生物分离与纯化技术94课件

生物分离与纯化技术生物分离纯化的一般步骤是什么？复习回顾发酵液预处理

初步纯化高度纯化成品加工目标产物目录1、预处理概述2、发酵液过滤特性的改变3、发酵液的相对纯化4、凝聚与絮凝1预处理概述导入预处理固液分离初步提取高度纯化成品加工改善发酵液过滤特性、细胞破碎、过滤、离心分离、膜分离沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶重结晶、色谱分离、膜分离浓缩、无菌过滤、干燥、成型药物分离纯化的一般工艺步骤发酵液产品主要内容何为发酵液预处理，目的是什么？预处理的主要任务是什么？主要内容何为发酵液预处理，目的是什么？胞内产物和胞外产物胞外产物：

抗生素、胞外酶、一些多糖、氨基酸等发酵产物。胞内产物：

由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在细胞内沉积。一些抗生素和酯类物质包含在细胞内。预处理目的1：将胞内目标产物转移到溶液中（细胞破碎）主要内容何为发酵液预处理，目的是什么？发酵液的组成水、菌体及碎片、培养基残渣、金属离子、杂蛋白、其他杂质何为发酵液预处理，目的是什么？发酵液的组成目标产物水、菌体及碎片、培养基残渣、金属离子、杂蛋白、其他杂质颗粒小，可压缩粘性大影响过滤效率改善过滤特性，去除颗粒性杂质预处理目的何为发酵液预处理，目的是什么？发酵液的组成目标产物水、菌体及碎片、培养基残渣、金属离子、杂蛋白、其他杂质影响离子交换效率影响萃取分层去除杂蛋白；去除金属离子预处理目的2：预处理概述：1、预处理定义：采用物理、化学的方法，使目标产物转移到溶液中，同时去除发酵液中的金属离子、悬浮性颗粒杂质，改善溶液的性状，以利于后续各步操作进行的过程。何为发酵液预处理？预处理概述：2、预处理的目的和作用：1）使目标产物转移到溶液中；2）去除发酵液中的金属离子、杂蛋白、悬浮性颗粒杂质；3）改善过滤特性；利于后续各步操作进行的过程。何为发酵液预处理？预处理概述：何为发酵液预处理？1.改善过滤特性；2.去除金属离子；3.去除杂蛋白；4.使目标产物转移到溶液中；5.去除悬浮性颗粒杂质；1.改善过滤特性；2.去除金属离子；3.去除杂蛋白；4.细胞破碎（使目标产物转移到溶液中）；5.固液分离（过滤、离心）；预处理的目的预处理的主要任务内容小结《现代药物分离与纯化技术》何为发酵液预处理发酵液预处理的目的是什么？预处理的任务？内容小结《现代药物分离与纯化技术》2发酵液过滤特性的改变【学习目标】1.熟悉发酵液过滤特性的改变方法2.掌握发酵液的相对纯化方法微生物发酵液的特性发酵产物浓度较低，悬浮液中大部分是水；悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；固体粒子可压缩性大；液相粘度大，大多为非牛顿型流体性质不稳定，随时间变化，易受空气氧化、微生物污染等作用影响。成分复杂杂质较多发酵液的特性过滤特性：影响过滤效率的发酵液的性质发酵液的组成不利于过滤的特性利于过滤的特性预处理前的特性：粘度大、颗粒小、密度小、呈稳定的胶体状态预处理后的特性：粘度小、颗粒大、密度大、不稳定、易沉淀过滤速度慢，滤液质量差。过滤速度快，滤液质量好。水、菌体及碎片、培养基残渣、金属离子、杂蛋白、其他杂质发酵液过滤特性的改变改善发酵液过滤特性的方法1、降低液体黏度：滤液通过滤饼的速率与液体的粘度成反比。

2、调整pH：pH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH可改善过滤特性3、加入反应剂：加入反应剂可和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀4、加入助滤剂：这是一种不可压缩的多空微粒，能使滤饼疏松，滤速增大改善发酵液过滤特性的方法——降低液体黏度降低液体黏度常用的方法有加水稀释法和加热法（2）加水稀释法

操作：加水，发酵液被稀释，流动性变好。注意：加水之后，溶液被稀释，溶液体积变大，过滤时间加长。适用性：加水一倍，粘度下降大于50%。

后续处理适合稀释的场合。

改善发酵液过滤特性的方法——降低液体黏度降低液体黏度常用的方法有加水稀释法和加热法（2）加热法（Heating）操作：通过换热器、通入蒸汽或热水。适用性：热稳定的产物。注意：严格控制加热温度与时间，防止目标产物失活、细胞溶解，增加后续分离的复杂性。例：含麦芽汁12%的发酵液，在40℃时黏度为1.2*10-3Pa.S，温度升至75℃，滤速可加倍。

改善发酵液过滤特性的方法——调节PH调节pH（RegulationofPH）：发酵工业中发酵液预处理较常用的方法之一操作：加入酸、碱或缓冲溶液原理：pH值改变悬浮物的电荷性质，改变胶体物质的电离度，进而影响胶体稳定性，其中的杂蛋白容易沉淀注意：防止pH导致蛋白质等生物药物变性。应用：在味精生产中，利用等电点沉淀法提取谷氨酸。（1）反应剂可和某些可溶性盐类（如CaSO4、CaCl2

、AlPO4等）发生反应生成不溶性沉淀，如新生霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠，生成磷酸钙沉淀。生成的沉淀能防止菌丝体黏结，使菌丝具有块状结构；沉淀本身可作为助滤剂，并且能使胶体物和悬浮物凝固，从而改善过滤性能。（2）若发酵液中含不溶性多糖物质，则最好用酶将其转化为单糖，提高过滤速率。如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前先加淀粉酶消化后再加硅藻土助滤剂。（3）正确选择反应剂和反应条件，能使过滤速率提高3-10倍。改善发酵液过滤特性的方法——加入反应剂加入的反应剂不同，对发酵液的作用也不同，常见的原理有两种新生霉素发酵液氯化钙磷酸钠磷酸钙沉淀反应剂：氯化钙和磷酸钠原理：生成的沉淀起助滤作用，同时使发酵液中蛋白质凝固结块，将滤速提高3-10倍改善发酵液过滤特性的方法——加入反应剂例：万古霉素的淀粉发酵液0.025%的淀粉酶

搅拌30min滤速提高5倍加2.5%硅藻土改善发酵液过滤特性的方法——加入反应剂例：淀粉酶：将多糖转化为溶解度较大的单糖，降低粘度。硅藻土：起助滤作用改善发酵液过滤特性的方法——加入反应剂1）生成的能防止菌丝体黏结的沉淀2）沉淀本身可作为助滤剂3）溶性将多糖转化为溶解度较大的单糖加入反应剂的原理改善发酵液过滤特性的方法——加入助滤剂加助滤剂（Filteraids）助滤剂：是一种颗粒均匀、质地坚硬、不可压缩的多孔微粒，能使滤饼疏松，滤速增大。硅藻土有较高的惰性和不溶性，能形成坚硬的不可压缩的滤饼，是最常用的助滤剂，此外还有纤维素、石棉粉等，最常用的是硅藻土。操作方法：一种是在过滤介质表面预涂助滤剂；另一种是直接加入发酵液；也可两种方法同时使用内容小结《现代药物分离与纯化技术》发酵液过滤特性改变的方法有：降低液体粘度调整pH加入反应剂加入助滤剂3发酵液的相对纯化发酵液的相对纯化发酵液的相对纯化

1.

高价无机离子的去除（Removalofinorganicion）：在采用离子交换法提取时，会影响树脂对生化物质的交换容量。2.杂蛋白的去除方法：不仅在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力，而且在使用有机溶剂法或双水相萃取时，易发生乳化现象，使两相分离不清。常用方法有：•发酵液中的主要无机离子有Ca2+、Mg2+、Fe3+•除去的方法主要是生成沉淀或者络合物，消除金属离子对后续分离过程的影响或过滤除去。1）沉淀法；2）变性法；3)吸附法发酵液的相对纯化——高价无机离子的去除钙离子的去除草酸的回收：四环类抗生素废液硫酸铅60℃草酸90-95℃，用硫酸分解过滤、冷却、结晶草酸铅草酸钙沉淀（注意回收草酸）Ca2+草酸/草酸纳+Ca2+的去除通常使用草酸，但草酸溶解度较小，故用量大时，可用其可溶性盐（如草酸钠）。反应生成的草酸钙还能使蛋白质凝固，改善发酵液的过滤性能。但草酸价格较贵，应注意回收。发酵液的相对纯化——高价无机离子的去除镁离子的去除三聚磷酸钠镁(MgNa3P3O10)可溶性络合物Mg2+三聚磷酸钠(Na5P3O10)+草酸镁的溶解度较大，虽然发酵液中Mg2+的浓度一般不是很高，但加入草酸不能除尽Mg2+，可以加入三聚磷酸钠，它和Mg2+形成可溶性络合物。用磷酸盐处理，也能大大降低Mg2+和Ca2+的浓度。发酵液的相对纯化——高价无机离子的去除铁离子的去除：要除去Fe3+，可加入黄血盐，使形成普鲁士蓝沉淀。普鲁士蓝(Fe4[Fe(CN)6]3)沉淀Fe3+黄血盐(K4Fe(CN)6)+3K4Fe(CN)6+42Fe3+

=Fe4[Fe(CN)6]3↓

+12K+高价无机离子的去除——内容小结《现代药物分离与纯化技术》发酵液中的金属离子有：Ca2+、Mg2+、Fe3+去除方法：加反应剂使其沉淀发酵液的相对纯化——杂蛋白的去除杂蛋白的去除（Removalofuselessprotein）杂蛋白的存在对后续分离的影响：在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力；在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清；

在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。变性、沉淀、与固形物一起除去蛋白质胶粒沉淀变性吸附发酵液的相对纯化——杂蛋白的去除杂蛋白的去除方法变性、沉淀、与固形物一起除去蛋白质胶粒沉淀变性吸附1.沉淀法2.变性法3.吸附法发酵液的相对纯化——杂蛋白的去除1.杂蛋白去除的方法——沉淀法（蛋白质的两性）在不同的pH下，蛋白质会带有不同种类的电荷酸性溶液中，蛋白质带正电荷，与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；碱性溶液中，蛋白质带负电荷，与一些阳离子，如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。1.沉淀法发酵液的相对纯化——杂蛋白的去除2.杂蛋白去除的方法——变性法（降低蛋白质的溶解度）加热（最常用）：加热不仅使蛋白质变性，同时降低液体粘度，提高过滤速率。如将柠檬酸发酵液加热至80℃大幅度调节pH值，如将发酵液pH值调至偏酸性或偏碱性范围加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；有机溶剂易燃易爆，因此有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。不足之处发酵液的相对纯化——杂蛋白的去除2.杂蛋白去除的方法——变性法柠檬酸发酵液加热至80℃滤液黏度降低滤速提高杂蛋白变性凝固例：原理：加热使蛋白质凝固变性适用性：适用于热稳定的药物。要严格控制加热的温度和时间。发酵液的相对纯化——杂蛋白的去除2.杂蛋白去除的方法——变性法

要严格控制加热的温度和时间抗生素生产pH=2-3滤液黏度降低滤速提高杂蛋白变性凝固例：原理：强酸性环境使蛋白质凝固、变性注意：极端pH值会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱。发酵液的相对纯化——杂蛋白的去除2.杂蛋白去除的方法——变性法

要严格控制加热的温度和时间例：原理：加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂会使蛋白质变性沉淀。注意：通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。核酸抽提氯仿滤液黏度降低滤速提高杂蛋白变性为絮状发酵液的相对纯化——杂蛋白的去除3.杂蛋白去除的方法——吸附法加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去例：在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质，此法去蛋白已取得很好的效果。例：在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去四环素类抗生素黄血盐和硫酸锌滤液吸附蛋白黏度降低滤速提高亚铁氰化锌钾的胶状沉淀杂蛋白的去除——内容小结《现代药物分离与纯化技术》去除杂蛋白的方法：沉淀法变性法吸附法4凝聚与絮凝【学习目标】1.熟悉凝聚的概念和原理2.掌握凝聚的基本原理和影响因素3.掌握絮凝剂的选择方法产品开发数据分析市场份额项目名称系统设置商务交流工作流程产品设计文案交付向悬浮液中加入某种电解质，在电解质的作用下，悬浮液体系不稳定，胶粒间吸引作用加强，相互碰撞而产生聚集的过程，称为凝聚。凝聚的定义：对象：稳定分散的悬浮液（发酵液）方法：加入电解质目标：聚集、沉淀

结果：发酵液过滤特性改善凝聚技术(coagulation)交付凝聚的作用：凝聚的作用：改善发酵液过滤特性的方法之一。用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理。凝聚的效果：有效改变悬浮性颗粒杂质的分散状态，提高过滤效率，提高滤液质量。凝聚技术(coagulation)固液分离发酵液特征：菌体细小、粘稠、呈胶体状态存在问题：过滤速度慢，滤液质量差交付凝聚的原理--------菌体1、斥力阻止靠近。发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电引力作用使溶液中带相反电荷的粒子被吸附在其周围，在其界面上形成了双电子层。这种双电层的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状体。2、水化膜阻碍聚沉。多数胶体表面有很多极性基团，易吸附水分子，形成水化层。它既使蛋白溶于水，又可隔离蛋白，使其不易沉淀。--------蛋白质发酵液中胶体颗粒稳定的原因：稳定分散在同电相斥和水化膜的作用下，发酵液中的颗粒处于稳定的悬浮状态。--------菌体1、水化膜变薄。电解质抢夺颗粒表面的水膜，使水化膜变薄或消失；2、斥力减弱。电解质中和电荷，使胶粒间斥力减弱--------蛋白质

凝聚的原理：电解质（氢氧化钙）稳定性破坏凝聚技术(coagulation)电解质破坏了胶体的两个稳定因素，发酵液中的胶体离子产生聚集、沉淀。凝聚剂：FeSO4.7H2O、ZnSO4

、MgCO3、Ca(OH)2或石灰等常用的凝聚电解质有：Al2(SO4)3.18H2O(明矾)、AlCl3.6H2O、FeCl3.6H2O凝聚技术(coagulation)一、凝聚技术(coagulation)凝聚值Cf：使胶粒发生凝聚的最小电解质浓度（mmol/L）称为凝聚值。电解质的凝聚能力可用凝聚值来表示。一般来说，电解质的凝聚值越小，凝聚能力越强。凝聚能力大小原则：阳离子>阴离子；价数高>价数低；水化半径小>水化半径大的。发酵液中胶体粒子的凝聚能力次序：

Al3+>Fe3+

>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+凝聚能力(coagulation)凝聚因素：实验确定合适的参数：凝聚剂种类；用量；pH、温度、搅拌时间和强度凝聚技术(coagulation)凝聚效果：可以使得细胞、菌体或蛋白质等凝聚（１mm），沉淀细小，有时不能有效分离。凝聚作用的局限：采用凝聚方法得到的凝聚体，颗粒常常比较细小，有时还不能有效地进行分离。凝聚技术(coagulation)采用絮凝法常可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易分离。使用絮凝技术预处理发酵液的优点不仅在于提高固-液分离速度，分离菌体、细胞和细胞碎片等，还在于能有效除去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量。凝聚与絮凝加氧化钙聚丙烯酰胺模拟实验用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理。有效改变悬浮性颗粒杂质的分散状态，提高过滤效率。凝聚和絮凝技术作用效果类似:凝聚和絮凝技术作用原理不同絮凝技术(flocculation)聚丙烯酰胺指在高分子絮凝剂的作用下，悬浮粒子之间通过架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程。10mm。

絮凝的定义：絮凝技术(flocculation)用途：用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理。以改善过滤特性，提高过滤效率和滤液质量。能溶于水的高分子聚合物，分子量可达数万至千万以上，它们具有长链结构，其链节上含有许多活性官能团，可以带有多价电荷，也可以不带电性。

絮凝剂：2、活性官能团1、具有长链结构絮凝技术(flocculation)例：实验中的聚丙烯酰胺结构特点

絮凝剂：非离子型根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类：阴离子型（含有羧基）阳离子型（含有胺基）CONH3+絮凝技术(flocculation)CONH3+

絮凝剂：根据来源不同，工业常用絮凝剂分为三类：絮凝技术(flocculation)1）有机高分子聚合物：如聚丙烯酰胺类、聚苯乙烯类。2）无机高分子聚合物：如聚合铝盐(PAC)、聚合铁盐等。3）天然有机高分子絮凝剂：如淀粉、明胶、壳多糖等；

微生物代谢物。难降解，有些有毒性难操作、难控制、效果差易降解、无毒、发展快优点用量少，一般以mg/L计量；絮凝体粗大，分离效果好；絮凝速度快；种类多，适用范围广。缺点存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。

最常用絮凝剂聚丙烯酰胺类絮凝剂：絮凝技术(flocculation)吸附（静电引力、范德华力或氢键的作用）架桥作用2、活性官能团1、高相对分子量、长链、线性结构

絮凝的原理：絮凝技术(flocculation)絮凝剂通过静电引力、范德华力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒地表面，当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同胶粒表面上产生架桥连接时，就形成了较大的絮团。

絮凝的原理：混合吸附菌体细胞蛋白质絮凝剂不稳定微粒絮凝技术(flocculation)絮凝剂通过静电引力、范德华力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面

絮凝的原理：架桥不稳定微粒不规则絮团絮凝技术(flocculation)当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同胶粒表面上产生架桥连接时，就形成了较大的絮团。

絮凝的原理：压缩、重排不规则絮团絮团小球（10mm）（体积增大，聚结、沉降稳定性下降，从发酵液中沉淀出来）絮凝技术(flocculation)

絮凝的原理：絮凝剂在吸附、架桥作用下，沉降稳定性消失，合并为较粗大的絮团。（10mm）。使发酵液过滤特性改善。絮凝技术(flocculation)影响因素1）絮凝剂的结构和性质4）搅拌时间和强度2）絮凝剂的用量5）温度3）pH絮凝技术(flocculation)1）絮凝剂的结构和性质支链结构环状结构分子量大、长链、线性结构且溶解度大利于絮凝小分子链状结构絮凝技术(flocculation)对絮凝剂化学结构的要求：（1）分子必须含有相当多的活性官能团，使之能和胶粒表面相结合；（2）另一方面要求必须具有长链的线性结构，以便同时与多个胶粒吸附形成较大的絮团，但相对分子质量不能超过一定的限度，以使其具有良好的溶解性。2）絮凝剂的用量过量絮凝剂絮凝剂过量吸附无空余表面的稳定微粒不可过量絮凝技术(flocculation)若絮凝剂用量过大，每个微粒表面均被絮凝剂分子所饱和，不再有吸附空位，絮凝剂不可能再实现架桥作用，反而，因为空间位阻效应使分散体系稳定。2）絮凝剂的用量絮凝剂的用量存在一个适当的浓度范围；一般通过实验确定。淀粉酶发酵液中絮凝剂浓度太小，无法完成吸附、架桥絮凝技术(flocculation)3）pH：pH影响功能团的电离度絮凝剂分子不带电荷——卷曲状态H3+絮凝剂分子带电荷——伸展状态++影响功能团电离度，分子链的伸展度，影响架桥能力絮凝技术(flocculation)根据絮凝剂性质，调至适合活性基团电离的pH，利于絮凝。3）pH：例：发酵液的絮凝过程中，pH=8.4时，滤速最大絮凝技术(flocculation)此时，有利于絮凝效果的pH为8.4，一般通过实验确定。4）搅拌强度和时间：初期高速，使其均匀分布；接着应延长搅拌时间，降低搅拌速度，利于其成团。同一个颗粒絮凝剂吸附、缠绕再次稳定的碎散絮团碎散絮团絮凝技术(flocculation)搅拌有利于悬浮颗粒与絮凝剂的吸附4）搅拌强度和时间：不规则絮团絮团破裂剧烈、长期搅拌碎散絮团絮凝技术(flocculation)高速搅拌易将絮凝团打碎，影响絮凝效果，所以应采用变速搅拌。即絮凝初期短时间内应高速搅拌，絮凝后期应降低搅拌速度。5）温度：一般为20～30℃

菌体细胞蛋白质混合温度升高，絮凝V加快；但高温影响目标物活性。絮凝技术(flocculation)絮凝剂对胶体分散系的絮凝过程，实质上是“絮凝剂-溶剂-胶体”这三种关系综合作用的结果。为了提高絮凝效果，就必须根据发酵液中细微悬浮物的性质和浓度，正确地控制絮凝过程的工艺条件。包括：絮凝剂种类、用量、pH、搅拌时间和强度、温度等。絮凝技术(flocculation)例如：甘油发酵液预处理时，首先选择合适的絮凝剂，通过实验，确定适宜的絮凝条件为：pH=5-10，温度30-40℃，絮凝剂用量0.6-0.8g/L。此时，菌体去除率达100%，滤速提高2.5-4.5倍。絮凝技术(flocculation)例如：对于透明质酸发酵液，实验发现阴离子型聚丙烯酰胺效果优于壳聚糖。并确定最佳絮凝条件为：絮凝剂