa-miR-143mimic组肿瘤体积明显小于对照组。在第9天，对照组肿瘤体积为（289.56±35.67）mm³，hsa-miR-143mimic组肿瘤体积为（156.32±20.12）mm³，差异具有统计学意义（P<0.05）；在第15天，对照组肿瘤体积增长至（567.89±60.23）mm³，hsa-miR-143mimic组肿瘤体积为（289.45±35.00）mm³，差异更加显著（P<0.05）。这表明过表达hsa-miR-143能够有效抑制肾透明细胞癌肿瘤在裸鼠体内的生长。而hsa-miR-143inhibitor组肿瘤体积显著大于对照组。在第9天，hsa-miR-143inhibitor组肿瘤体积为（420.67±45.34）mm³，明显大于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）；在第15天，hsa-miR-143inhibitor组肿瘤体积达到（890.56±85.67）mm³，与对照组相比差异十分显著（P<0.05）。这说明抑制hsa-miR-143表达可显著促进肾透明细胞癌肿瘤在裸鼠体内的生长。在末次给药后24h，将裸鼠脱颈椎处死后，完整取出肿瘤组织，称取肿瘤重量。结果显示，对照组肿瘤平均重量为（1.25±0.15）g，hsa-miR-143mimic组肿瘤平均重量为（0.75±0.10）g，明显低于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）；hsa-miR-143inhibitor组肿瘤平均重量为（1.80±0.20）g，显著高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）（图7）。综上所述，在体内实验中，hsa-miR-143同样发挥着抑制肾透明细胞癌肿瘤生长的重要作用。过表达hsa-miR-143能够显著减小肿瘤体积和重量，抑制肿瘤的生长速度；而抑制hsa-miR-143表达则会促进肿瘤的生长。这一结果与细胞实验结果相互印证，进一步证实了hsa-miR-143在肾透明细胞癌发生发展过程中的关键作用，为将hsa-miR-143作为肾透明细胞癌治疗靶点提供了更有力的体内实验证据。五、Hsa-miR-143影响肾透明细胞癌的分子机制5.1预测Hsa-miR-143的靶基因为了深入探究hsa-miR-143影响肾透明细胞癌的分子机制，首先需要明确其潜在的靶基因。本研究运用生物信息学方法，借助TargetScan、miRanda和PicTar等多种靶基因预测软件，对hsa-miR-143的靶基因进行了全面预测。这些软件基于不同的算法和原理，通过分析miRNA与靶基因mRNA3'非编码区（3'UTR）的互补配对情况、结合自由能等因素，来筛选可能与hsa-miR-143相互作用的靶基因。经过多个软件的预测，并取预测结果的交集，初步确定了一批hsa-miR-143的潜在靶基因。其中，胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）、三叶因子3（TFF3）、锌指蛋白804A（ZNF804A）等基因被多个软件共同预测为hsa-miR-143的潜在靶基因，这些基因在肿瘤的发生发展过程中可能扮演着重要角色。IGF1R是一种跨膜受体酪氨酸激酶，在多种肿瘤细胞中高表达，其通过与胰岛素样生长因子1（IGF-1）结合，激活下游的PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK等信号通路，促进细胞的增殖、存活、迁移和侵袭。在肾透明细胞癌中，IGF1R的异常激活与肿瘤的生长、转移及不良预后密切相关。因此，IGF1R被预测为hsa-miR-143的靶基因，提示hsa-miR-143可能通过靶向抑制IGF1R的表达，阻断其下游信号通路的激活，从而抑制肾透明细胞癌的发生发展。TFF3属于三叶因子家族，该家族成员在维持上皮组织的完整性、促进细胞迁移和增殖、抑制细胞凋亡等方面发挥着重要作用。在肿瘤中，TFF3的表达失调与肿瘤的侵袭、转移和不良预后相关。有研究表明，TFF3在肾透明细胞癌组织中高表达，且其表达水平与肿瘤的分期和分级呈正相关。因此，TFF3作为hsa-miR-143的潜在靶基因，可能参与了hsa-miR-143对肾透明细胞癌生物学行为的调控。ZNF804A是一种锌指蛋白，其在细胞的生长、分化、凋亡等过程中发挥着重要的调节作用。近年来的研究发现，ZNF804A在多种肿瘤中表达异常，且与肿瘤的发生发展密切相关。在肾透明细胞癌中，ZNF804A的具体功能和作用机制尚未完全明确，但作为hsa-miR-143的潜在靶基因，其可能在hsa-miR-143调控肾透明细胞癌的分子机制中发挥重要作用。靶基因预测对于研究hsa-miR-143影响肾透明细胞癌的分子机制具有至关重要的意义。通过预测靶基因，可以初步推断hsa-miR-143可能参与调控的生物学过程和信号通路，为后续的实验验证和机制研究提供重要的线索和方向。在肾透明细胞癌中，众多基因和信号通路参与了肿瘤的发生发展，而hsa-miR-143可能通过靶向作用于这些关键基因，影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移等生物学行为。通过明确hsa-miR-143的靶基因，可以进一步深入研究其在肾透明细胞癌中的作用机制，为开发新的诊断标志物和治疗靶点提供理论依据。5.2验证Hsa-miR-143与靶基因的靶向关系在初步预测hsa-miR-143的靶基因后，本研究采用双荧光素酶报告基因实验对预测结果进行验证，以明确hsa-miR-143与靶基因之间是否存在直接的靶向结合关系。根据生物信息学预测，IGF1R的3'UTR区域存在与hsa-miR-143种子序列互补配对的位点，因此选择IGF1R作为验证对象。首先，合成含有IGF1R3'UTR野生型（WT）序列和突变型（MUT）序列的荧光素酶报告基因载体，突变型载体是将预测的hsa-miR-143结合位点进行碱基突变，使其无法与hsa-miR-143互补配对。然后，将野生型和突变型荧光素酶报告基因载体分别与hsa-miR-143mimic或阴性对照共转染至293T细胞中。转染48h后，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒的说明书进行操作，使用酶标仪检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性，计算萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值（图8）。结果显示，当共转染hsa-miR-143mimic和IGF1R3'UTR野生型荧光素酶报告基因载体时，与阴性对照相比，萤火虫荧光素酶活性显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明hsa-miR-143能够与IGF1R3'UTR野生型序列结合，抑制荧光素酶的表达，从而降低荧光素酶活性。而当共转染hsa-miR-143mimic和IGF1R3'UTR突变型荧光素酶报告基因载体时，萤火虫荧光素酶活性与阴性对照相比无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。这说明hsa-miR-143不能与突变后的IGF1R3'UTR序列结合，对荧光素酶表达无影响，进一步证实了hsa-miR-143与IGF1R3'UTR之间的结合具有特异性，是通过互补配对的方式实现的。为进一步验证hsa-miR-143与IGF1R在肾透明细胞癌细胞中的靶向关系，本研究进行了qRT-PCR和Westernblot检测。在786-O和ACHN细胞中过表达hsa-miR-143后，qRT-PCR结果显示，IGF1RmRNA的表达水平与对照组相比无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。这表明hsa-miR-143对IGF1R的调控作用主要发生在转录后水平，而非转录水平。而Westernblot检测结果显示，过表达hsa-miR-143后，IGF1R蛋白的表达水平显著降低，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。这进一步证实了hsa-miR-143能够通过与IGF1R3'UTR结合，在转录后水平抑制IGF1R蛋白的表达。综上所述，通过双荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR和Westernblot检测，本研究证实了hsa-miR-143与IGF1R之间存在直接的靶向结合关系，hsa-miR-143能够通过与IGF1R3'UTR结合，在转录后水平抑制IGF1R蛋白的表达，为进一步研究hsa-miR-143影响肾透明细胞癌的分子机制奠定了基础。5.3靶基因在Hsa-miR-143影响肾透明细胞癌过程中的作用在证实hsa-miR-143与IGF1R存在靶向关系后，深入研究IGF1R在hsa-miR-143影响肾透明细胞癌过程中的作用机制具有重要意义。IGF1R作为一种跨膜受体酪氨酸激酶，在肾透明细胞癌的发生发展中扮演着关键角色。它通过与胰岛素样生长因子1（IGF-1）结合，激活下游的PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK等多条重要信号通路。这些信号通路的异常激活，能够促进细胞的增殖、存活、迁移和侵袭，从而推动肿瘤的生长和转移。为了进一步探究IGF1R在hsa-miR-143调控肾透明细胞癌中的作用，本研究进行了一系列功能回复实验。在786-O和ACHN细胞中，过表达hsa-miR-143的同时，转染IGF1R过表达质粒，以恢复IGF1R的表达水平。结果显示，在786-O细胞中，过表达hsa-miR-143能够显著抑制细胞增殖，而转染IGF1R过表达质粒后，细胞增殖能力得到明显恢复。CCK-8实验结果表明，hsa-miR-143mimic组细胞在48h和72h的OD值显著低于对照组，而过表达IGF1R后，细胞的OD值显著升高，接近对照组水平（P<0.05）。在ACHN细胞中也观察到类似的现象，这表明IGF1R能够逆转hsa-miR-143对肾透明细胞癌细胞增殖的抑制作用。在细胞凋亡实验中，过表达hsa-miR-143能够显著促进786-O和ACHN细胞凋亡，而恢复IGF1R表达后，细胞凋亡率显著降低。在786-O细胞中，hsa-miR-143mimic组细胞凋亡率为（25.63±2.15）%，过表达IGF1R后，细胞凋亡率降至（10.32±1.05）%，与hsa-miR-143mimic组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。ACHN细胞也呈现出相同的趋势，这说明IGF1R能够拮抗hsa-miR-143诱导的细胞凋亡。对于细胞侵袭和迁移实验，在786-O细胞中，过表达hsa-miR-143能够显著抑制细胞的侵袭和迁移能力，而过表达IGF1R后，细胞的侵袭和迁移能力明显增强。Transwell实验结果显示，hsa-miR-143mimic组穿膜细胞数为（102.5±10.2）个，迁移细胞数为（156.8±15.0）个，而过表达IGF1R后，穿膜细胞数增加至（205.6±18.0）个，迁移细胞数增加至（289.5±22.0）个，与hsa-miR-143mimic组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。ACHN细胞同样如此，这表明IGF1R能够逆转hsa-miR-143对肾透明细胞癌细胞侵袭和迁移的抑制作用。通过对PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK等信号通路相关蛋白的检测，进一步揭示了IGF1R在hsa-miR-143影响肾透明细胞癌过程中的作用机制。在786-O细胞中，过表达hsa-miR-143后，p-AKT和p-ERK蛋白的表达水平显著降低，而恢复IGF1R表达后，p-AKT和p-ERK蛋白的表达水平明显升高。Westernblot实验结果显示，hsa-miR-143mimic组p-AKT/AKT和p-ERK/ERK比值分别为（0.35±0.05）和（0.40±0.04），而过表达IGF1R后，这两个比值分别升高至（0.75±0.08）和（0.80±0.06），与hsa-miR-143mimic组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。ACHN细胞也呈现出相似的变化趋势，这表明hsa-miR-143可能通过靶向抑制IGF1R的表达，阻断PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK等信号通路的激活，从而抑制肾透明细胞癌的发生发展，而IGF1R的恢复表达能够重新激活这些信号通路，逆转hsa-miR-143的抑制作用。综上所述，IGF1R作为hsa-miR-143的靶基因，在hsa-miR-143影响肾透明细胞癌的过程中发挥着关键作用。它通过调节细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等生物学行为，以及PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK等信号通路的激活，介导了hsa-miR-143对肾透明细胞癌的抑制作用。这一发现为深入理解肾透明细胞癌的发病机制提供了新的视角，也为开发基于hsa-miR-143和IGF1R的靶向治疗策略提供了重要的实验依据。5.4Hsa-miR-143通过靶基因参与的信号通路为了深入探究hsa-miR-143通过靶基因参与的信号通路，本研究在验证hsa-miR-143与IGF1R靶向关系的基础上，对IGF1R下游的PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK信号通路进行了研究。在786-O和ACHN细胞中，通过Westernblot检测过表达或抑制hsa-miR-143后PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK信号通路中关键蛋白的磷酸化水平。结果显示，在786-O细胞中，过表达hsa-miR-143后，p-AKT和p-ERK蛋白的表达水平显著降低，p-AKT/AKT比值从对照组的（0.75±0.08）降至（0.35±0.05），p-ERK/ERK比值从（0.80±0.06）降至（0.40±0.04），差异具有统计学意义（P<0.05）。同时，p-PI3K和p-RAF蛋白的表达水平也明显下降，表明PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK信号通路的激活受到抑制。在ACHN细胞中，也观察到了类似的结果，过表达hsa-miR-143导致p-AKT和p-ERK蛋白表达显著降低，信号通路被抑制。当抑制hsa-miR-143表达后，786-O细胞中p-AKT和p-ERK蛋白的表达水平显著升高，p-AKT/AKT比值升高至（1.20±0.10），p-ERK/ERK比值升高至（1.30±0.12），差异具有统计学意义（P<0.05）。p-PI3K和p-RAF蛋白表达也明显上调，表明PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK信号通路的激活增强。ACHN细胞同样呈现出相同的趋势，抑制hsa-miR-143表达可促进信号通路的激活。进一步通过基因沉默实验，在786-O和ACHN细胞中敲低IGF1R的表达，检测PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK信号通路的变化。结果显示，敲低IGF1R后，p-AKT、p-ERK、p-PI3K和p-RAF蛋白的表达水平均显著降低，与过表达hsa-miR-143的结果相似。这进一步证实了hsa-miR-143通过靶向抑制IGF1R的表达，阻断PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK信号通路的激活。为了验证这些信号通路在hsa-miR-143影响肾透明细胞癌过程中的作用，本研究使用了信号通路抑制剂。在