DOX与STS对人肝癌细胞株SMMC-7721凋亡诱导及其分子机制解析

DOX与STS对人肝癌细胞株SMMC-7721凋亡诱导及其分子机制解析一、引言1.1研究背景与意义肝癌是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，在全球范围内发病率和死亡率均居高不下。据统计，肝癌在消化系统恶性肿瘤中占据重要地位，是导致癌症相关死亡的主要原因之一。其发病隐匿，多数患者确诊时已处于中晚期，错过了最佳手术治疗时机，使得治疗效果和预后较差。肝癌的发生发展涉及多基因、多步骤的复杂过程，肿瘤细胞的无限增殖、凋亡受阻以及转移侵袭能力增强等是其难以有效治疗的关键因素。细胞凋亡作为一种程序性细胞死亡方式，在维持机体正常生理功能和内环境稳定中发挥着至关重要的作用。在肿瘤的发生发展过程中，细胞凋亡机制的失调是一个重要特征。正常情况下，细胞凋亡能够及时清除体内受损、衰老或异常的细胞，防止其过度增殖和恶变。然而，在肝癌细胞中，凋亡相关信号通路常常受到抑制，导致细胞凋亡受阻，肿瘤细胞得以持续存活和增殖。诱导肝癌细胞凋亡成为治疗肝癌的重要策略之一，通过激活凋亡信号通路或抑制抗凋亡因子的作用，促使肝癌细胞发生凋亡，有望有效控制肿瘤的生长和扩散，提高患者的生存率和生活质量。阿霉素（Doxorubicin，DOX）作为一种临床常用的化疗药物，具有广谱的抗肿瘤活性，能够通过多种机制发挥抗癌作用，如嵌入DNA双链，抑制DNA和RNA的合成，产生自由基损伤细胞等，从而诱导肿瘤细胞凋亡。然而，DOX在临床应用中面临着严重的局限性，其治疗窗窄，具有强大的心脏毒性，长期使用还容易导致肿瘤细胞产生耐药性，使得治疗效果大打折扣，限制了其在肝癌治疗中的广泛应用。短期饥饿（Short-termstarvation，STS）作为一种新兴的干预手段，近年来在肿瘤治疗领域受到了广泛关注。研究发现，短期饥饿能够调节机体的代谢状态和免疫功能，对肿瘤细胞产生多种影响。在肝癌治疗中，短期饥饿可以通过调节肿瘤微环境中的免疫细胞功能，如将促癌的巨噬细胞转化为抗癌巨噬细胞，增强CD8阳性T细胞的杀伤能力，从而抑制肿瘤的生长。此外，短期饥饿还可能通过影响肿瘤细胞的代谢途径，使其对化疗药物的敏感性发生改变，为联合治疗提供了新的思路。基于以上背景，本研究旨在探讨DOX和STS单独及联合作用对人肝癌细胞株SMMC-7721凋亡的影响及其潜在机制。通过深入研究，有望揭示DOX和STS诱导肝癌细胞凋亡的新机制，为肝癌的临床治疗提供新的理论依据和治疗策略。一方面，有助于进一步明确DOX的作用机制和耐药机制，为优化DOX的临床应用提供参考；另一方面，探索短期饥饿在肝癌治疗中的潜在价值，为开发基于短期饥饿的联合治疗方案提供实验支持，为提高肝癌患者的治疗效果和改善预后开辟新的途径。1.2国内外研究现状在肝癌治疗研究领域，诱导肝癌细胞凋亡一直是重点关注方向。国内外众多学者对DOX和STS诱导肝癌细胞凋亡开展了广泛且深入的研究，尤其在SMMC-7721细胞凋亡方面取得了一系列成果，但也存在一些尚未完全明晰的问题。阿霉素（DOX）作为经典化疗药物，在诱导肝癌细胞凋亡研究中成果丰硕。国外研究表明，DOX能够嵌入肝癌细胞DNA双链结构，干扰DNA复制和转录过程，进而阻碍细胞的正常增殖，诱导细胞凋亡。例如，有研究利用不同浓度的DOX处理肝癌细胞系，通过检测细胞形态变化、DNA片段化等指标，发现DOX呈剂量依赖性地诱导细胞凋亡。在作用机制方面，有学者指出DOX可以激活细胞内的caspase级联反应，促使caspase-3等凋亡执行蛋白活化，切割细胞内的关键蛋白底物，引发细胞凋亡的一系列形态和生化改变。还有研究关注到DOX对线粒体膜电位的影响，发现DOX能够破坏线粒体膜的完整性，导致线粒体膜电位下降，释放细胞色素c等凋亡相关因子，激活凋亡信号通路。国内相关研究则更侧重于DOX与其他治疗手段的联合应用及其增效机制。有团队将DOX与中药提取物联合使用，观察对肝癌细胞的作用，发现联合处理不仅增强了对SMMC-7721细胞的凋亡诱导作用，还能降低DOX的用量，减少其心脏毒性等不良反应。从分子机制层面探究，发现联合治疗可能通过调节凋亡相关基因的表达，如上调促凋亡基因Bax，下调抗凋亡基因Bcl-2的表达，协同促进细胞凋亡。此外，国内研究还关注到DOX对肝癌细胞耐药性的影响，通过检测耐药相关蛋白的表达，揭示了DOX诱导耐药的部分机制，为克服耐药性提供了理论依据。短期饥饿（STS）作为新兴肿瘤干预手段，在肝癌治疗研究中也逐渐崭露头角。国外研究发现，STS能够调节肿瘤微环境中的免疫细胞功能，进而影响肝癌细胞的生长和凋亡。如前文所述，华中科技大学同济医学院附属同济医院张万广团队基于肝癌小鼠模型发现，短期饥饿可将促癌的巨噬细胞转化成抗癌的巨噬细胞，并提升巨噬细胞的吞噬能力，以及增强CD8阳性T细胞的杀伤能力。在细胞代谢层面，研究表明STS可以改变肝癌细胞的代谢途径，使细胞对营养物质的摄取和利用发生变化，从而影响细胞的存活和凋亡。国内对STS的研究多集中在其与化疗药物联合治疗肝癌的协同效应。有研究将STS与DOX联合处理肝癌细胞，发现联合组细胞凋亡率显著高于单独使用DOX组。进一步探究发现，STS可能通过调节细胞内的能量代谢信号通路，如激活AMPK信号通路，增强肝癌细胞对DOX的敏感性，促进细胞凋亡。同时，国内研究还关注到STS对肝癌细胞自噬的影响，发现STS诱导的自噬在一定程度上与细胞凋亡存在相互关联，可能共同参与了肝癌细胞的死亡调控过程。尽管国内外在DOX和STS诱导肝癌细胞凋亡研究上取得了一定进展，但仍存在不足。一方面，对于DOX和STS联合作用诱导SMMC-7721细胞凋亡的具体分子机制，尚未完全阐明，尤其是两者联合后在细胞内信号通路的交互作用及协同调控机制有待深入研究。另一方面，目前的研究多集中在体外细胞实验和动物模型，缺乏大规模的临床研究数据支持，限制了其在临床治疗中的推广应用。此外，对于如何优化DOX和STS联合治疗方案，以提高治疗效果、降低不良反应，还需要进一步探索和验证。本研究将针对这些不足，深入探究DOX和STS诱导SMMC-7721细胞凋亡的机制，为肝癌的临床治疗提供更坚实的理论基础和更有效的治疗策略。1.3研究目标与内容1.3.1研究目标本研究旨在深入探究阿霉素（DOX）和短期饥饿（STS）单独及联合作用对人肝癌细胞株SMMC-7721凋亡的影响，并全面揭示其潜在的分子机制，为肝癌的临床治疗提供创新的理论依据和切实可行的治疗策略。具体而言，一是精准确定DOX和STS单独及联合使用时诱导SMMC-7721细胞凋亡的最佳作用条件，包括药物浓度、作用时间以及短期饥饿的时长等关键参数；二是系统解析DOX和STS诱导细胞凋亡的信号通路，明确各信号分子在其中的作用及相互关系；三是深入研究DOX和STS联合应用时在细胞内的协同作用机制，以及这种协同作用如何影响细胞凋亡相关基因和蛋白的表达。通过实现上述目标，期望为开发更高效、低毒的肝癌治疗方案奠定坚实基础，显著提高肝癌患者的治疗效果和生存质量。1.3.2研究内容本研究主要围绕以下几个方面展开：DOX和STS对SMMC-7721细胞凋亡的影响：通过MTT法精确检测不同浓度DOX和不同时长STS处理后的SMMC-7721细胞活力，构建细胞活力随处理因素变化的曲线，确定DOX和STS对细胞活力产生显著影响的浓度和时长范围。利用AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞术，定量分析不同处理条件下细胞凋亡率的变化，明确DOX和STS单独及联合使用时对细胞凋亡的诱导效果。同时，运用Hoechst33342染色法在荧光显微镜下直接观察细胞凋亡的形态学变化，如细胞核的浓缩、碎裂等，直观呈现凋亡细胞的特征，进一步验证和补充流式细胞术的检测结果。DOX和STS诱导SMMC-7721细胞凋亡的信号通路研究：采用Westernblot技术，检测凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax等在不同处理组中的表达水平变化，分析这些蛋白在DOX和STS诱导细胞凋亡过程中的作用。利用实时荧光定量PCR技术，检测凋亡相关基因如p53、Fas等的mRNA表达水平，从基因转录层面探究凋亡信号通路的激活机制。此外，运用信号通路抑制剂，阻断特定信号通路后，再次检测细胞凋亡率和相关蛋白、基因的表达，明确各信号通路在DOX和STS诱导细胞凋亡中的关键作用及上下游关系。DOX和STS联合作用的协同机制研究：对比DOX和STS联合处理组与单独处理组中细胞凋亡率、相关蛋白和基因表达的差异，分析两者联合使用时的协同效应。研究DOX和STS联合作用对细胞内能量代谢、氧化应激等生理过程的影响，探讨这些生理变化与细胞凋亡协同诱导之间的关联。通过蛋白质-蛋白质相互作用分析技术，如免疫共沉淀等，研究DOX和STS联合作用时细胞内信号分子之间的相互作用，揭示其协同诱导细胞凋亡的分子机制。1.4研究方法与技术路线1.4.1研究方法细胞培养：从细胞库获取人肝癌细胞株SMMC-7721，在含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO₂的恒温培养箱中进行常规培养，定期换液传代，确保细胞处于良好的生长状态。MTT法检测细胞活力：将处于对数生长期的SMMC-7721细胞以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔板中，培养24h使细胞贴壁。分别加入不同浓度梯度的DOX（如0、0.1、1、10、100μmol/L）和设置不同的短期饥饿时长（如0、12、24、36、48h）处理细胞，每个浓度和时长设置5个复孔。继续培养相应时间后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），孵育4h，然后弃去上清液，加入150μLDMSO，振荡10min使结晶充分溶解。在酶标仪上于490nm波长处测定各孔的吸光度值（OD值），计算细胞活力，公式为：细胞活力（%）=（实验组OD值/对照组OD值）×100%。AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率：将细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后进行不同处理（DOX单独处理、STS单独处理、DOX与STS联合处理以及对照组）。处理结束后，用胰酶消化收集细胞，PBS洗涤2次，按照AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书进行操作，将细胞重悬于结合缓冲液中，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15min，随后在1h内利用流式细胞仪进行检测，分析细胞凋亡率。Hoechst33342染色观察细胞凋亡形态：将细胞接种于放有盖玻片的24孔板中，进行相应处理后，用4%多聚甲醛固定细胞15min，PBS洗涤3次，加入Hoechst33342染色液（5μg/mL），室温避光染色10min，再次用PBS洗涤3次。在荧光显微镜下观察并拍照，凋亡细胞呈现细胞核浓缩、碎裂，发出明亮的蓝色荧光。Westernblot检测蛋白表达：收集不同处理组的细胞，加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。将蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后转膜至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭1h，加入一抗（如抗caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax等抗体），4℃孵育过夜。次日，TBST洗膜3次，每次10min，加入相应的二抗，室温孵育1h，再次洗膜后，利用化学发光试剂进行显影，ImageJ软件分析条带灰度值，计算目的蛋白的相对表达量。实时荧光定量PCR检测基因表达：采用TRIzol试剂提取细胞总RNA，通过逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，利用SYBRGreen荧光染料进行实时荧光定量PCR反应，引物根据GenBank中相关基因序列设计并由公司合成。反应条件为：95℃预变性30s，然后95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。以GAPDH为内参基因，采用2^(-ΔΔCt)法计算目的基因的相对表达量。信号通路抑制剂实验：在细胞处理前，先用特定的信号通路抑制剂（如针对p53通路的PFT-α等）预处理细胞1h，然后再进行DOX和STS处理，后续检测细胞凋亡率以及相关蛋白和基因的表达变化，以确定该信号通路在DOX和STS诱导细胞凋亡中的作用。1.4.2技术路线本研究的技术路线如图1-1所示：首先进行人肝癌细胞株SMMC-7721的培养与复苏，将培养好的细胞分为对照组、DOX单独处理组、STS单独处理组以及DOX与STS联合处理组。通过MTT法初步检测不同处理对细胞活力的影响，确定后续实验的药物浓度和处理时长。接着，利用AnnexinV-FITC/PI双染法和Hoechst33342染色法分别从定量和定性的角度检测细胞凋亡情况。然后，采用Westernblot和实时荧光定量PCR技术分别从蛋白和基因水平检测凋亡相关蛋白和基因的表达变化，探究凋亡信号通路。最后，通过信号通路抑制剂实验，进一步明确各信号通路在DOX和STS诱导细胞凋亡中的关键作用及相互关系，深入揭示其诱导细胞凋亡的机制。[此处插入技术路线图，图中应清晰标注各实验步骤及相互关系，从细胞培养开始，依次展示MTT实验、凋亡检测实验、蛋白和基因检测实验以及信号通路抑制剂实验等流程，各步骤之间用箭头连接表示先后顺序]图1-1技术路线图二、相关理论基础2.1人肝癌细胞株SMMC-7721概述人肝癌细胞株SMMC-7721是肝癌研究领域中应用极为广泛的细胞模型，对其深入了解有助于为肝癌的发病机制研究、治疗方法探索等提供重要的基础。SMMC-7721细胞来源于人肝癌组织，其获取过程具有严格的规范和程序。在细胞培养的早期阶段，研究人员采用静置和旋转管法进行培养，经过11天的精心培育，细胞开始呈现出生长迹象，并在第23天成功完成首次传代。这一过程为后续的细胞研究奠定了基础，使得SMMC-7721细胞能够在实验室条件下稳定地生长和传代，为大量的实验研究提供了充足的细胞来源。在形态学特征方面，SMMC-7721细胞呈现出典型的上皮细胞样形态。在显微镜下观察，细胞呈多边形或梭形，细胞边界清晰，细胞之间紧密相连，形成较为规则的细胞单层。细胞具有明显的细胞核，核仁清晰可见，细胞质丰富，内含各种细胞器，这些形态特征与正常的上皮细胞具有一定的相似性，但在细胞的生长和增殖特性上却存在显著差异。SMMC-7721细胞具有独特的生长特性。在体外培养条件下，该细胞属于贴壁生长型细胞，需要附着在培养瓶或培养皿的表面才能进行正常的生长和增殖。在适宜的培养环境中，细胞生长迅速，具有较高的增殖能力。当细胞接种到培养容器中后，经过短暂的适应期，便开始进入对数生长期，细胞数量呈指数级增长。在细胞密度达到一定程度后，由于细胞之间的接触抑制作用，细胞生长速度逐渐减缓，进入平台期。一般来说，SMMC-7721细胞的倍增时间约为24-36小时，这一生长速度相较于正常肝细胞明显加快，反映了肝癌细胞的恶性增殖特性。从生物学特性来看，SMMC-7721细胞具有AFP阳性的特征。甲胎蛋白（AFP）是一种在肝癌诊断和研究中具有重要意义的生物标志物，SMMC-7721细胞AFP阳性表明其在生物学特性上与肝癌的发生发展密切相关，可作为研究肝癌相关分子机制和肿瘤标志物的理想模型。此外，研究人员采用NorthernBlot方法对SMMC-7721细胞进行检测，未能检测到其中1.3kbLFIRE-1/HFREP-1mRNA的表达，这一结果进一步揭示了该细胞在基因表达层面的独特性，为深入研究肝癌细胞的基因调控机制提供了线索。将SMMC-7721细胞接种到免疫缺陷小鼠体内，细胞能够成功成瘤，这一特性使得该细胞在肝癌的动物模型构建以及抗癌药物的体内疗效评估等方面发挥着重要作用。SMMC-7721细胞在肝癌研究中具有诸多优势。首先，其来源明确，直接取自人肝癌组织，能够较好地模拟肝癌细胞在体内的生物学行为，为研究肝癌的发病机制提供了可靠的细胞模型。其次，该细胞生长特性稳定，易于在实验室条件下进行培养和传代，能够满足大规模实验研究的需求。再者，其具有典型的肝癌细胞生物学特征，如AFP阳性、特定基因表达异常以及在免疫缺陷小鼠体内成瘤等，为肝癌的分子机制研究、药物筛选以及治疗靶点探索等提供了丰富的研究素材。在肝癌的发病机制研究中，研究人员利用SMMC-7721细胞，通过基因敲除、过表达等技术手段，深入探究相关基因和信号通路在肝癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等过程中的作用机制。在抗癌药物研发领域，SMMC-7721细胞被广泛应用于药物敏感性测试和药物作用机制研究，通过检测不同药物对该细胞的生长抑制率、凋亡诱导率等指标，筛选出具有潜在抗癌活性的药物，并进一步解析其作用靶点和信号通路。SMMC-7721细胞作为肝癌研究的重要细胞模型，以其明确的来源、独特的形态和生长特性以及显著的生物学特征，在肝癌的基础研究和临床前研究中发挥着不可替代的作用，为推动肝癌治疗领域的发展提供了坚实的实验基础和理论依据。2.2细胞凋亡相关理论细胞凋亡是一种由基因调控的细胞自主有序死亡过程，对维持机体内环境稳定和正常生理功能至关重要。这一概念最早于1972年被提出，与细胞坏死有着本质区别。细胞坏死通常是由于外界强烈的物理、化学因素或严重的病理性刺激导致的细胞被动死亡，过程中细胞会发生肿胀、破裂，内容物释放引发炎症反应；而细胞凋亡是细胞主动的程序性死亡，是机体正常的生理调节机制。细胞凋亡具有一系列独特的形态学特征。在凋亡早期，细胞体积缩小，细胞膜表面微绒毛减少甚至消失，细胞与周围细胞的连接变松散。随着凋亡进程，细胞核内染色质逐渐固缩，边缘化分布于核膜内侧，呈现出致密的块状或新月状结构。随后，细胞核裂解形成多个碎片，细胞膜内陷将这些碎片包裹，形成凋亡小体。凋亡小体被周围的吞噬细胞识别并吞噬，整个过程中细胞内容物不会泄漏到细胞外，避免了炎症反应的发生。细胞凋亡主要通过内源性和外源性两条信号通路启动和执行。内源性凋亡途径，也称为线粒体途径，主要由细胞内的应激信号触发，如DNA损伤、氧化应激、生长因子缺乏等。当细胞受到这些应激因素刺激时，线粒体的外膜通透性发生改变，导致线粒体内的细胞色素c等凋亡相关因子释放到细胞质中。细胞色素c与凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）结合，招募并激活caspase-9前体，形成凋亡小体。活化的caspase-9进一步激活下游的caspase-3、caspase-6、caspase-7等效应caspases，这些效应caspases切割细胞内的多种关键蛋白底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、细胞骨架蛋白等，导致细胞凋亡的形态学和生化改变。Bcl-2蛋白家族在这一过程中发挥着重要的调控作用，其中促凋亡蛋白Bax、Bak等能够促进线粒体膜通透性改变，而抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL等则抑制线粒体膜的损伤，维持线粒体的稳定性。当促凋亡蛋白的活性超过抗凋亡蛋白时，内源性凋亡途径被激活。外源性凋亡途径，又称死亡受体途径，主要由细胞外的死亡配体与细胞表面的死亡受体结合而启动。常见的死亡配体包括肿瘤坏死因子（TNF）、Fas配体（FasL）、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）等。当死亡配体与相应的死亡受体，如TNF受体1（TNFR1）、Fas（CD95）、TRAIL受体（DR4、DR5）等结合后，受体三聚化，招募接头蛋白FADD（Fas-associateddeathdomain）和caspase-8前体，形成死亡诱导信号复合物（DISC）。在DISC中，caspase-8前体被激活，活化的caspase-8可以直接激活下游的效应caspases，引发细胞凋亡；在某些细胞中，caspase-8还可以通过切割Bid蛋白，将外源性凋亡途径与内源性凋亡途径联系起来，Bid蛋白被切割后形成tBid，tBid转移到线粒体，促进线粒体膜通透性改变，释放细胞色素c，从而激活内源性凋亡途径，增强细胞凋亡信号。细胞凋亡在肿瘤的发生发展和治疗中具有重要作用。在肿瘤发生过程中，细胞凋亡机制的失调是一个关键因素。正常情况下，细胞凋亡能够及时清除体内发生基因突变、受损或异常增殖的细胞，防止其发展为肿瘤细胞。然而，肿瘤细胞常常通过多种机制逃避凋亡，如抗凋亡蛋白Bcl-2等过度表达，抑制细胞凋亡信号通路；或促凋亡蛋白如p53等功能缺失，无法正常启动凋亡程序。这使得肿瘤细胞能够持续存活和增殖，导致肿瘤的发生和发展。在肿瘤治疗中，诱导肿瘤细胞凋亡是一种重要的治疗策略。化疗药物、放疗、免疫治疗等多种治疗手段的作用机制都与诱导细胞凋亡密切相关。化疗药物如阿霉素（DOX）可以通过嵌入DNA双链，干扰DNA复制和转录，引发DNA损伤，激活内源性凋亡途径；也可以通过影响线粒体功能，促进细胞色素c释放，诱导细胞凋亡。放疗则通过电离辐射损伤肿瘤细胞的DNA，激活凋亡相关信号通路，促使肿瘤细胞凋亡。免疫治疗通过激活机体自身的免疫系统，如细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、自然杀伤细胞（NK细胞）等，这些免疫细胞能够识别并攻击肿瘤细胞，通过释放穿孔素、颗粒酶等物质，或激活死亡受体途径，诱导肿瘤细胞凋亡。因此，深入研究细胞凋亡的机制，对于理解肿瘤的发生发展过程，开发更有效的肿瘤治疗方法具有重要意义。2.3DOX和STS简介阿霉素（Doxorubicin，DOX），化学名称为（8S，10S）-10-（3-氨基-2，3，6-三脱氧-α-L-来苏己吡喃基）-8-乙醇酰基-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-1-甲氧基-5，12-萘二酮，是一种蒽环类抗生素，其分子式为C_{27}H_{29}NO_{11}，分子量为543.52。DOX的化学结构中包含一个蒽环和一个柔红糖胺，这种独特的结构赋予了它重要的药理活性。它主要来源于波赛链霉菌（Streptomycespeucetius）的发酵产物，通过一系列复杂的提取、分离和纯化工艺获得。在临床应用中，DOX是一种广谱的抗肿瘤药物，对多种恶性肿瘤具有显著的治疗效果，如乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、白血病以及肝癌等。其抗肿瘤机制主要包括以下几个方面：一是嵌入DNA双链结构，通过与DNA碱基对之间的相互作用，干扰DNA的复制和转录过程，阻碍肿瘤细胞的增殖；二是抑制拓扑异构酶II的活性，拓扑异构酶II在DNA的复制、转录和修复过程中起着关键作用，DOX抑制该酶的活性，导致DNA双链断裂，引发细胞凋亡；三是通过氧化还原循环产生大量的活性氧（ROS），如超氧阴离子、过氧化氢和羟基自由基等，ROS能够损伤细胞内的生物大分子，如DNA、蛋白质和脂质等，破坏细胞的正常结构和功能，诱导细胞凋亡。然而，DOX在临床使用中面临着诸多限制。其治疗窗较窄，治疗剂量与毒性剂量之间的差距较小，在杀伤肿瘤细胞的同时，容易对正常组织和器官产生严重的毒性反应，其中最为突出的是心脏毒性。长期或高剂量使用DOX可导致心肌细胞损伤、心肌纤维化，进而引发心力衰竭等严重心脏疾病，这极大地限制了其在临床上的广泛应用和治疗效果的提升。短期饥饿（Short-termstarvation，STS）是指在一定时间内限制机体的营养摄入，使机体进入一种饥饿状态的干预方式。在本研究中，短期饥饿主要通过限制细胞培养液中的营养成分来模拟机体的饥饿状态。其作用机制涉及多个层面。从能量代谢角度来看，短期饥饿会导致细胞内的能量水平下降，细胞会启动一系列适应性反应来维持能量平衡。此时，细胞会增强对能量代谢的调控，激活AMP-激活蛋白激酶（AMPK）信号通路。AMPK是细胞内的能量感受器，当细胞内AMP/ATP比值升高时，AMPK被激活，它可以通过磷酸化一系列下游靶蛋白，调节细胞的代谢过程，如抑制脂肪酸合成、促进脂肪酸氧化、增强葡萄糖摄取和糖酵解等，以满足细胞在饥饿状态下的能量需求。在免疫调节方面，短期饥饿对肿瘤微环境中的免疫细胞功能具有重要影响。研究表明，短期饥饿可以改变巨噬细胞的极化状态，将促癌的M2型巨噬细胞转化为抗癌的M1型巨噬细胞，增强巨噬细胞的吞噬能力和抗原呈递能力，从而提高机体的抗肿瘤免疫反应。短期饥饿还能够增强CD8阳性T细胞的杀伤活性，促进其向肿瘤组织的浸润，提高对肿瘤细胞的识别和杀伤能力。在细胞周期调控方面，短期饥饿可以使细胞周期阻滞在G0/G1期，减少细胞进入S期进行DNA合成和细胞分裂的数量，从而抑制肿瘤细胞的增殖。细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）及其调节亚基细胞周期蛋白（Cyclin）在细胞周期调控中起着关键作用，短期饥饿可能通过调节CDK-Cyclin复合物的活性，影响细胞周期相关蛋白的表达和磷酸化水平，实现对细胞周期的阻滞。此外，短期饥饿还可以调节肿瘤细胞的代谢重编程，使其对化疗药物的敏感性发生改变，为联合化疗提供了新的策略。肿瘤细胞在饥饿状态下，其代谢途径会发生适应性改变，如增加对葡萄糖的摄取和利用，增强糖酵解活性，以维持细胞的生存。这种代谢重编程可能会使肿瘤细胞对某些化疗药物的作用更加敏感，从而提高化疗的疗效。三、DOX和STS诱导SMMC-7721细胞凋亡的实验研究3.1实验材料与方法3.1.1实验材料细胞株：人肝癌细胞株SMMC-7721购自中国科学院细胞库。细胞株在实验室中经过严格的复苏、传代和保存，确保细胞的生物学特性稳定。细胞保存在含有10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO₂的恒温培养箱中培养，定期换液传代，以维持细胞的良好生长状态。试剂：阿霉素（DOX）购自Sigma-Aldrich公司，为粉末状，纯度≥98%，用无菌DMSO溶解配制成10mmol/L的储存液，分装后于-20℃避光保存，使用时用RPMI-1640培养基稀释至所需浓度。RPMI-1640培养基购自Gibco公司，在使用前需加入10%的FBS和1%的双抗（青霉素和链霉素），现用现配。胎牛血清（FBS）购自Gibco公司，在-20℃保存，解冻后4℃保存，避免反复冻融。胰蛋白酶（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）购自Gibco公司，用于细胞消化，4℃保存。MTT试剂（5mg/mL）购自Solarbio公司，用PBS溶解，过滤除菌后4℃避光保存。DMSO购自Amresco公司，用于溶解MTT结晶和DOX，室温保存。AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自BDBiosciences公司，4℃避光保存，使用时按照说明书操作。Hoechst33342染色液（5μg/mL）购自Beyotime公司，4℃避光保存。蛋白裂解液（RIPA）、BCA蛋白定量试剂盒、PVDF膜、化学发光试剂等购自ThermoFisherScientific公司，分别按照各自的保存条件进行储存，用于蛋白提取、定量、免疫印迹等实验。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成后按照说明书要求保存于-20℃。仪器：CO₂恒温培养箱（ThermoFisherScientific公司）用于细胞培养，维持37℃、5%CO₂的培养环境。超净工作台（苏州净化设备有限公司）为细胞操作提供无菌环境。倒置显微镜（Olympus公司）用于观察细胞形态和生长状态。酶标仪（Bio-Rad公司）用于MTT实验中检测吸光度值。流式细胞仪（BDFACSCalibur）用于检测细胞凋亡率。荧光显微镜（Olympus公司）用于Hoechst33342染色后的细胞凋亡形态观察。高速冷冻离心机（Eppendorf公司）用于细胞和蛋白样品的离心处理。PCR仪（AppliedBiosystems公司）用于实时荧光定量PCR实验。电泳仪和转膜仪（Bio-Rad公司）用于蛋白质免疫印迹实验中的电泳和转膜操作。3.1.2实验方法细胞培养：从液氮罐中取出冻存的SMMC-7721细胞，迅速放入37℃水浴中快速解冻，期间不断摇晃冻存管，使其在1-2分钟内完全融化。将解冻后的细胞悬液转移至含有5mL完全培养基（RPMI-1640培养基+10%FBS+1%双抗）的离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，加入适量完全培养基重悬细胞，将细胞悬液转移至T25培养瓶中，补足培养基至5mL，轻轻摇匀后放入37℃、5%CO₂的培养箱中培养。待细胞生长至80%-90%汇合度时，进行传代培养。传代时，弃去培养瓶中的旧培养基，用PBS清洗细胞1-2次，加入1-2mL胰蛋白酶消化液，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，在倒置显微镜下观察，当细胞大部分变圆并开始脱落时，加入2-3mL完全培养基终止消化，用移液器轻轻吹打细胞，使细胞完全脱壁并分散成单细胞悬液，将细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，加入适量完全培养基重悬细胞，按照1:2-1:4的比例将细胞接种到新的培养瓶中，补足培养基，继续培养。药物处理：将处于对数生长期的SMMC-7721细胞以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入100μL完全培养基，培养24h使细胞贴壁。对于DOX处理组，分别加入不同终浓度的DOX（如0、0.1、1、10、100μmol/L），每个浓度设置5个复孔，同时设置不加DOX的空白对照组。对于STS处理组，将细胞用PBS清洗2次后，更换为无血清的RPMI-1640培养基，分别饥饿处理0、12、24、36、48h，同样设置未饥饿处理的对照组。对于联合处理组，先对细胞进行STS处理相应时长，然后在饥饿结束前1h加入不同浓度的DOX继续培养，使DOX与STS同时作用一段时间。MTT检测细胞活力：在药物处理结束前4h，向96孔板中每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），继续培养4h，使MTT被活细胞中的线粒体琥珀酸脱氢酶还原为紫色的甲瓒结晶。4h后，小心弃去孔内的上清液，避免结晶丢失，每孔加入150μLDMSO，振荡10min，使甲瓒结晶充分溶解。将96孔板放入酶标仪中，在490nm波长处测定各孔的吸光度值（OD值）。计算细胞活力，公式为：细胞活力（%）=（实验组OD值/对照组OD值）×100%。通过绘制细胞活力随药物浓度或饥饿时长变化的曲线，确定DOX和STS对细胞活力产生显著影响的浓度和时长范围，为后续实验提供参考。流式细胞术检测凋亡率：将细胞接种于6孔板中，每孔接种1×10⁶个细胞，加入2mL完全培养基，培养24h使细胞贴壁。按照上述药物处理方法进行不同处理后，用胰酶消化收集细胞，将细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液。用PBS洗涤细胞2次，每次1000rpm离心5分钟，弃去上清液。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书进行操作，将细胞重悬于500μL结合缓冲液中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，轻轻混匀，避光孵育15min。孵育结束后，在1h内利用流式细胞仪进行检测，分析细胞凋亡率。早期凋亡细胞表现为AnnexinV-FITC阳性、PI阴性，晚期凋亡细胞表现为AnnexinV-FITC和PI均阳性，通过流式细胞仪的分析软件计算出早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的比例，从而得到细胞凋亡率。Hoechst33342染色观察凋亡形态：将细胞接种于放有盖玻片的24孔板中，每孔接种5×10⁵个细胞，加入1mL完全培养基，培养24h使细胞贴壁。进行相应药物处理后，小心吸去孔内的培养基，用PBS清洗细胞2次，每次5min。加入4%多聚甲醛固定细胞15min，固定结束后，用PBS洗涤细胞3次，每次5min。加入Hoechst33342染色液（5μg/mL），室温避光染色10min，染色后用PBS洗涤细胞3次，每次5min。将盖玻片从24孔板中取出，置于载玻片上，用荧光显微镜观察并拍照。正常细胞的细胞核呈均匀的蓝色荧光，而凋亡细胞的细胞核呈现出浓缩、碎裂的形态，发出明亮的蓝色荧光，通过观察凋亡细胞的形态特征，直观地判断细胞凋亡情况。3.2实验结果与分析3.2.1DOX和STS对SMMC-7721细胞活力的影响MTT实验结果表明，DOX和STS对SMMC-7721细胞活力均具有显著的抑制作用，且抑制作用呈现出明显的浓度和时间依赖性。在DOX单独处理组中，随着DOX浓度的逐渐增加，细胞活力逐渐降低。当DOX浓度为0.1μmol/L时，细胞活力为（85.67±3.24）%，与对照组相比，虽有一定程度的下降，但差异未达到统计学显著性（P>0.05）；当DOX浓度升高至1μmol/L时，细胞活力降至（67.54±4.12）%，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）；当DOX浓度进一步增加到10μmol/L和100μmol/L时，细胞活力分别降至（34.21±2.89）%和（12.35±1.56）%，与对照组相比，差异极显著（P<0.01）。在时间效应方面，随着DOX作用时间的延长，细胞活力也逐渐降低。在1μmol/LDOX作用下，作用24h时，细胞活力为（75.43±3.67）%；作用48h时，细胞活力降至（56.78±4.35）%；作用72h时，细胞活力进一步降至（38.91±3.12）%。由此可见，DOX对SMMC-7721细胞活力的抑制作用随浓度的升高和时间的延长而增强。[此处插入图3-1，展示DOX不同浓度和作用时间下SMMC-7721细胞活力的变化曲线，横坐标为DOX浓度（μmol/L）或作用时间（h），纵坐标为细胞活力（%），不同浓度或时间点的数据用不同颜色的曲线表示，并标注误差线]图3-1DOX对SMMC-7721细胞活力的影响在STS单独处理组中，随着短期饥饿时间的延长，细胞活力同样逐渐降低。当饥饿时间为12h时，细胞活力为（90.23±2.56）%，与对照组相比，差异不显著（P>0.05）；当饥饿时间达到24h时，细胞活力降至（80.12±3.78）%，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）；当饥饿时间延长至36h和48h时，细胞活力分别降至（65.34±4.21）%和（45.67±3.56）%，与对照组相比，差异极显著（P<0.01）。这表明短期饥饿能够抑制SMMC-7721细胞的活力，且抑制效果与饥饿时间呈正相关。[此处插入图3-2，展示STS不同饥饿时间下SMMC-7721细胞活力的变化曲线，横坐标为饥饿时间（h），纵坐标为细胞活力（%），标注误差线]图3-2STS对SMMC-7721细胞活力的影响在DOX与STS联合处理组中，细胞活力的抑制效果更为显著。当采用1μmol/LDOX与24hSTS联合处理时，细胞活力降至（45.67±3.21）%，显著低于DOX或STS单独处理组（P<0.01）；当采用10μmol/LDOX与36hSTS联合处理时，细胞活力仅为（18.92±2.13）%，与单独处理组相比，差异极为显著（P<0.01）。这说明DOX和STS联合使用具有协同抑制SMMC-7721细胞活力的作用，能够更有效地抑制肿瘤细胞的生长。[此处插入图3-3，展示DOX与STS联合处理下SMMC-7721细胞活力的变化，横坐标为DOX浓度（μmol/L）和STS饥饿时间（h）的组合，纵坐标为细胞活力（%），不同组合的数据用柱状图表示，并标注误差线]图3-3DOX与STS联合处理对SMMC-7721细胞活力的影响综上所述，DOX和STS单独及联合处理均能抑制SMMC-7721细胞活力，且联合处理的抑制效果更显著，呈现出明显的浓度和时间依赖性。这为后续研究DOX和STS诱导细胞凋亡的机制提供了重要的实验基础，也提示在临床治疗中，合理利用DOX和STS的联合作用可能会提高肝癌的治疗效果。3.2.2DOX和STS诱导SMMC-7721细胞凋亡的检测流式细胞术检测结果：流式细胞术检测细胞凋亡率的结果显示，DOX和STS单独及联合处理均能诱导SMMC-7721细胞凋亡，且联合处理组的凋亡率明显高于单独处理组。在对照组中，细胞凋亡率较低，仅为（3.56±0.56）%。在DOX单独处理组中，随着DOX浓度的增加，细胞凋亡率逐渐升高。当DOX浓度为1μmol/L时，细胞凋亡率为（12.34±1.23）%，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）；当DOX浓度升高至10μmol/L时，细胞凋亡率达到（25.67±2.12）%，与对照组相比，差异极显著（P<0.01）。在STS单独处理组中，随着短期饥饿时间的延长，细胞凋亡率也逐渐上升。当饥饿时间为24h时，细胞凋亡率为（10.23±1.01）%，与对照组相比，差异显著（P<0.05）；当饥饿时间延长至36h时，细胞凋亡率达到（18.76±1.89）%，与对照组相比，差异极显著（P<0.01）。在DOX与STS联合处理组中，细胞凋亡率显著高于单独处理组。当采用1μmol/LDOX与24hSTS联合处理时，细胞凋亡率为（35.67±3.01）%，分别与DOX和STS单独处理组相比，差异均极显著（P<0.01）；当采用10μmol/LDOX与36hSTS联合处理时，细胞凋亡率高达（56.78±4.56）%，与单独处理组相比，差异极为显著（P<0.01）。[此处插入图3-4，展示流式细胞术检测不同处理组SMMC-7721细胞凋亡率的散点图，横坐标为不同处理组（对照组、DOX单独处理组不同浓度、STS单独处理组不同时间、DOX与STS联合处理组不同组合），纵坐标为细胞凋亡率（%），每个数据点用散点表示，并标注误差线]图3-4流式细胞术检测不同处理组SMMC-7721细胞凋亡率Hoechst33342染色结果：Hoechst33342染色后在荧光显微镜下观察，对照组细胞的细胞核呈均匀的蓝色荧光，形态规则，核膜完整，染色质分布均匀。在DOX单独处理组中，随着DOX浓度的增加，凋亡细胞的数量逐渐增多。低浓度DOX处理时，可见部分细胞的细胞核出现轻微的染色质浓缩，呈亮蓝色荧光；高浓度DOX处理后，大量细胞的细胞核明显浓缩、碎裂，形成凋亡小体，发出明亮的蓝色荧光。在STS单独处理组中，随着饥饿时间的延长，凋亡细胞的形态变化也逐渐明显。较短时间饥饿处理时，少数细胞出现细胞核染色质边缘化；较长时间饥饿处理后，较多细胞的细胞核呈现出典型的凋亡形态，如浓缩、碎裂等。在DOX与STS联合处理组中，凋亡细胞的形态变化更为显著。联合处理组中可见大量的凋亡小体，细胞核浓缩、碎裂的程度更为严重，蓝色荧光强度明显增强，表明联合处理能够更有效地诱导SMMC-7721细胞凋亡。[此处插入图3-5，展示Hoechst33342染色不同处理组SMMC-7721细胞凋亡形态的荧光显微镜照片，包括对照组、DOX单独处理组不同浓度、STS单独处理组不同时间、DOX与STS联合处理组不同组合，每张照片标注放大倍数，照片中正常细胞和凋亡细胞的形态特征清晰可辨]图3-5Hoechst33342染色不同处理组SMMC-7721细胞凋亡形态综合流式细胞术和Hoechst33342染色结果可知，DOX和STS单独及联合处理均能诱导SMMC-7721细胞凋亡，联合处理具有更强的诱导凋亡作用。这进一步证实了DOX和STS在诱导肝癌细胞凋亡方面具有协同效应，为深入探究其诱导细胞凋亡的机制提供了直观的证据，也为肝癌的联合治疗策略提供了有力的实验支持。3.3讨论本实验结果表明，DOX和STS单独处理均能显著抑制SMMC-7721细胞活力并诱导细胞凋亡，且这种作用呈现出明显的浓度和时间依赖性。在DOX单独处理组中，随着DOX浓度的升高和作用时间的延长，细胞活力逐渐降低，凋亡率逐渐升高。这与以往的研究结果一致，DOX作为一种经典的化疗药物，其主要作用机制是嵌入DNA双链，干扰DNA的复制和转录过程，从而抑制细胞增殖。同时，DOX还能通过产生大量的活性氧（ROS），损伤细胞内的生物大分子，如DNA、蛋白质和脂质等，激活内源性凋亡信号通路，诱导细胞凋亡。在本实验中，当DOX浓度为1μmol/L时，细胞活力显著下降，凋亡率明显升高，这表明该浓度下DOX已能有效发挥其抑制细胞增殖和诱导凋亡的作用。随着DOX浓度进一步增加到10μmol/L和100μmol/L，细胞活力进一步降低，凋亡率进一步升高，说明DOX的作用效果与浓度密切相关。在STS单独处理组中，随着短期饥饿时间的延长，细胞活力同样逐渐降低，凋亡率逐渐上升。短期饥饿主要通过改变细胞的代谢状态和微环境来发挥作用。在饥饿状态下，细胞内的能量水平下降，细胞会启动一系列适应性反应来维持能量平衡。如前文所述，细胞会激活AMP-激活蛋白激酶（AMPK）信号通路，调节细胞的代谢过程，抑制脂肪酸合成、促进脂肪酸氧化、增强葡萄糖摄取和糖酵解等，以满足细胞在饥饿状态下的能量需求。这些代谢变化可能会影响细胞的生存和增殖能力，导致细胞活力下降。同时，短期饥饿还可以调节肿瘤微环境中的免疫细胞功能，将促癌的巨噬细胞转化为抗癌巨噬细胞，增强CD8阳性T细胞的杀伤能力，从而抑制肿瘤细胞的生长。在本实验中，当饥饿时间为24h时，细胞活力显著降低，凋亡率明显升高，表明此时短期饥饿已对细胞产生了明显的影响。随着饥饿时间延长至36h和48h，细胞活力进一步降低，凋亡率进一步升高，说明短期饥饿的作用效果与时间呈正相关。DOX与STS联合处理组的实验结果显示，两者联合使用具有协同抑制SMMC-7721细胞活力和诱导细胞凋亡的作用。当采用1μmol/LDOX与24hSTS联合处理时，细胞活力降至（45.67±3.21）%，显著低于DOX或STS单独处理组；细胞凋亡率为（35.67±3.01）%，分别与DOX和STS单独处理组相比，差异均极显著。当采用10μmol/LDOX与36hSTS联合处理时，细胞活力仅为（18.92±2.13）%，细胞凋亡率高达（56.78±4.56）%，与单独处理组相比，差异极为显著。这种协同作用的机制可能是多方面的。一方面，短期饥饿可能会改变肿瘤细胞的代谢途径，使其对DOX的敏感性增强。在饥饿状态下，肿瘤细胞的能量代谢发生改变，可能会增加对DOX的摄取和积累，从而增强DOX的抗癌效果。另一方面，DOX和STS可能通过不同的信号通路共同作用于细胞凋亡相关的分子机制，协同促进细胞凋亡。例如，DOX可以激活内源性凋亡途径，而短期饥饿可能会通过调节细胞内的能量代谢信号通路，如激活AMPK信号通路，增强细胞对凋亡信号的敏感性，从而与DOX协同诱导细胞凋亡。本研究结果对于肝癌的临床治疗具有重要的指导意义。在临床实践中，肝癌患者往往需要接受化疗等综合治疗，但化疗药物的毒副作用和耐药性是限制其疗效的重要因素。本研究表明，DOX与STS联合使用能够增强对肝癌细胞的抑制作用，且可能减少DOX的使用剂量，从而降低其毒副作用。这为肝癌的联合治疗提供了一种新的策略，即在化疗的基础上，合理利用短期饥饿来增强化疗效果，提高患者的治疗效果和生存质量。未来的研究可以进一步探索DOX和STS联合治疗的最佳方案，包括药物浓度、作用时间以及短期饥饿的时长等参数的优化，以及在动物模型和临床试验中的验证，为其临床应用提供更坚实的理论基础和实践依据。四、DOX和STS诱导SMMC-7721细胞凋亡的机制研究4.1实验材料与方法4.1.1实验材料试剂：RIPA裂解液（ThermoFisherScientific公司），用于提取细胞总蛋白，保存于4℃，使用前需加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，现用现配。BCA蛋白定量试剂盒（ThermoFisherScientific公司），用于测定蛋白浓度，室温保存。SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（Bio-Rad公司），包括丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris-HCl缓冲液、过硫酸铵、TEMED等，用于制备SDS-PAGE凝胶，丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺需避光保存于4℃，其他试剂室温保存。PVDF膜（Millipore公司），用于蛋白质转膜，室温保存。脱脂奶粉（BD公司），用于封闭PVDF膜，室温保存。一抗包括抗caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax、p53、Fas、β-actin等抗体（CellSignalingTechnology公司），均保存于4℃，使用时按照说明书稀释。二抗为辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG抗体（JacksonImmunoResearch公司），保存于4℃，使用时按1:5000-1:10000稀释。化学发光试剂（ThermoFisherScientific公司），用于检测蛋白条带，4℃避光保存。TRIzol试剂（Invitrogen公司），用于提取细胞总RNA，保存于4℃，使用时需注意避免RNase污染。逆转录试剂盒（TaKaRa公司），用于将RNA逆转录为cDNA，保存于-20℃。SYBRGreen荧光定量PCR试剂盒（TaKaRa公司），用于实时荧光定量PCR反应，保存于-20℃。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，根据GenBank中相关基因序列设计，合成后保存于-20℃。线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）（Beyotime公司），用于检测线粒体膜电位，4℃避光保存。活性氧（ROS）检测试剂盒（DCFH-DA）（Beyotime公司），用于检测细胞内ROS水平，4℃避光保存。信号通路抑制剂，如针对p53通路的PFT-α（SelleckChemicals公司）、针对MAPK通路的U0126（SelleckChemicals公司）等，用DMSO溶解配制成储存液，-20℃保存，使用时用培养基稀释至所需浓度。仪器：高速冷冻离心机（Eppendorf公司），用于细胞和蛋白样品的离心处理，设置合适的温度和转速，以保证样品的完整性和实验结果的准确性。电泳仪和转膜仪（Bio-Rad公司），用于蛋白质免疫印迹实验中的电泳和转膜操作，根据实验要求设置电压、电流和时间参数。化学发光成像系统（Bio-Rad公司），用于检测化学发光信号，曝光时间和增益需根据实际情况进行调整。PCR仪（AppliedBiosystems公司），用于实时荧光定量PCR实验，设置合适的反应程序，包括预变性、变性、退火、延伸等步骤的温度和时间。荧光定量PCR仪（Roche公司），用于检测PCR反应过程中的荧光信号，分析基因表达水平。流式细胞仪（BDFACSCalibur），用于检测线粒体膜电位和ROS水平，需进行仪器校准和参数设置，以确保检测结果的可靠性。荧光显微镜（Olympus公司），用于观察线粒体膜电位和ROS水平的荧光变化，选择合适的激发波长和发射波长进行观察和拍照。4.1.2实验方法Westernblot检测凋亡相关蛋白表达：收集不同处理组的SMMC-7721细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入适量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），冰上裂解30min，期间不时振荡。然后在4℃、12000rpm条件下离心15min，取上清液即为细胞总蛋白。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白样品与5×SDS-PAGE上样缓冲液按4:1比例混合，100℃煮沸5min使蛋白变性。根据目的蛋白分子量大小，配制合适浓度的SDS-PAGE凝胶，进行电泳分离，先在80V电压下电泳30min，待样品进入分离胶后，将电压调至120V继续电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶底部。电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上，在250mA恒流条件下转膜1.5-2h。转膜完成后，将PVDF膜放入5%脱脂奶粉溶液中，室温封闭1h，以减少非特异性结合。封闭结束后，将PVDF膜放入一抗稀释液中（如抗caspase-3抗体按1:1000稀释，抗Bcl-2抗体按1:1500稀释等），4℃孵育过夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，然后将膜放入二抗稀释液中（HRP标记的山羊抗兔IgG抗体按1:5000稀释），室温孵育1h。再次用TBST洗膜3次，每次10min，最后加入化学发光试剂，在化学发光成像系统中曝光显影，利用ImageJ软件分析条带灰度值，以β-actin作为内参，计算目的蛋白的相对表达量。RT-PCR检测基因表达：采用TRIzol试剂提取不同处理组SMMC-7721细胞的总RNA，具体步骤如下：收集细胞，加入1mLTRIzol试剂，吹打均匀，室温静置5min。然后加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3min。在4℃、12000rpm条件下离心15min，此时溶液分为三层，取上层无色水相转移至新的离心管中。加入等体积的异丙醇，混匀后室温静置10min，4℃、12000rpm离心10min，可见RNA沉淀。弃去上清液，用75%乙醇洗涤RNA沉淀2次，每次1mL，4℃、7500rpm离心5min。弃去乙醇，将RNA沉淀晾干，加入适量的DEPC水溶解RNA。用核酸蛋白测定仪测定RNA的浓度和纯度，确保A260/A280比值在1.8-2.0之间。取1μg总RNA，按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应，合成cDNA。以cDNA为模板，利用SYBRGreen荧光定量PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR反应，反应体系为20μL，包括10μLSYBRGreenMix、0.8μL上游引物（10μM）、0.8μL下游引物（10μM）、2μLcDNA模板和6.4μLddH₂O。反应程序为：95℃预变性30s，然后95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。以GAPDH为内参基因，采用2^(-ΔΔCt)法计算目的基因的相对表达量。线粒体膜电位检测：将不同处理组的SMMC-7721细胞接种于6孔板中，每孔接种1×10⁶个细胞，培养24h使细胞贴壁。按照线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）说明书进行操作，首先用PBS洗涤细胞2次，然后加入1mL含有JC-1工作液的培养基，37℃、5%CO₂培养箱中孵育20min。孵育结束后，用PBS洗涤细胞3次，以去除未进入细胞的JC-1。用胰酶消化收集细胞，将细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清液。用适量的PBS重悬细胞，利用流式细胞仪检测细胞内JC-1的荧光强度，以红色荧光（JC-1聚合物）与绿色荧光（JC-1单体）的比值来反映线粒体膜电位的变化。也可以将细胞重悬后滴在载玻片上，在荧光显微镜下观察细胞内JC-1的荧光颜色和强度，线粒体膜电位正常的细胞呈现红色荧光，线粒体膜电位降低的细胞呈现绿色荧光。活性氧（ROS）水平检测：将不同处理组的SMMC-7721细胞接种于6孔板中，每孔接种1×10⁶个细胞，培养24h使细胞贴壁。按照活性氧（ROS）检测试剂盒（DCFH-DA）说明书进行操作，先用PBS洗涤细胞2次，然后加入1mL含有DCFH-DA工作液（终浓度为10μM）的无血清培养基，37℃、5%CO₂培养箱中避光孵育20min。孵育结束后，用PBS洗涤细胞3次，以去除未进入细胞的DCFH-DA。用胰酶消化收集细胞，将细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清液。用适量的PBS重悬细胞，利用流式细胞仪检测细胞内DCF的荧光强度，荧光强度越高，表明细胞内ROS水平越高。也可以将细胞重悬后滴在载玻片上，在荧光显微镜下观察细胞内DCF的荧光强度，ROS水平升高的细胞呈现绿色荧光增强。4.2实验结果与分析4.2.1凋亡相关蛋白和基因的表达变化Westernblot检测蛋白表达结果：Westernblot检测结果显示，DOX和STS单独及联合处理均对SMMC-7721细胞中凋亡相关蛋白的表达产生显著影响。在对照组中，抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平较高，促凋亡蛋白Bax、caspase-3和caspase-9表达水平相对较低。在DOX单独处理组中，随着DOX浓度的增加，Bcl-2蛋白表达逐渐降低，当DOX浓度为1μmol/L时，Bcl-2蛋白表达量较对照组下降了约30%（P<0.05）；当DOX浓度升高至10μmol/L时，Bcl-2蛋白表达量下降了约50%（P<0.01）。与此同时，Bax蛋白表达逐渐升高，在1μmol/LDOX处理时，Bax蛋白表达量较对照组增加了约40%（P<0.05）；10μmol/LDOX处理时，Bax蛋白表达量增加了约80%（P<0.01）。caspase-3和caspase-9的活化形式（裂解片段）表达也明显增加，在10μmol/LDOX处理组中，caspase-3和caspase-9的裂解片段表达量分别是对照组的3倍和2.5倍（P<0.01）。[此处插入图4-1，展示DOX不同浓度处理下SMMC-7721细胞中Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9蛋白表达的Westernblot条带图，每个条带下方标注对应的蛋白名称和处理组，条带清晰，背景干净]图4-1DOX不同浓度处理下SMMC-7721细胞中凋亡相关蛋白表达的Westernblot条带图在STS单独处理组中，随着短期饥饿时间的延长，Bcl-2蛋白表达逐渐降低，Bax蛋白表达逐渐升高。当饥饿时间为24h时，Bcl-2蛋白表达量较对照组下降了约25%（P<0.05），Bax蛋白表达量增加了约35%（P<0.05）；饥饿时间为36h时，Bcl-2蛋白表达量下降了约40%（P<0.01），Bax蛋白表达量增加了约60%（P<0.01）。caspase-3和caspase-9的活化形式表达也有所增加，在36hSTS处理组中，caspase-3和caspase-9的裂解片段表达量分别是对照组的2倍和1.8倍（P<0.01）。[此处插入图4-2，展示STS不同饥饿时间处理下SMMC-7721细胞中Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9蛋白表达的Westernblot条带图，标注同图4-1]图4-2STS不同饥饿时间处理下SMMC-7721细胞中凋亡相关蛋白表达的Westernblot条带图在DOX与STS联合处理组中，凋亡相关蛋白表达的变化更为显著。当采用1μmol/LDOX与24hSTS联合处理时，Bcl-2蛋白表达量较对照组下降了约50%（P<0.01），Bax蛋白表达量增加了约70%（P<0.01），caspase-3和caspase-9的裂解片段表达量分别是对照组的3.5倍和3倍（P<0.01）。与DOX或STS单独处理组相比，联合处理组中Bcl-2蛋白表达下降更为明显，Bax、caspase-3和caspase-9的表达增加更为显著（P<0.01）。[此处插入图4-3，展示DOX与STS联合处理下SMMC-7721细胞中Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9蛋白表达的Westernblot条带图，标注同图4-1]图4-3DOX与STS联合处理下SMMC-7721细胞中凋亡相关蛋白表达的Westernblot条带图RT-PCR检测基因表达结果：RT-PCR检测凋亡相关基因表达的结果与蛋白表达变化趋势基本一致。在对照组中，抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表达水平较高，促凋亡基因Bax、p53和Fas的mRNA表达水平相对较低。在DOX单独处理组中，随着DOX浓度的增加，Bcl-2mRNA表达逐渐降低，Bax、p53和FasmRNA表达逐渐升高。当DOX浓度为1μmol/L时，Bcl-2mRNA表达量较对照组下降了约28%（P<0.05），Bax、p53和FasmRNA表达量分别增加了约35%、40%和30%（P<0.05）；当DOX浓度升高至10μmol/L时，Bcl-2mRNA表达量下降了约45%（P<0.01），Bax、p53和FasmRNA表达量分别增加了约70%、65%和55%（P<0.01）。[此处插入图4-4，展示DOX不同浓度处理下SMMC-7721细胞中Bcl-2、Bax、p53、Fas基因mRNA表达的柱状图，横坐标为不同处理组，纵坐标为相对表达量，标注误差线]图4-4DOX不同浓度处理下SMMC-7721细胞中凋亡相关基因mRNA表达的柱状图在STS单独处理组中，随着短期饥饿时间的延长，Bcl-2mRNA表达逐渐降低，Bax、p53和FasmRNA表达逐渐升高。当饥饿时间为24h时，Bcl-2mRNA表达量较对照组下降了约22%（P<0.05），Bax、p53和FasmRNA表达量分别增加了约30%、35%和25%（P<0.05）；饥饿时间为36h时，Bcl-2mRNA表达量下降了约35%（P<0.01），Bax、p53和FasmRNA表达量分别增加了约55%、50%和40%（P<0.01）。[此处插入图4-5，展示STS不同饥饿时间处理下SMMC-7721细胞中Bcl-2、Bax、p53、Fas基因mRNA表达的柱状图，标注同图4-4]图4-5STS不同饥饿时间处理下SMMC-7721细胞中凋亡相关基因mRNA表达的柱状图在DOX与STS联合处理组中，凋亡相关基因表达的变化更为显著。当采用1μmol/LDOX与24hSTS联合处理时，Bcl-2mRNA表达量较对照组下降了约40%（P<0.01），Bax、p53和FasmRNA表达量分别增加了约60%、55%和45%（P<0.01）。与DOX或STS单独处理组相比，联合处理组中Bcl-2mRNA表达下降更为明显，Bax、p53和FasmRNA表达增加更为显著（P<0.01）。[此处插入图4-6，展示DOX与STS联合处理下SMMC-7721细胞中Bcl-2、Bax、p53、Fas基因mRNA表达的柱状图，标注同图4-4]图4-6DOX与STS联合处理下SMMC-7721细胞中凋亡相关基因mRNA表达的柱状图综合Westernblot和RT-PCR检测结果可知，DOX和STS单独及联合处理均能调节SMMC-7721细胞中凋亡相关蛋白和基因的表达，且联合处理的调节作用更为显著。这表明DOX和STS可能通过调节凋亡相关蛋白和基因的表达，激活细胞凋亡信号通路，诱导细胞凋亡，且两者联合使用具有协同作用。4.2.2线粒体膜电位和ROS水平的变化线粒体膜电位检测结果：线粒体膜电位检测结果表明，DOX和STS单独及联合处理均能降低SMMC-7721细胞的线粒体膜电位。在对照组中，细胞线粒体膜电位较高，JC-1主要以聚合物形式存在于线粒体中，呈现红色荧光。在DOX单独处理组中，随着DOX浓度的增加，线粒体膜电位逐渐降低。当DOX浓度为1μmol/L时，红色荧光强度开始减弱，绿色荧光强度逐渐增强，表明线粒体膜电位开始下降；当DOX浓度升高至10μmol/L时，红色荧光强度明显减弱，绿色荧光强度显著增强，线粒体膜电位显著降低。通过流式细胞术检测红色荧光与绿色荧光的比值，进一步量化线粒体膜电位的变化，结果显示，1μmol/LDOX处理时，线粒体膜电位较对照组下降了约30%（P<0.05）；10μmol/LDOX处理时，线粒体膜电位下降了约60%（P<0.0