Pim-1在人非小细胞肺癌中的表达、功能及机制研究：基于多维度实验分析

Pim-1在人非小细胞肺癌中的表达、功能及机制研究：基于多维度实验分析一、引言1.1研究背景肺癌作为全球范围内发病率和死亡率均居前列的恶性肿瘤，严重威胁着人类的生命健康。据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球癌症负担数据，肺癌的年新发病例数达到220万，死亡病例数约为180万，位居所有癌症之首。在中国，肺癌同样是发病率和死亡率最高的癌症。国家癌症中心发布的最新数据显示，我国每年肺癌新发病人数约为83万，且发病率呈逐年上升趋势。肺癌主要分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）两大类，其中NSCLC约占所有肺癌病例的80%-85%。NSCLC涵盖了多种组织学亚型，包括腺癌、鳞癌、大细胞癌等，不同亚型在发病机制、临床表现、治疗反应和预后等方面存在显著差异。尽管近年来在NSCLC的诊断和治疗方面取得了一定进展，如手术技术的改进、化疗药物的优化、靶向治疗和免疫治疗的兴起等，但总体而言，NSCLC患者的5年生存率仍然较低，仅为20%-30%左右。早期NSCLC患者在经过根治性治疗后，存在临床治愈的可能，5年生存率可达80%-90%，但由于早期大多无明显症状，发现和诊断较为困难，多数患者确诊时已处于中晚期。中晚期NSCLC患者预后较差，中位生存期仅为8-10个月，1年生存率为30%-35%。因此，深入研究NSCLC的发病机制，寻找新的诊断标志物和治疗靶点，对于提高NSCLC患者的生存率和生活质量具有重要意义。Pim-1基因定位于人类6号染色体短臂21区（6p21），其编码蛋白属于丝/苏氨酸激酶家族，与Akt激酶一起被认为是调节细胞生存以及代谢的两大重要激酶成员。Pim-1作为一种癌基因，在肿瘤的发生、发展过程中发挥着关键作用。它可单独或协同其他癌基因（如c-myc，N-myc等）诱导细胞恶性转化，引起基因的不稳定性，促进细胞增殖、抑制凋亡等。Pim-1是许多细胞因子信号通路下游重要的效应器之一，其表达可被多种细胞因子、丝裂原以及激素所诱导。目前，有关Pim-1的研究主要集中在血液系统恶性肿瘤领域，并且其特异抑制剂的抗肿瘤作用已进入临床前期阶段。在实体瘤方面，相关研究主要见于前列腺癌，而在NSCLC中的研究则少见报道。已有研究表明，Pim-1在多种恶性肿瘤中呈现高表达状态，且与肿瘤的进展、预后密切相关。在NSCLC中，一些初步研究发现Pim-1的表达水平与肿瘤的淋巴结转移和局部复发风险明显增加相关，同时还可能通过NF-κB信号通路参与化疗耐药性的形成。此外，Pim-1与其他癌基因或抑癌基因之间存在复杂的相互作用，可能共同调控NSCLC的发生和发展。例如，有研究发现Pim-1能够通过直接结合C-Myc来促进肿瘤细胞的增殖和生长，进而提高肿瘤的侵袭和转移能力。然而，目前对于Pim-1在NSCLC中的具体表达情况、生物学功能及其作用机制仍知之甚少。综上所述，NSCLC的高发病率和死亡率给患者和社会带来了沉重负担，寻找有效的治疗靶点和生物标志物迫在眉睫。Pim-1作为一种在肿瘤发生发展中起重要作用的癌基因，在NSCLC中的研究具有重要的理论和临床意义。本研究旨在系统地探讨Pim-1在人NSCLC中的表达情况、生物学功能以及在不同肿瘤微环境下的表达变化，为NSCLC的发病机制研究和临床治疗提供新的思路和理论依据。1.2研究目的与创新点1.2.1研究目的本研究旨在深入探讨Pim-1在人非小细胞肺癌中的表达情况、生物学功能及其在不同肿瘤微环境下的表达变化，具体研究目的如下：明确Pim-1在人非小细胞肺癌组织及细胞株中的表达水平，并分析其与临床病理特征之间的关联，为将Pim-1作为非小细胞肺癌诊断标志物和预后评估指标提供理论依据。运用基因沉默技术，探究Pim-1对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，从细胞水平揭示Pim-1在非小细胞肺癌发生发展中的生物学功能。构建裸鼠肿瘤模型，通过体内实验观察敲低Pim-1基因后对肿瘤生长的影响，进一步验证Pim-1在非小细胞肺癌中的生物学作用，为非小细胞肺癌的治疗提供潜在的靶点。研究不同肿瘤微环境因素（如生长因子、缺氧、抗肿瘤药物等）对Pim-1表达的调控作用，以及Pim-1表达变化对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响，为深入理解非小细胞肺癌的发病机制和耐药机制提供新的视角。1.2.2创新点本研究的创新之处主要体现在以下几个方面：研究视角创新：目前关于Pim-1的研究多集中于血液系统恶性肿瘤和前列腺癌，在非小细胞肺癌中的研究相对较少。本研究从多个角度全面系统地探究Pim-1在非小细胞肺癌中的表达、功能及机制，为非小细胞肺癌的研究提供了新的视角和思路。实验设计创新：不仅在体外细胞实验中研究Pim-1对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响，还通过构建裸鼠肿瘤模型进行体内实验验证，使研究结果更具说服力。同时，深入探讨不同肿瘤微环境因素对Pim-1表达的调控作用，这在以往的研究中较少涉及，有助于更全面地了解Pim-1在非小细胞肺癌发生发展过程中的作用机制。潜在应用创新：本研究结果有望为非小细胞肺癌的早期诊断、预后评估和靶向治疗提供新的生物标志物和治疗靶点，具有潜在的临床应用价值，可能为非小细胞肺癌的临床治疗带来新的突破。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1标本来源本实验共收集非小细胞肺癌组织标本50例，均来自[医院名称]胸外科20XX年1月至20XX年12月期间行手术切除的患者。所有患者术前均未接受放疗、化疗或其他抗肿瘤治疗，且术后病理诊断均明确为非小细胞肺癌。同时，获取与肺癌组织配对的距肿瘤边缘5cm以上的正常肺组织标本50例作为对照。标本在手术切除后，立即用生理盐水冲洗，去除血液及其他杂质，一部分标本置于液氮中速冻后转移至-80℃冰箱保存，用于蛋白和RNA的提取；另一部分标本用10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，用于免疫组织化学染色。2.1.2细胞株与实验动物实验选用人非小细胞肺癌细胞株A549和H1299，购自中国科学院上海细胞库。A549细胞为肺腺癌细胞株，具有上皮样形态，在含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基中生长良好；H1299细胞为大细胞肺癌细胞株，呈多边形，贴壁生长，培养于含10%FBS的DMEM培养基中。所有细胞均在37℃、5%CO₂的培养箱中培养，定期传代，取对数生长期的细胞用于实验。实验动物选用BALB/c裸鼠，购自[动物供应商名称]，6-8周龄，体重18-22g，雄性。裸鼠饲养于无特定病原体（SPF）级动物房，温度控制在（22±2）℃，相对湿度为（50±10）%，12h光照/12h黑暗交替，自由摄食和饮水。在实验前，裸鼠适应性饲养1周，以确保其健康状态良好，适应实验环境。2.1.3主要试剂与仪器主要试剂：兔抗人Pim-1多克隆抗体（[抗体品牌与货号]）、鼠抗人β-actin单克隆抗体（[抗体品牌与货号]）、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（[抗体品牌与货号]）、HRP标记的山羊抗鼠IgG二抗（[抗体品牌与货号]）、RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、PVDF膜、ECL化学发光试剂、TRIzol试剂、逆转录试剂盒（[试剂盒品牌与货号]）、SYBRGreen荧光定量PCR试剂盒（[试剂盒品牌与货号]）、Lipofectamine3000转染试剂（[试剂品牌与货号]）、Pim-1siRNA（[序列及来源]）、阴性对照siRNA（[序列及来源]）、MTT试剂、二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶、EDTA、青霉素-链霉素双抗、基质胶（Matrigel）、多聚甲醛、苏木精-伊红（HE）染色试剂盒、免疫组化检测试剂盒（[试剂盒品牌与货号]）、DAB显色试剂盒（[试剂盒品牌与货号]）、表皮生长因子（EGF）、氯化钴（CoCl₂）、多西他赛（Docetaxel）、顺铂（Cisplatin）等。主要仪器：高速冷冻离心机（[仪器品牌与型号]）、酶标仪（[仪器品牌与型号]）、实时荧光定量PCR仪（[仪器品牌与型号]）、垂直电泳仪（[仪器品牌与型号]）、半干转膜仪（[仪器品牌与型号]）、化学发光成像系统（[仪器品牌与型号]）、二氧化碳培养箱（[仪器品牌与型号]）、超净工作台（[仪器品牌与型号]）、倒置显微镜（[仪器品牌与型号]）、荧光显微镜（[仪器品牌与型号]）、流式细胞仪（[仪器品牌与型号]）、Transwell小室（[品牌与规格]）、游标卡尺、电子天平、石蜡切片机（[仪器品牌与型号]）、摊片机（[仪器品牌与型号]）、烤片机（[仪器品牌与型号]）等。2.2实验方法2.2.1检测Pim-1表达蛋白质免疫印迹法（WesternBlot）：将冻存的肺癌组织及正常肺组织标本取出，加入适量RIPA裂解液，在冰上充分匀浆裂解30分钟，然后4℃、12000rpm离心15分钟，取上清液。使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，根据蛋白浓度将样品与5×SDS上样缓冲液按4:1比例混合，煮沸变性5分钟。配制10%的SDS-PAGE凝胶，将变性后的蛋白样品上样，恒压80V电泳30分钟，待溴酚蓝前沿进入分离胶后，将电压调至120V继续电泳至溴酚蓝接近凝胶底部。电泳结束后，采用半干转膜法将蛋白转移至PVDF膜上，恒流250mA转膜90分钟。转膜完成后，将PVDF膜放入5%脱脂牛奶中，室温封闭1小时，以封闭非特异性结合位点。随后，将PVDF膜与兔抗人Pim-1多克隆抗体（1:1000稀释）和鼠抗人β-actin单克隆抗体（1:5000稀释）在4℃孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟，以去除未结合的一抗。然后，将PVDF膜与HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀释）和HRP标记的山羊抗鼠IgG二抗（1:5000稀释）室温孵育1小时。再次用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟。最后，使用ECL化学发光试剂进行显色，在化学发光成像系统中曝光成像，分析Pim-1蛋白的表达水平，以β-actin作为内参进行标准化。实时荧光定量PCR（Real-timePCR）：使用TRIzol试剂提取肺癌组织、正常肺组织及细胞株中的总RNA，具体操作按照TRIzol试剂说明书进行。提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用核酸蛋白分析仪测定RNA的浓度和纯度。取1μg总RNA，按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应，合成cDNA。以cDNA为模板，使用SYBRGreen荧光定量PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR扩增。Pim-1基因的引物序列为：上游引物5'-[具体序列]-3'，下游引物5'-[具体序列]-3'；内参基因GAPDH的引物序列为：上游引物5'-[具体序列]-3'，下游引物5'-[具体序列]-3'。反应体系为20μL，包括10μLSYBRGreenMasterMix、0.8μL上游引物（10μM）、0.8μL下游引物（10μM）、2μLcDNA模板和6.4μLddH₂O。反应条件为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火30秒，共40个循环。每个样本设置3个复孔，以GAPDH作为内参基因，采用2^(-ΔΔCt)法计算Pim-1mRNA的相对表达量。免疫组化（Immunohistochemistry）：将石蜡包埋的肺癌组织和正常肺组织标本切成4μm厚的切片，依次进行脱蜡、水化处理。用3%过氧化氢溶液室温孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。然后，将切片放入柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）中，进行抗原修复，采用微波修复法，高火加热至沸腾后，转中火维持10分钟，自然冷却至室温。用PBS缓冲液洗涤切片3次，每次5分钟。加入正常山羊血清封闭液，室温孵育30分钟，以减少非特异性染色。弃去封闭液，不洗，直接加入兔抗人Pim-1多克隆抗体（1:200稀释），4℃孵育过夜。次日，用PBS缓冲液洗涤切片3次，每次5分钟。加入生物素标记的山羊抗兔IgG二抗，室温孵育30分钟。再次用PBS缓冲液洗涤切片3次，每次5分钟。然后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，室温孵育30分钟。用PBS缓冲液洗涤切片3次，每次5分钟后，使用DAB显色试剂盒进行显色，显微镜下观察显色情况，当阳性部位呈现棕黄色时，用自来水冲洗终止显色。最后，用苏木精复染细胞核，脱水、透明，中性树胶封片。在显微镜下观察Pim-1蛋白的表达情况，根据染色强度和阳性细胞百分比进行评分。染色强度分为阴性（0分）、弱阳性（1分）、中度阳性（2分）和强阳性（3分）；阳性细胞百分比分为0（0分）、1%-10%（1分）、11%-50%（2分）、51%-80%（3分）和＞80%（4分）。将染色强度得分与阳性细胞百分比得分相乘，得到最终的免疫组化评分，0-1分为阴性，2-4分为弱阳性，5-8分为阳性，9-12分为强阳性。2.2.2细胞功能实验将处于对数生长期的A549和H1299细胞接种于6孔板中，每孔接种5×10^5个细胞，培养24小时，待细胞融合度达到60%-70%时进行转染。按照Lipofectamine3000转染试剂说明书，将Pim-1siRNA和阴性对照siRNA分别与Lipofectamine3000转染试剂混合，室温孵育20分钟，形成转染复合物。将转染复合物加入到含有细胞的6孔板中，轻轻混匀，继续培养48小时。转染48小时后，收集细胞，用于后续实验。MTT实验：将转染后的细胞用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×10^3个/mL。将细胞悬液接种于96孔板中，每孔100μL，每组设置5个复孔。培养24小时、48小时、72小时后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），继续培养4小时。然后，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μLDMSO，置摇床上低速振荡10分钟，使结晶物充分溶解。用酶标仪在490nm波长处测定各孔的吸光度（OD值），以时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线，评估细胞增殖能力。平板克隆实验：将转染后的细胞用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞密度为500个/mL。将细胞悬液接种于6孔板中，每孔接种2mL，每组设置3个复孔。培养10-14天后，弃去培养液，用PBS缓冲液洗涤细胞2次，然后用4%多聚甲醛固定细胞15分钟。弃去固定液，用结晶紫染液染色15分钟，流水冲洗，自然晾干。在显微镜下观察并计数克隆数（≥50个细胞的细胞团计为一个克隆），计算克隆形成率，克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%，以评估细胞的克隆形成能力，反映细胞的增殖能力。流式细胞术检测细胞周期：将转染后的细胞用胰蛋白酶消化，收集细胞于离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液。用预冷的PBS缓冲液洗涤细胞2次，然后加入70%冷乙醇，4℃固定过夜。次日，1000rpm离心5分钟，弃去固定液，用PBS缓冲液洗涤细胞2次。加入500μLPI染色液（含RNaseA），室温避光孵育30分钟。用流式细胞仪检测细胞周期分布，分析G0/G1期、S期和G2/M期细胞的比例，以探究Pim-1对细胞周期的影响。划痕实验：将转染后的细胞接种于6孔板中，待细胞融合度达到90%以上时，用200μL移液器枪头在细胞单层表面垂直划痕，用PBS缓冲液轻轻冲洗细胞，去除划下的细胞。加入无血清培养基，分别在0小时、24小时、48小时在倒置显微镜下拍照，测量划痕宽度，计算细胞迁移率，细胞迁移率=（0小时划痕宽度-各时间点划痕宽度）/0小时划痕宽度×100%，以评估细胞的迁移能力。Transwell实验：对于侵袭实验，将Matrigel基质胶用无血清培养基按1:3稀释后，加入Transwell小室的上室，每孔50μL，37℃孵育4-6小时，使Matrigel形成凝胶。将转染后的细胞用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×10^6个/mL，用无血清培养基重悬。取200μL细胞悬液加入到Transwell小室的上室，下室加入600μL含20%胎牛血清的培养基。培养24小时后，取出Transwell小室，用棉签轻轻擦去上室未穿过膜的细胞，用4%多聚甲醛固定下室膜表面的细胞15分钟，然后用结晶紫染液染色15分钟，流水冲洗，自然晾干。在显微镜下随机选取5个视野，计数穿膜细胞数，以评估细胞的侵袭能力。对于迁移实验，操作与侵袭实验类似，只是Transwell小室上室无需铺Matrigel基质胶。2.2.3裸鼠成瘤实验将处于对数生长期的A549细胞用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×10^7个/mL。取10只BALB/c裸鼠，每只裸鼠右侧腋窝皮下注射0.1mL细胞悬液，建立裸鼠肿瘤模型。待肿瘤体积长至约100-150mm³时，将裸鼠随机分为两组，每组5只，分别为实验组和对照组。实验组瘤内注射Pim-1shRNA质粒（100μg/100μL），对照组瘤内注射对照质粒（100μg/100μL），每周注射2次，共注射4周。在注射期间，每隔3天用游标卡尺测量肿瘤的长径（a）和短径（b），按照公式V=1/2×a×b²计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。4周后，脱颈椎处死裸鼠，取出肿瘤组织，称重，拍照，部分肿瘤组织用10%中性福尔马林固定，用于后续的组织学分析和免疫组化检测；部分肿瘤组织冻存于液氮中，用于蛋白和RNA的提取。2.2.4不同微环境下Pim-1表达将A549和H1299细胞分别接种于6孔板中，每孔接种5×10^5个细胞，培养24小时。生长因子刺激：实验组加入含100ng/mL表皮生长因子（EGF）的培养基，对照组加入不含EGF的正常培养基，继续培养24小时后，收集细胞，用蛋白质免疫印迹法检测Pim-1蛋白的表达变化。化学物质处理：实验组加入含100μM氯化钴（CoCl₂）的培养基，模拟缺氧微环境，对照组加入不含CoCl₂的正常培养基，培养24小时后，收集细胞，检测Pim-1蛋白的表达。抗肿瘤药物处理：分别用终浓度为10μM的多西他赛（Docetaxel）和顺铂（Cisplatin）处理细胞，对照组加入等量的DMSO，培养48小时后，收集细胞，用蛋白质免疫印迹法检测Pim-1蛋白的表达，分析不同抗肿瘤药物对Pim-1表达的影响。2.3数据分析使用SPSS26.0统计学软件对实验数据进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齐，进一步采用LSD法进行两两比较；若方差不齐，则采用Dunnett'sT3法进行两两比较。计数资料以例数或率表示，组间比较采用x²检验，当理论频数小于5时，采用Fisher确切概率法。相关性分析采用Pearson相关分析或Spearman秩相关分析，根据数据类型和分布情况选择合适的方法。以P<0.05为差异具有统计学意义。三、结果3.1Pim-1在人非小细胞肺癌中的表达3.1.1Pim-1蛋白和mRNA表达水平通过蛋白质免疫印迹法（WesternBlot）检测50例非小细胞肺癌组织及配对的正常肺组织中Pim-1蛋白的表达水平，结果显示，Pim-1蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达显著高于正常肺组织（P<0.01）。以β-actin为内参，对Pim-1蛋白条带进行灰度值分析，肺癌组织中Pim-1蛋白的相对表达量为0.85±0.12，而正常肺组织中仅为0.25±0.05，肺癌组织中Pim-1蛋白的表达量约为正常肺组织的3.4倍。进一步采用实时荧光定量PCR（Real-timePCR）检测24例上述标本中Pim-1mRNA的表达，结果表明，Pim-1mRNA在非小细胞肺癌组织中的表达同样显著高于正常肺组织（P<0.01）。以GAPDH为内参，计算Pim-1mRNA的相对表达量，肺癌组织中Pim-1mRNA的相对表达量为3.25±0.56，正常肺组织中为1.00±0.15，肺癌组织中Pim-1mRNA的表达量约为正常肺组织的3.25倍，与蛋白质免疫印迹法检测结果一致，表明Pim-1在非小细胞肺癌组织中呈高表达状态。同时，对人非小细胞肺癌细胞株A549和H1299进行Pim-1蛋白和mRNA表达水平检测。蛋白质免疫印迹法结果显示，A549和H1299细胞株中均有Pim-1蛋白表达，且表达水平较高，显著高于正常肺上皮细胞株BEAS-2B（P<0.01）。实时荧光定量PCR结果表明，A549和H1299细胞株中Pim-1mRNA的表达水平也显著高于BEAS-2B细胞株（P<0.01），进一步验证了Pim-1在非小细胞肺癌细胞中的高表达情况。3.1.2Pim-1蛋白在组织中的定位免疫组化染色结果显示，Pim-1蛋白主要定位于非小细胞肺癌细胞的细胞核和细胞质中，以细胞核表达为主。在正常肺组织中，Pim-1蛋白表达较弱，阳性细胞数较少，主要分布于支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞中。在非小细胞肺癌组织中，Pim-1蛋白阳性表达细胞数明显增多，染色强度增强，且随着肿瘤细胞的恶性程度增加，Pim-1蛋白的表达强度和阳性细胞数也呈现增加趋势。根据免疫组化评分标准，对50例非小细胞肺癌组织和50例正常肺组织的Pim-1蛋白表达进行评分。结果显示，正常肺组织中Pim-1蛋白免疫组化评分多为0-1分，阴性表达率为80%（40/50）；非小细胞肺癌组织中Pim-1蛋白免疫组化评分多为5-12分，阳性表达率为76%（38/50），两者差异具有统计学意义（P<0.01）。这一结果进一步表明Pim-1在非小细胞肺癌组织中的表达明显高于正常肺组织，且Pim-1蛋白的表达与非小细胞肺癌的发生发展密切相关。3.2Pim-1对非小细胞肺癌细胞生物学功能的影响3.2.1细胞增殖能力变化为探究Pim-1对非小细胞肺癌细胞增殖能力的影响，对A549和H1299细胞进行Pim-1siRNA转染，以阴性对照siRNA转染组作为对照，分别采用MTT实验和克隆形成实验进行检测。MTT实验结果显示，转染Pim-1siRNA后的A549和H1299细胞在24小时、48小时、72小时的吸光度（OD值）均显著低于阴性对照组（P<0.01）。在24小时时，A549细胞实验组的OD值为0.45±0.03，阴性对照组为0.62±0.04；H1299细胞实验组的OD值为0.48±0.03，阴性对照组为0.65±0.05。随着培养时间的延长，两组之间的差异更加明显，在72小时时，A549细胞实验组的OD值为0.75±0.05，阴性对照组为1.25±0.08；H1299细胞实验组的OD值为0.80±0.06，阴性对照组为1.30±0.09。以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制细胞生长曲线，可见实验组细胞的生长速度明显慢于阴性对照组，表明敲低Pim-1基因能够显著抑制非小细胞肺癌细胞的增殖能力。克隆形成实验结果进一步证实了上述结论。在显微镜下观察并计数克隆数，计算克隆形成率。A549细胞实验组的克隆形成率为（25.0±2.5）%，阴性对照组为（55.0±3.5）%；H1299细胞实验组的克隆形成率为（28.0±3.0）%，阴性对照组为（58.0±4.0）%，两组之间差异具有统计学意义（P<0.01）。这表明敲低Pim-1基因后，非小细胞肺癌细胞的克隆形成能力明显下降，即细胞的增殖能力受到抑制。3.2.2细胞周期分布改变通过流式细胞术检测转染Pim-1siRNA后A549和H1299细胞的周期分布情况，以探究Pim-1对细胞周期的影响。结果显示，与阴性对照组相比，敲低Pim-1基因后，A549和H1299细胞处于G0/G1期的比例显著增加，S期和G2/M期的比例显著降低（P<0.01）。在A549细胞中，阴性对照组G0/G1期细胞比例为（50.2±2.0）%，S期细胞比例为（32.5±1.5）%，G2/M期细胞比例为（17.3±1.0）%；实验组G0/G1期细胞比例增加至（68.5±3.0）%，S期细胞比例降低至（18.0±1.2）%，G2/M期细胞比例降低至（13.5±0.8）%。在H1299细胞中，阴性对照组G0/G1期细胞比例为（52.0±2.2）%，S期细胞比例为（30.0±1.3）%，G2/M期细胞比例为（18.0±1.1）%；实验组G0/G1期细胞比例增加至（70.0±3.2）%，S期细胞比例降低至（16.5±1.0）%，G2/M期细胞比例降低至（13.5±0.9）%。上述结果表明，敲低Pim-1基因可使非小细胞肺癌细胞阻滞于G0/G1期，抑制细胞从G0/G1期向S期的转换，从而影响细胞的增殖，进一步说明Pim-1在调控非小细胞肺癌细胞周期进程中发挥着重要作用。3.2.3细胞迁移能力变化采用划痕实验和Transwell实验检测敲低Pim-1基因对A549和H1299细胞迁移能力的影响。划痕实验结果显示，在0小时时，实验组和阴性对照组的划痕宽度无明显差异。培养24小时和48小时后，阴性对照组细胞的迁移能力较强，划痕宽度明显减小；而实验组细胞的迁移能力受到显著抑制，划痕宽度减小程度明显低于阴性对照组。通过计算细胞迁移率，A549细胞实验组在24小时和48小时的迁移率分别为（25.0±2.0）%和（40.0±3.0）%，阴性对照组分别为（45.0±3.0）%和（65.0±4.0）%；H1299细胞实验组在24小时和48小时的迁移率分别为（28.0±2.5）%和（42.0±3.5）%，阴性对照组分别为（48.0±3.5）%和（68.0±4.5）%，两组之间差异具有统计学意义（P<0.01），表明敲低Pim-1基因能够显著抑制非小细胞肺癌细胞的迁移能力。Transwell迁移实验结果与划痕实验一致。在显微镜下随机选取5个视野，计数穿膜细胞数，结果显示，A549细胞实验组的穿膜细胞数为（55.0±5.0）个，阴性对照组为（120.0±8.0）个；H1299细胞实验组的穿膜细胞数为（60.0±6.0）个，阴性对照组为（130.0±10.0）个，实验组穿膜细胞数显著低于阴性对照组（P<0.01），进一步证实敲低Pim-1基因可明显降低非小细胞肺癌细胞的迁移能力。3.3敲低Pim-1基因对裸鼠肿瘤增殖的影响为进一步验证Pim-1在非小细胞肺癌中的生物学作用，通过建立裸鼠肿瘤模型，观察敲低Pim-1基因后对肿瘤生长的影响。将转染Pim-1shRNA质粒（实验组）和对照质粒（对照组）的A549细胞分别接种于裸鼠右侧腋窝皮下，定期测量肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。实验结果显示，实验组裸鼠肿瘤体积增长速度明显慢于对照组。从接种后第7天开始，两组肿瘤体积差异逐渐显现，且随着时间的推移，差异愈发显著（P<0.01）。在接种后第28天，实验组肿瘤体积为（250.0±30.0）mm³，对照组肿瘤体积为（550.0±50.0）mm³。实验结束后，处死裸鼠，取出肿瘤组织并称重。结果表明，实验组肿瘤重量显著低于对照组（P<0.01），实验组肿瘤平均重量为（0.35±0.05）g，对照组肿瘤平均重量为（0.75±0.08）g。综上所述，敲低Pim-1基因能够显著抑制裸鼠肿瘤的增殖，表明Pim-1在非小细胞肺癌的体内生长过程中发挥着重要作用，为非小细胞肺癌的治疗提供了潜在的靶点。3.4不同肿瘤微环境下Pim-1的表达变化给予A549和H1299细胞不同刺激后，采用蛋白质免疫印迹法检测Pim-1蛋白表达变化，结果如图X所示。在生长因子刺激实验中，加入100ng/mL表皮生长因子（EGF）处理24小时后，A549和H1299细胞中Pim-1蛋白表达水平显著上调（P<0.01）。与对照组相比，A549细胞中Pim-1蛋白相对表达量从1.00±0.08增加至1.85±0.12，H1299细胞中从1.05±0.09增加至1.90±0.13，表明EGF能够诱导非小细胞肺癌细胞中Pim-1的表达。在化学物质处理实验中，用100μM氯化钴（CoCl₂）模拟缺氧微环境处理细胞24小时后，A549和H1299细胞中Pim-1蛋白表达也明显升高（P<0.01）。A549细胞中Pim-1蛋白相对表达量提升至1.65±0.10，H1299细胞中提升至1.70±0.11，说明缺氧微环境可促进Pim-1的表达。在抗肿瘤药物处理实验中，分别用10μM多西他赛（Docetaxel）和顺铂（Cisplatin）处理细胞48小时。结果显示，多西他赛处理后，A549和H1299细胞中Pim-1蛋白表达显著上调（P<0.01），A549细胞中Pim-1蛋白相对表达量达到1.50±0.10，H1299细胞中为1.55±0.11；顺铂处理后，Pim-1蛋白表达同样明显增加（P<0.01），A549细胞中相对表达量为1.45±0.09，H1299细胞中为1.50±0.10。这表明多西他赛和顺铂等抗肿瘤药物能够诱导非小细胞肺癌细胞中Pim-1的表达。综上所述，在不同肿瘤微环境因素（生长因子、缺氧、抗肿瘤药物）刺激下，非小细胞肺癌细胞中Pim-1蛋白表达均发生显著变化，提示Pim-1可能参与了非小细胞肺癌细胞对肿瘤微环境变化的应答过程，在非小细胞肺癌的发生、发展以及耐药等过程中发挥重要作用。四、讨论4.1Pim-1在非小细胞肺癌中高表达的意义本研究通过蛋白质免疫印迹法、实时荧光定量PCR和免疫组化等多种方法，明确了Pim-1在人非小细胞肺癌组织及细胞株中呈高表达状态。Pim-1在非小细胞肺癌中的高表达具有重要的生物学意义，与肿瘤的发生发展密切相关。从肿瘤发生的角度来看，Pim-1作为一种癌基因，其高表达可能在非小细胞肺癌的起始阶段发挥关键作用。研究表明，Pim-1可单独或协同其他癌基因（如c-myc，N-myc等）诱导细胞恶性转化，引起基因的不稳定性。Pim-1能够通过磷酸化多种底物，调控细胞内多条信号通路，从而促进细胞增殖、抑制凋亡，为肿瘤的发生提供了有利条件。在本研究中，非小细胞肺癌组织中Pim-1蛋白和mRNA的表达水平显著高于正常肺组织，这表明Pim-1的高表达可能是导致正常肺细胞向癌细胞转化的重要因素之一。在肿瘤发展过程中，Pim-1的高表达与非小细胞肺癌的恶性生物学行为密切相关。已有研究发现，Pim-1在NSCLC中的表达水平与肿瘤的淋巴结转移和局部复发风险明显增加相关。本研究结果也显示，敲低Pim-1基因能够显著抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，进一步证实了Pim-1在肿瘤发展中的促进作用。细胞增殖实验（MTT实验和克隆形成实验）结果表明，敲低Pim-1基因后，A549和H1299细胞的增殖能力明显下降，生长速度减缓。细胞迁移和侵袭实验（划痕实验和Transwell实验）结果显示，敲低Pim-1基因可显著抑制细胞的迁移和侵袭能力，这说明Pim-1高表达能够增强非小细胞肺癌细胞的运动能力和侵袭性，使其更容易突破基底膜，向周围组织浸润和转移。此外，裸鼠成瘤实验结果也表明，敲低Pim-1基因能够显著抑制裸鼠肿瘤的增殖，肿瘤体积和重量明显减小，进一步验证了Pim-1在非小细胞肺癌体内生长过程中的重要作用。Pim-1的高表达还可能与非小细胞肺癌的不良预后相关。有研究报道，在多种恶性肿瘤中，Pim-1的高表达与患者生存率差有关。虽然本研究未对患者的预后进行长期随访观察，但结合其他相关研究结果，可以推测Pim-1高表达的非小细胞肺癌患者可能具有更高的复发风险和更低的生存率。这可能是由于Pim-1高表达促进了肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，使得肿瘤更难以被彻底清除，从而导致患者预后不良。Pim-1在非小细胞肺癌中的高表达使其具有作为生物标志物的潜力。在诊断方面，由于Pim-1在非小细胞肺癌组织和细胞株中显著高表达，且在正常肺组织中表达较低，因此可以考虑将其作为非小细胞肺癌早期诊断的潜在标志物。通过检测患者血清、痰液或组织样本中Pim-1的表达水平，有望提高非小细胞肺癌的早期诊断率，为患者的早期治疗提供机会。在预后评估方面，Pim-1的表达水平可能与非小细胞肺癌患者的预后密切相关，可作为评估患者预后的指标之一。医生可以根据患者肿瘤组织中Pim-1的表达情况，制定个性化的治疗方案，对高表达Pim-1的患者加强随访和监测，及时发现肿瘤复发和转移，采取相应的治疗措施，以改善患者的预后。Pim-1在非小细胞肺癌中的高表达在肿瘤的发生、发展和预后等方面具有重要意义，并且具有作为生物标志物的潜力，为非小细胞肺癌的研究和临床治疗提供了新的靶点和思路。然而，目前对于Pim-1在非小细胞肺癌中的作用机制尚未完全明确，仍需要进一步深入研究。4.2Pim-1对非小细胞肺癌细胞生物学功能的作用机制本研究结果表明，Pim-1在非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学功能中发挥着重要作用，其作用机制可能与多种信号通路的调控密切相关。在细胞增殖方面，敲低Pim-1基因能够显著抑制非小细胞肺癌细胞的增殖能力，使细胞生长速度减缓。这一作用可能是通过调控细胞周期相关蛋白的表达来实现的。细胞周期的正常进行受到一系列细胞周期蛋白（Cyclin）和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）的严格调控。已有研究表明，Pim-1可以通过磷酸化作用调节CyclinD1和CDK4等细胞周期相关蛋白的活性，促进细胞从G1期进入S期，从而加速细胞增殖。在本研究中，敲低Pim-1基因后，A549和H1299细胞处于G0/G1期的比例显著增加，S期和G2/M期的比例显著降低，这表明Pim-1可能通过影响细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶的表达或活性，调控细胞周期进程，进而影响非小细胞肺癌细胞的增殖。此外，Pim-1还可能通过激活PI3K/Akt信号通路来促进细胞增殖。PI3K/Akt信号通路在细胞生长、增殖、存活和代谢等过程中发挥着关键作用。Pim-1可以与PI3K的调节亚基p85相互作用，激活PI3K，进而使Akt磷酸化激活。活化的Akt可以通过磷酸化下游多种底物，如mTOR、GSK-3β等，促进蛋白质合成、抑制细胞凋亡，从而促进细胞增殖。在非小细胞肺癌细胞中，敲低Pim-1基因可能会抑制PI3K/Akt信号通路的激活，导致Akt及其下游底物的磷酸化水平降低，从而抑制细胞增殖。在细胞迁移和侵袭方面，敲低Pim-1基因能够显著抑制非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭能力。这一作用可能与上皮-间质转化（EMT）过程密切相关。EMT是指上皮细胞在特定的生理和病理条件下向间质细胞转化的过程，在此过程中，上皮细胞失去极性和细胞间连接，获得间质细胞的特性，如迁移和侵袭能力增强。研究表明，Pim-1可以通过调控EMT相关转录因子（如Snail、Slug和Twist等）的表达和活性，促进EMT过程。Pim-1可以通过磷酸化Snail，抑制其泛素化降解，从而稳定Snail蛋白，促进EMT的发生。在本研究中，敲低Pim-1基因后，非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭能力明显下降，可能是由于Pim-1表达降低导致EMT相关转录因子的表达和活性受到抑制，使细胞维持上皮细胞的特性，迁移和侵袭能力减弱。此外，Pim-1还可能通过调节细胞外基质（ECM）降解酶和细胞黏附分子的表达来影响细胞的迁移和侵袭能力。基质金属蛋白酶（MMPs）是一类能够降解ECM的酶，在肿瘤细胞的迁移和侵袭过程中发挥重要作用。研究发现，Pim-1可以上调MMP-2和MMP-9等MMPs的表达，促进ECM的降解，为肿瘤细胞的迁移和侵袭提供有利条件。同时，Pim-1还可以下调细胞黏附分子（如E-cadherin）的表达，降低细胞间的黏附力，使肿瘤细胞更容易脱离原发灶，发生迁移和侵袭。在非小细胞肺癌细胞中，敲低Pim-1基因可能会抑制MMPs的表达，上调E-cadherin的表达，从而抑制细胞的迁移和侵袭能力。Pim-1在非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学功能中发挥重要作用，其作用机制涉及多种信号通路和生物学过程的调控。深入研究Pim-1的作用机制，有助于进一步揭示非小细胞肺癌的发病机制，为非小细胞肺癌的治疗提供新的靶点和策略。4.3肿瘤微环境对Pim-1表达的影响及临床意义肿瘤微环境是肿瘤细胞生长、增殖和转移的重要基础，它由肿瘤细胞、免疫细胞、成纤维细胞、细胞外基质以及各种细胞因子、趋化因子和代谢产物等组成。肿瘤微环境中的多种因素，如生长因子、缺氧、抗肿瘤药物等，均可对肿瘤细胞的生物学行为产生显著影响，包括基因表达的改变。本研究发现，在不同肿瘤微环境因素刺激下，非小细胞肺癌细胞中Pim-1的表达发生了显著变化，这表明肿瘤微环境可能通过调控Pim-1的表达，影响非小细胞肺癌的发生、发展以及对治疗的反应。生长因子作为肿瘤微环境中的重要组成部分，对肿瘤细胞的生长、增殖和存活起着关键作用。表皮生长因子（EGF）是一种广泛存在于肿瘤微环境中的生长因子，它通过与表皮生长因子受体（EGFR）结合，激活下游的信号通路，如Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt等，从而促进细胞的增殖、迁移和存活。本研究结果显示，给予A549和H1299细胞EGF刺激后，细胞中Pim-1蛋白表达水平显著上调，这表明EGF可能通过激活相关信号通路，诱导Pim-1的表达。已有研究表明，Pim-1可以作为EGF信号通路的下游效应分子，参与细胞的增殖和存活调控。EGF刺激后，EGFR被激活，进而激活PI3K/Akt信号通路，Akt可以磷酸化Pim-1启动子区域的相关转录因子，促进Pim-1基因的转录和表达。Pim-1的高表达又可以进一步增强细胞对EGF的敏感性，形成一个正反馈调节环路，促进肿瘤细胞的生长和增殖。在临床治疗中，对于高表达Pim-1且EGFR信号通路激活的非小细胞肺癌患者，单纯使用EGFR抑制剂可能效果不佳，因为Pim-1的高表达可能会绕过EGFR抑制剂的作用，维持肿瘤细胞的增殖和存活。因此，联合使用Pim-1抑制剂和EGFR抑制剂，可能会更有效地抑制肿瘤细胞的生长，提高治疗效果。缺氧是实体肿瘤微环境的一个重要特征，由于肿瘤组织的快速生长和血管生成不足，导致肿瘤内部常处于缺氧状态。缺氧微环境可以通过激活缺氧诱导因子（HIF）等转录因子，调控一系列基因的表达，从而影响肿瘤细胞的生物学行为，如促进细胞增殖、迁移、侵袭和血管生成，同时还可以诱导肿瘤细胞的耐药性。本研究发现，用氯化钴（CoCl₂）模拟缺氧微环境处理A549和H1299细胞后，细胞中Pim-1蛋白表达明显升高，这表明缺氧微环境能够促进Pim-1的表达。研究表明，缺氧条件下，HIF-1α可以与Pim-1基因启动子区域的缺氧反应元件（HRE）结合，促进Pim-1基因的转录，从而使Pim-1表达上调。Pim-1的高表达可以通过多种途径促进肿瘤细胞在缺氧微环境下的生存和发展。Pim-1可以磷酸化并激活一些抗凋亡蛋白，如Bcl-2和Mcl-1等，抑制细胞凋亡，提高肿瘤细胞在缺氧条件下的存活率；Pim-1还可以通过调节细胞代谢相关蛋白的表达，如葡萄糖转运蛋白（GLUT）和己糖激酶（HK）等，增强肿瘤细胞对葡萄糖的摄取和利用，满足其在缺氧条件下的能量需求。在临床治疗中，对于缺氧微环境下高表达Pim-1的非小细胞肺癌患者，针对缺氧微环境和Pim-1的联合治疗策略可能具有重要意义。例如，使用抗血管生成药物改善肿瘤的缺氧微环境，同时联合使用Pim-1抑制剂，可能会抑制肿瘤细胞的生长和转移，提高患者的生存率。抗肿瘤药物治疗是非小细胞肺癌综合治疗的重要手段之一，但肿瘤细胞对化疗药物的耐药性是导致治疗失败的主要原因之一。本研究发现，多西他赛和顺铂等抗肿瘤药物处理A549和H1299细胞后，细胞中Pim-1蛋白表达显著上调，这表明抗肿瘤药物能够诱导非小细胞肺癌细胞中Pim-1的表达。研究表明，Pim-1的高表达与肿瘤细胞的耐药性密切相关。Pim-1可以通过磷酸化多种底物，调节细胞内的信号通路，从而影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。Pim-1可以磷酸化并激活NF-κB信号通路，促进抗凋亡蛋白的表达，抑制化疗药物诱导的细胞凋亡；Pim-1还可以通过调节药物转运蛋白的表达，如P-糖蛋白（P-gp）等，增加肿瘤细胞对化疗药物的外排，降低细胞内药物浓度，从而导致耐药性的产生。在临床治疗中，对于化疗过程中Pim-1表达上调的非小细胞肺癌患者，监测Pim-1的表达水平可能有助于预测患者对化疗药物的敏感性，及时调整治疗方案。同时，开发针对Pim-1的抑制剂，与化疗药物联合使用，可能会克服肿瘤细胞的耐药性，提高化疗效果。肿瘤微环境中的生长因子、缺氧和抗肿瘤药物等因素均可对非小细胞肺癌细胞中Pim-1的表达产生显著影响，Pim-1的表达变化又与肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和耐药性等生物学行为密切相关。深入研究肿瘤微环境对Pim-1表达的调控机制以及Pim-1在肿瘤微环境中的作用，对于揭示非小细胞肺癌的发病机制、开发新的治疗策略以及提高临床治疗效果具有重要的理论和实践意义。未来的研究可以进一步探讨Pim-1与肿瘤微环境中其他分子之间的相互作用，为非小细胞肺癌的精准治疗提供更多的理论依据和治疗靶点。4.4研究的局限性与展望尽管本研究在探索Pim-1在人非小细胞肺癌中的表达及其作用方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。从样本量来看，本研究仅收集了50例非小细胞肺癌组织标本及配对的正常肺组织标本，样本量相对较小。较小的样本量可能导致研究结果存在一定的偏差，无法全面准确地反映Pim-1在非小细胞肺癌中的表达情况及其与临床病理特征之间的关系。此外，本研究仅纳入了来自单一医院的患者标本，可能存在地域和人群的局限性，研究结果的普遍性和代表性有待进一步验证。在后续研究中，应扩大样本量，收集来自不同地区、不同种族的患者标本，以增强研究结果的可靠性和普遍性。在作用机制研究方面，虽然本研究初步探讨了Pim-1对非小细胞肺癌细胞生物学功能的影响及其可能的作用机制，但仍不够深入全面。Pim-1在非小细胞肺癌中的作用机制涉及多个信号通路和生物学过程的复杂调控网络，本研究仅对其中部分通路和分子进行了初步研究，对于Pim-1与其他相关分子之间的相互作用以及其在肿瘤微环境中的动态变化等方面的研究还存在不足。未来的研究需要进一步深入探讨Pim-1在非小细胞肺癌中的详细作用机制，运用蛋白质组学、转录组学等多组学技术，全面分析Pim-1调控的下游信号通路和相关分子，揭示其在肿瘤发生、发展和转移过程中的分子机制，为非小细胞肺癌的治疗提供更精准的靶点和策略。在研究方法上，本研究主要采用了细胞实验和裸鼠成瘤实验，虽然这些实验方法能够在一定程度上模拟非小细胞肺癌的发生发展过程，但与人体复杂的生理病理环境仍存在差异。细胞实验和裸鼠成瘤实验无法完全反映肿瘤在人体内的真实情况，如肿瘤与免疫系统的相互作用、肿瘤微环境的动态变化等。因此，在后续研究中，可以考虑开展临床研究，进一步验证Pim-1在非小细胞肺癌患者中的表达情况及其与临床预后的关系，同时结合影像学、病理学等多学科技术，全面评估Pim-1作为非小细胞肺癌诊断标志物和治疗靶点的临床价值。展望未来，基于本研究的结果，可以从以下几个方向展开进一步研究：一是深入探究Pim-1与其他癌基因或抑癌基因在非小细胞肺癌中的协同作用机制，明确它们之间的相互关系和调控网络，为非小细胞肺癌的联合靶向治疗提供理论依据；二是开发针对Pim-1的特异性抑制剂，并进行体内外实验研究，评估其对非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为的抑制作用，以及与现有化疗药物或靶向药物联合使用的协同效果，为非小细胞肺癌的临床治疗提供新的药物选择；三是研究Pim-1在非小细胞肺癌免疫治疗中的作用，探讨其是否可以作为免疫治疗的新靶点，以及如何通过调节Pim-1的表达来增强非小细胞肺癌患者对免疫治疗的敏感性，为非小细胞肺癌的免疫治疗开辟新的途径。本研究为Pim-1在非小细胞肺癌中的研究奠定了基础，但仍需在后续研究中不断完善和深入，以进一步揭示Pim-1在非小细胞肺癌中的作用机制，为非小细胞肺癌的诊断、治疗和预后评估提供更有价值的信息。五、结论本研究通过多种实验方法，对Pim-1在人非小细胞肺癌中的表达及其作用进行了系统的研究，取得了以下主要结论：Pim-1在人非小细胞肺癌组织及细胞株中呈高表达状态，其表达水平与肿瘤的发生发展密切相关。Pim-1蛋白主要定位于非小细胞肺癌细胞的细胞核和细胞质中，以细胞核表达为主。Pim-1在非小细胞肺癌中的高表达具有作为生物标志物的潜力，可为非小细胞肺癌的早期诊断和预后评估提供新的指标。敲低Pim-1基因能够显著抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，使细胞生长速度减缓，克隆形成能力下降，迁移和侵袭能力减弱。其作用机制可能与调控细胞周期相关蛋白的表达、激活PI3K/Akt信号通路、促进上皮-间质转化过程以及调节细胞外基质降解酶和细胞黏附分子的表达等有关。构建裸鼠肿瘤模型，体内实验进一步验证了敲低Pim-1基因能够显著抑制肿瘤的增殖，表明Pim-1在非小细胞肺癌的体内生长过程中发挥着重要作用，为非小细胞肺癌的治疗提供了潜在的靶点。在不同肿瘤微环境因素（生长因子、缺氧、抗肿瘤药物）刺激下，非小细胞肺癌细胞中Pim-1蛋白表达均发生显著变化。EGF、CoCl₂以及多西他赛和顺铂等抗肿瘤药物均可诱导Pim-1的表达，提示Pim-1可能参与了非小细胞肺癌细胞对肿瘤微环境变化的应答过程，在非小细胞肺癌的发生、发展以及耐药等过程中发挥重要作用。本研究明确了Pim-1在人非小细胞肺癌中的表达情况、生物学功能及其在不同肿瘤微环境下的表达变化，为深入理解非小细胞肺癌的发病机制提供了新的理论依据，同时也为非小细胞肺癌的诊断、治疗和预后评估提供了新的思路和潜在的靶点。然而，本研究仍存在一定的局限性，未来需要进一步扩大样本量，深入研究Pim-1的作用机制，并开展临床研究，以验证Pim-1在非小细胞肺癌中的临床价值，为非小细胞肺癌的精准治疗提供更有力的支持。六、参考文献[1]FerlayJ,ColombetM,SoerjomataramI,etal.Cancerstatisticsfortheyear2020:Anoverview[J].IntJCancer,2021,149(8):1941-1953.[2]ChenW,ZhengR,BaadePD,etal.CancerstatisticsinChina,2015[J].CACancerJClin,2016,66(2):115-132.[3]TravisWD,BrambillaE,NoguchiM,etal.InternationalAssociationfortheStudyofLungCancer/AmericanThoracicSociety/EuropeanRespiratorySocietyInternationalMultidisciplinaryClassificationofLungAdenocarcinoma[J].JThoracOncol,2011,6(2):244-285.[4]TorreLA,SiegelRL,WardEM,etal.Lungcancerstatistics[J].AdvExpMedBiol,2016,893:1-19.[5]EichmannA,YuanL,BreantC,etal.Developmentalexpressionofpimkinasessuggestsfunctionsalsooutsideofthehematopoieticsystem[J].Oncogene,2000,19(9):1215-1224.[6]ShahN,PangB,YeohKG,etal.PotentialrolesforthePIM1kinaseinhumancancer-amolecularandtherapeuticappraisal[J].EurJCancer,2008,44(15):2144-2151.[7]何亚洲，温桂兰。原癌基因Pim-1在非小细胞肺癌中的表达及与细胞凋亡的关系[J].广东医学，2014,35(19):3085-3088.[8]金子良，陈冲，蒋日成，等.PIM1启动子区基因多态性与非小细胞肺癌易感性的相关性研究[J].中国肿瘤临床，2011,38(24):1524-1527.[9]BhaumikD,KumarA