HPTS协同ε-聚赖氨酸对芽孢的灭活效能、机制及动力学解析

HPTS协同ε-聚赖氨酸对芽孢的灭活效能、机制及动力学解析一、引言1.1研究背景与意义1.1.1芽孢的特性与危害芽孢是某些细菌在生长发育后期，在细胞内形成的一种特殊的休眠体，又称内生孢子。芽孢具有极强的抗逆性，这源于其独特的结构与组成。芽孢拥有孢外壁、芽孢衣、外膜、芽孢皮层、芽孢壁、内膜和核心等多层保护性结构。其中，芽孢皮层主要含芽孢肽聚糖及吡啶二羧酸钙盐，是芽孢抗压性的关键结构；芽孢衣主要由蛋白质组成，含大量疏水性氨基酸，透性差，能有效阻挡外界不良因素。芽孢含水量低，壁厚而致密，通透性差，折光性强，这些特性使其对高温、紫外线、干燥和多种有毒的化学物质都有很强的抗性。例如，在100℃沸水中，普通芽孢可存活数小时，甚至在普通条件下，芽孢可保持几年至几十年的生活力。芽孢广泛分布在水、土壤、空气、食物等环境中。在食品加工与储存过程中，芽孢的存在是食品安全的重大隐患。如枯草杆菌芽孢能产生呕吐毒素、腹泻毒素等多种对人类和动物有害的毒素，一旦这些芽孢在适宜条件下萌发为营养细胞并大量繁殖，就可能引发食物中毒，导致恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症状，严重时会威胁生命健康。在农产品种植环境中，芽孢也可能成为病原菌，引发植物病害。像小麦、水稻等粮食作物，可能因枯草杆菌芽孢的侵害而发生病害，影响灌浆、结实，造成减产；果蔬种植中，芽孢可引起果蔬腐烂变质，缩短保鲜期，降低商品价值，给农业生产带来巨大的经济损失。因此，有效灭活芽孢对于保障食品安全和农业生产的稳定至关重要。1.1.2HPTS与ε-聚赖氨酸的研究现状HPTS（高压热杀菌处理，High-pressurethermalsterilization）是一种将静态超高压和热耦合起来用于杀菌的新兴技术。国外学者早在20世纪90年代就开始关注超高压与热结合的杀菌技术，日本学者率先开展了超高压热杀菌对食品中微生物影响的研究，发现HPTS能够有效灭活一些耐热性微生物，如嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草杆菌芽孢等。随后，欧美国家的研究人员深入探讨HPTS的杀菌机制，揭示了HPTS能够破坏微生物的细胞膜、蛋白质和核酸等生物大分子，从而实现杀菌作用。国内对HPTS的研究起步相对较晚，但近年来发展迅速，众多科研机构和高校开展了相关研究，研究内容涉及HPTS在食品杀菌、农产品保鲜等领域的应用。例如，有研究利用HPTS对鲜榨果汁进行处理，在有效杀灭果汁中微生物的同时，较好地保留了果汁的营养成分和风味物质；还有研究将HPTS应用于肉制品的杀菌保鲜，显著延长了肉制品的货架期。ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine，简称ε-PL）是一种由白色链霉菌经过液体深层有氧发酵生产的含有25-35个L-赖氨酸残基的同型单体聚合物。它具有诸多优良特性，如抗菌谱广，能有效地抑制革兰氏阳性和阴性菌、酵母菌、霉菌等微生物；耐高温，在121℃，30分钟的高温环境下不分解，可参与产品热处理过程；溶水性强，易溶于水，溶解度至少为500g/L；pH使用范围广，在pH2-9条件下均具有较强的抑菌能力，能弥补其他防腐剂在中性和碱性条件下活性低的缺点；协同增效性强，与其他食品添加剂（如醋酸、乙醇、甘氨酸、有机酸等）搭配使用，能大大提高抑菌效果；安全性高，急性毒理试验LD50为5g/kg，与食盐相当，人体摄入后能降解成赖氨酸营养物，被吸收利用。目前，ε-聚赖氨酸被广泛应用于食品、日化、医药等行业，如在食品领域，被用于蛋糕、糕点、饮料、肉制品、罐头等的防腐保鲜。然而，目前关于HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢灭活作用的研究还相对较少。虽然已有研究对HPTS和ε-聚赖氨酸各自的特性及应用进行了大量探索，但将二者结合用于芽孢灭活的研究尚处于起步阶段，对于它们的协同作用机制、最佳作用条件以及在实际应用中的效果等方面，还缺乏深入、全面的研究。1.1.3研究意义本研究聚焦于HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的灭活作用及动力学，具有重要的理论与实际意义。在实际应用方面，对于食品安全领域，开发出HPTS结合ε-聚赖氨酸的芽孢灭活方法，能够为食品加工企业提供一种新型、安全、高效的杀菌技术，有效减少食品中芽孢及其毒素的污染，保障消费者的健康，提升食品行业的安全性和市场竞争力。在农业生产中，该研究成果可为农作物病害防治提供新的策略和方法，减少化学农药的使用，降低对环境的污染，促进农业的可持续发展。从理论层面来看，深入研究HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的灭活机制，有助于丰富微生物学和食品科学等相关领域的理论知识。通过探究HPTS和ε-聚赖氨酸如何协同作用于芽孢，以及这种协同作用对芽孢结构、生理代谢等方面的具体影响，能够为进一步优化和拓展该技术的应用提供科学依据，推动相关理论的完善与发展。1.2研究目标与内容1.2.1研究目标本研究旨在深入探究HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的灭活效能、作用机制及动力学规律，为开发新型高效的芽孢灭活技术提供坚实的理论与实践依据。具体而言，一是精准测定HPTS单独作用、ε-聚赖氨酸单独作用以及两者结合作用下对芽孢的灭活率，全面系统地评估其灭活效果，并通过对比分析，明确HPTS与ε-聚赖氨酸联合使用时的协同增效作用，确定最佳的作用条件组合，包括但不限于HPTS的压力、温度、处理时间，以及ε-聚赖氨酸的浓度等参数。二是从芽孢的结构变化、生理代谢过程的改变、关键生物大分子的损伤等多个维度，深入剖析HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的灭活机制，揭示二者协同作用对芽孢产生影响的内在本质。三是构建HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢灭活动力学模型，精确解析其动力学参数，如反应速率常数、活化能等，清晰阐释灭活过程随时间的变化规律，为实际应用中的工艺设计和优化提供科学的量化依据。1.2.2研究内容基于上述研究目标，本研究将从以下几个方面展开深入研究：HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的灭活效果研究：选取具有代表性的芽孢，如枯草杆菌芽孢、嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢等，作为实验对象。分别设置HPTS单独处理组、ε-聚赖氨酸单独处理组以及HPTS结合ε-聚赖氨酸处理组，同时设立空白对照组。在HPTS处理组中，系统地考察不同压力（如200MPa、300MPa、400MPa等）、温度（如40℃、50℃、60℃等）和处理时间（如10min、20min、30min等）对芽孢灭活率的影响；在ε-聚赖氨酸处理组中，探究不同浓度（如0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL等）对芽孢灭活率的作用。对于HPTS结合ε-聚赖氨酸处理组，全面考察不同压力、温度、时间和ε-聚赖氨酸浓度的组合对芽孢灭活率的综合影响。采用平板计数法、稀释涂布法等经典微生物检测方法，准确测定处理后芽孢的存活数量，进而计算灭活率。通过多组实验数据的对比分析，筛选出HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢灭活的最佳条件。HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的作用机制研究：运用扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）等微观观测技术，直观地观察芽孢在HPTS单独作用、ε-聚赖氨酸单独作用以及HPTS结合ε-聚赖氨酸作用后的形态和结构变化，包括芽孢外壁、芽孢衣、芽孢皮层等结构的完整性和损伤情况。利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）、拉曼光谱等技术，深入分析芽孢中蛋白质、核酸等生物大分子的结构变化，如蛋白质的二级结构改变、核酸的碱基配对变化等。通过检测芽孢内关键酶的活性，如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等，以及ATP含量、代谢产物等生理指标，深入探究芽孢生理代谢过程的变化，揭示HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢生理功能的影响机制。HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的灭活动力学研究：在确定的最佳作用条件下，按照一定的时间间隔（如5min、10min、15min等）对芽孢进行取样检测。基于实验数据，运用经典的动力学模型，如一级反应动力学模型、二级反应动力学模型等，对HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的灭活动力学进行拟合分析。通过拟合得到反应速率常数、活化能等动力学参数，深入探讨灭活过程的动力学特征，如反应速率随时间的变化规律、温度对反应速率的影响等。同时，结合实验结果和理论分析，对动力学模型进行优化和验证，提高模型的准确性和可靠性。HPTS结合ε-聚赖氨酸灭活芽孢的应用前景评估：将HPTS结合ε-聚赖氨酸的灭活技术应用于实际的食品体系（如鲜榨果汁、肉制品、乳制品等）和农产品种植环境（如种子处理、土壤消毒等）中。在食品体系中，考察该技术对食品中芽孢的灭活效果，以及对食品营养成分（如维生素、矿物质、蛋白质等）、风味物质（如挥发性香气成分）和感官品质（如色泽、口感、质地等）的影响。在农产品种植环境中，研究该技术对土壤中芽孢的灭活效果，以及对种子发芽率、幼苗生长发育、农作物产量和品质的影响。通过实际应用研究，综合评估HPTS结合ε-聚赖氨酸灭活芽孢技术的可行性、有效性和安全性，为其在食品安全和农业生产领域的推广应用提供科学依据。1.3研究方法与技术路线1.3.1研究方法实验法：通过设计并实施一系列严谨的实验，系统研究HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的灭活作用。在芽孢悬液制备环节，严格按照微生物实验操作规范，采用标准的菌种活化、培养和稀释方法，确保芽孢悬液浓度的准确性和均一性。在HPTS处理实验中，运用专业的高压设备，精确控制压力、温度和处理时间等参数，保证实验条件的稳定性和可重复性。在ε-聚赖氨酸处理实验中，利用高精度的移液器和天平，准确配置不同浓度的ε-聚赖氨酸溶液，并严格控制添加量。在联合处理实验中，严格按照设定的顺序和时间间隔，添加HPTS和ε-聚赖氨酸，以全面考察二者结合对芽孢的灭活效果。通过多次重复实验，获取可靠的实验数据，确保研究结果的科学性和可靠性。光谱分析法：运用傅里叶变换红外光谱（FTIR）技术，深入分析芽孢在HPTS结合ε-聚赖氨酸作用前后蛋白质、核酸等生物大分子的结构变化。将处理前后的芽孢样品进行干燥、研磨等预处理后，与溴化钾混合压片，利用FTIR光谱仪进行扫描，得到红外光谱图。通过对比分析光谱图中特征吸收峰的位置、强度和形状等信息，判断生物大分子的结构变化，如蛋白质二级结构中α-螺旋、β-折叠等结构的改变，以及核酸中碱基配对、磷酸二酯键等结构的变化。同时，采用拉曼光谱技术，进一步验证和补充FTIR分析结果，从不同角度揭示芽孢生物大分子的结构变化机制。电镜观察法：借助扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM），直观观察芽孢在HPTS结合ε-聚赖氨酸作用后的形态和结构变化。将处理后的芽孢样品进行固定、脱水、包埋、切片等一系列精细的样品制备过程，以确保样品在电镜下能够清晰成像。在SEM观察中，通过调节电子束的加速电压、工作距离等参数，获取芽孢表面的微观形态图像，观察芽孢外壁、芽孢衣等结构的完整性和损伤情况。在TEM观察中，利用高分辨率的透射电子显微镜，观察芽孢内部的超微结构，如芽孢皮层、芽孢壁、内膜和核心等结构的变化，深入分析HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢结构的破坏机制。模型拟合法：基于实验获得的芽孢灭活数据，运用经典的动力学模型，如一级反应动力学模型、二级反应动力学模型等，对HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的灭活动力学进行拟合分析。通过非线性回归等数学方法，确定模型中的参数，如反应速率常数、活化能等。根据拟合优度、残差分析等指标，评估模型的准确性和可靠性，选择最适合描述灭活动力学过程的模型。结合实际实验结果和理论分析，对模型进行优化和验证，进一步深入探讨灭活过程的动力学特征和规律。1.3.2技术路线本研究的技术路线清晰展示了从芽孢悬液制备到结果分析的完整研究流程（见图1）。首先，进行芽孢悬液的制备，选取具有代表性的芽孢，如枯草杆菌芽孢、嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢等，通过菌种活化、培养和稀释等标准操作，制备出浓度均一、活性稳定的芽孢悬液。随后，分别开展HPTS单独处理实验、ε-聚赖氨酸单独处理实验以及HPTS结合ε-聚赖氨酸处理实验。在HPTS单独处理实验中，系统考察不同压力、温度和处理时间对芽孢灭活率的影响；在ε-聚赖氨酸单独处理实验中，探究不同浓度对芽孢灭活率的作用；在联合处理实验中，全面考察不同压力、温度、时间和ε-聚赖氨酸浓度的组合对芽孢灭活率的综合影响。接着，利用平板计数法、稀释涂布法等微生物检测方法，准确测定处理后芽孢的存活数量，计算灭活率，以评估灭活效果。同时，运用光谱分析法（FTIR、拉曼光谱）、电镜观察法（SEM、TEM）等技术手段，从生物大分子结构和微观形态结构等层面深入分析芽孢的变化，揭示HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的作用机制。最后，基于实验数据，运用模型拟合法构建灭活动力学模型，分析动力学参数，阐释灭活过程的变化规律，并对研究结果进行总结和讨论，为开发新型高效的芽孢灭活技术提供理论与实践依据。[此处插入技术路线图]图1技术路线图二、HPTS与ε-聚赖氨酸的特性及作用机制2.1HPTS的原理与特性2.1.1HPTS的工作原理HPTS的工作原理基于高压和热的协同作用，对微生物的结构和功能产生多方面的破坏。在高压环境下，微生物细胞内的分子间距被压缩，导致分子间相互作用发生改变。细胞膜作为细胞与外界环境的重要屏障，受到高压的影响最为显著。细胞膜中的磷脂双分子层在高压作用下排列紊乱，流动性降低，膜的完整性受到破坏，从而使细胞膜的通透性增加。这不仅导致细胞内的离子平衡被打破，如钾离子、钠离子等重要离子的外流，还使得细胞内的一些小分子物质和生物大分子，如糖类、蛋白质、核酸等也可能泄漏到细胞外，进而影响细胞的正常生理功能。蛋白质和核酸是微生物细胞内的关键生物大分子，对维持细胞的生命活动起着至关重要的作用。高压会使蛋白质的二级、三级和四级结构发生改变，破坏蛋白质分子内的氢键、疏水相互作用和二硫键等非共价键，导致蛋白质的空间构象发生变化，从而使蛋白质失去原有的生物学活性。例如，一些参与细胞代谢过程的酶，在高压作用下其活性中心的结构被破坏，无法正常催化化学反应，进而影响细胞的代谢过程。对于核酸，高压可能导致DNA双螺旋结构的解旋，破坏碱基对之间的氢键，使DNA的复制、转录等过程受到干扰，影响微生物的遗传信息传递和表达。热的作用进一步加剧了微生物的损伤。适当升高温度，能够加速微生物细胞内的化学反应速率，使微生物的生理代谢活动紊乱。高温会使细胞膜的流动性进一步增强，加剧细胞膜的损伤，导致更多的物质泄漏。同时，高温也会加速蛋白质的变性和核酸的降解。蛋白质在高温下更容易失去其天然构象，发生聚集和沉淀，从而完全丧失活性。核酸分子在高温下，磷酸二酯键可能断裂，导致核酸链的断裂和降解，使微生物无法正常进行遗传信息的传递和表达。当高压和热协同作用时，二者相互促进，对微生物产生更强烈的破坏作用。高压使微生物细胞结构变得脆弱，热则进一步加剧细胞内生物大分子的损伤和代谢紊乱，从而更有效地实现对微生物的灭活。这种协同作用能够在相对较低的温度和较短的时间内达到较好的杀菌效果，相比于传统的高温杀菌技术，能够更好地保留食品的营养成分、风味和质地等品质特性。2.1.2HPTS的杀菌特性HPTS在杀菌方面展现出一系列独特的特性，这些特性使其在食品加工和保鲜等领域具有显著的优势。首先，HPTS具有高效的杀菌能力。研究表明，在适宜的压力和温度条件下，HPTS能够在较短的时间内使芽孢等微生物的存活数量大幅下降。例如，有研究利用HPTS对枯草杆菌芽孢进行处理，在550MPa、75℃的条件下处理20min，芽孢存活率下降了6.30。这是因为HPTS通过高压和热的协同作用，能够全面破坏芽孢的多层结构，包括芽孢外壁、芽孢衣、芽孢皮层等，以及芽孢内的生物大分子，如蛋白质、核酸等，从而有效降低芽孢的抗性，实现高效灭活。其次，HPTS能够在相对低温和较短时间内实现杀菌，这对于食品品质的保留具有重要意义。与传统的高温热杀菌相比，HPTS使用的温度较低、时间较短，能更好地保持食品原有的色、香、味、质构、营养素和功能性成分。在对鲜榨果汁进行HPTS处理时，能够在有效杀灭果汁中微生物的同时，较好地保留果汁中的维生素C、类黄酮等营养成分，以及果汁的天然色泽和风味。在肉制品的杀菌保鲜中，HPTS处理也能显著延长肉制品的货架期，同时减少对肉制品口感和质地的影响。此外，HPTS还具有一定的选择性杀菌能力。它对不同种类的微生物，由于其结构和生理特性的差异，HPTS的杀菌效果会有所不同。一般来说，芽孢由于其特殊的结构和高度的抗逆性，对HPTS的耐受性相对较强，但在适当的条件下，HPTS仍能有效灭活芽孢。而对于一些营养细胞，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等，HPTS的杀菌效果更为显著。这使得HPTS在实际应用中，可以根据不同的需求和食品体系，选择合适的处理条件，有针对性地杀灭目标微生物，同时最大程度减少对食品中有益微生物和营养成分的影响。然而，HPTS也存在一些局限性。一方面，HPTS设备成本较高，需要专门的高压设备和精确的温度控制装置，这限制了其在一些小型企业或经济欠发达地区的推广应用。另一方面，HPTS对某些芽孢的灭活效果仍有待提高，特别是一些极端耐热的芽孢，可能需要更高的压力和温度组合，这可能会对食品品质产生一定的影响。此外，HPTS的处理过程相对复杂，需要严格控制压力、温度和时间等参数，对操作人员的技术水平要求较高。2.2ε-聚赖氨酸的结构与抑菌机制2.2.1ε-聚赖氨酸的分子结构ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine，简称ε-PL）是一种由白色链霉菌经过液体深层有氧发酵生产的含有25-35个L-赖氨酸残基的同型单体聚合物。其分子结构独特，由L-赖氨酸的ε-氨基与另一个L-赖氨酸的α-羧基通过酰胺键连接而成，形成了直链状的聚合物（见图2）。这种特殊的连接方式赋予了ε-聚赖氨酸许多优良的理化性质。[此处插入ε-聚赖氨酸的分子结构示意图]图2ε-聚赖氨酸的分子结构示意图从理化性质上看，ε-聚赖氨酸为淡黄色粉末，吸湿性强，这使其在潮湿环境中能够吸收水分，保持一定的湿润度。它略有苦味，在实际应用中，可能会对食品的口感产生一定影响，因此在使用时需要考虑其添加量和与其他成分的搭配。ε-聚赖氨酸不受pH值影响，在广泛的pH范围内（pH2-9）都能保持稳定的结构和活性。这一特性使其能够在不同酸碱度的食品体系和环境中发挥作用，大大拓宽了其应用范围。例如，在酸性的果汁饮料和碱性的豆制品中，ε-聚赖氨酸都能有效地抑制微生物的生长。它对热稳定，在121℃，20min的高温条件下不分解，可参与产品的热处理过程。这使得它在食品加工中，能够与高温杀菌等工艺相结合，提高食品的安全性和保质期。在肉制品的高温蒸煮加工过程中，ε-聚赖氨酸不会因高温而失去活性，依然能够对后续可能污染的微生物起到抑制作用。ε-聚赖氨酸的抑菌活性与其分子量密切相关。研究表明，分子量在3600-4300之间的ε-聚赖氨酸抑菌活性最好。当分子量低于1300时，ε-聚赖氨酸会失去抑菌活性。这是因为分子量的大小会影响其分子结构和电荷分布，进而影响其与微生物细胞膜、生物大分子等的相互作用。较大分子量的ε-聚赖氨酸能够更好地吸附在微生物表面，形成有效的抑菌屏障，而分子量过小则无法发挥其应有的抑菌功能。由于ε-聚赖氨酸是混合物，所以没有固定的熔点，250℃以上开始软化分解。它溶于水，微溶于乙醇，这使其在水溶液体系中能够更好地发挥作用，在食品加工中，容易与水相体系的食品原料混合均匀，实现对微生物的有效抑制。对其进行红外光谱分析表明，在1680-1640cm-1和1580-1520cm-1处有强吸收峰，这些特征吸收峰与ε-聚赖氨酸的酰胺键等结构密切相关，可用于其结构鉴定和纯度分析。2.2.2ε-聚赖氨酸的抑菌作用机制ε-聚赖氨酸的抑菌作用机制是一个复杂的过程，主要通过破坏细胞膜和结合生物大分子等方式来抑制微生物的生长。从破坏细胞膜的角度来看，ε-聚赖氨酸主要通过静电吸附作用与细胞膜表面的磷脂头部相结合。细胞膜是微生物细胞与外界环境的重要屏障，对维持细胞的正常生理功能起着关键作用。ε-聚赖氨酸带有正电荷，而细胞膜表面的磷脂头部带有负电荷，二者通过静电作用相互吸引。随着ε-聚赖氨酸浓度的增加，它会在细胞膜表面逐渐积聚，当达到一定阈值时，会像毡毯一样覆盖在细菌膜表面。此时，ε-聚赖氨酸会平行于膜表面慢慢积聚并形成一个快速交换的孔洞，让更多的ε-聚赖氨酸进入到细菌内部。在这个过程中，ε-聚赖氨酸的疏水基团朝向磷脂侧，亲水部分面向溶液，这种结构的改变导致细胞膜的完整性和结构被破坏。细胞膜的通透性增加，细胞内的离子（如钾离子、钠离子等）和物质（如蛋白质、核酸等）开始外流，细胞内的离子平衡和物质代谢被打乱，最终导致细胞死亡。研究发现，ε-聚赖氨酸处理大肠杆菌后，大肠杆菌细胞内的核酸、蛋白质等大量排出，细胞的生长和繁殖受到明显抑制。ε-聚赖氨酸还能通过结合并破坏微生物的核酸和蛋白质等生物大分子，从而抑制微生物的生长、代谢和繁殖能力。核酸是微生物遗传信息的携带者，蛋白质则参与微生物的各种生理代谢过程。ε-聚赖氨酸能够与核酸和蛋白质发生相互作用，改变它们的结构和功能。它可能与DNA结合，干扰DNA的复制、转录等过程，使微生物无法正常传递遗传信息，进而影响其生长和繁殖。在对枯草杆菌的研究中发现，ε-聚赖氨酸处理后，枯草杆菌的DNA结构发生改变，相关基因的表达受到抑制，导致其生长受到阻碍。对于蛋白质，ε-聚赖氨酸可能与蛋白质的活性位点或关键结构域结合，使蛋白质失去原有的生物学活性。一些参与细胞代谢的酶，在与ε-聚赖氨酸结合后，其催化活性降低或丧失，导致微生物的代谢过程紊乱，无法正常生长。2.3两者结合的协同增效可能性探讨2.3.1基于作用靶点的协同分析HPTS和ε-聚赖氨酸具有不同的作用靶点，这为二者结合产生协同增效作用提供了理论基础。HPTS主要通过高压和热的协同作用，对芽孢的细胞膜、蛋白质和核酸等生物大分子产生破坏作用。在高压下，芽孢细胞膜的磷脂双分子层排列紊乱，流动性降低，膜的完整性被破坏，导致细胞膜通透性增加，细胞内物质泄漏。同时，高压还会使蛋白质的空间构象发生改变，破坏蛋白质分子内的氢键、疏水相互作用和二硫键等非共价键，使其失去生物学活性。对于核酸，高压可能导致DNA双螺旋结构解旋，破坏碱基对之间的氢键，影响遗传信息的传递和表达。热的作用则进一步加剧了这些损伤，加速了细胞膜的损伤、蛋白质的变性和核酸的降解。而ε-聚赖氨酸主要通过静电吸附作用与芽孢细胞膜表面的磷脂头部相结合，破坏细胞膜的完整性和结构。随着ε-聚赖氨酸浓度的增加，它会在细胞膜表面逐渐积聚，形成类似毡毯的结构，进而形成孔洞，使更多的ε-聚赖氨酸进入细胞内部。在这个过程中，细胞膜的通透性增加，细胞内的离子和物质外流，细胞内的离子平衡和物质代谢被打乱。ε-聚赖氨酸还能与芽孢内的核酸和蛋白质等生物大分子结合，干扰其正常的生理功能。它可能与DNA结合，影响DNA的复制、转录等过程，也可能与蛋白质的活性位点或关键结构域结合，使蛋白质失去生物学活性。当HPTS与ε-聚赖氨酸结合时，二者的作用靶点相互补充，能够从多个层面更全面地破坏芽孢的结构和功能。HPTS对芽孢生物大分子的破坏，可能使芽孢的结构变得更加脆弱，从而有利于ε-聚赖氨酸与细胞膜和生物大分子的结合。HPTS破坏了芽孢细胞膜的完整性后，ε-聚赖氨酸更容易进入细胞内部，与细胞内的核酸和蛋白质发生相互作用。反之，ε-聚赖氨酸对细胞膜的破坏，也可能使HPTS更容易作用于芽孢内部的生物大分子，增强HPTS的破坏效果。这种基于作用靶点的协同作用，能够显著提高对芽孢的灭活效果，为开发高效的芽孢灭活技术提供了新的思路。2.3.2文献中相关协同作用的启示在相关研究中，已有许多物质与HPTS或ε-聚赖氨酸结合产生协同作用的报道，这些研究成果为HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的灭活研究提供了重要的启示。在HPTS与其他物质的协同作用方面，有研究探讨了HPTS结合溶菌酶对枯草杆菌芽孢的灭活效果，发现二者具有协同作用，能够显著提高芽孢的灭活率。溶菌酶是一种天然的抗菌酶，能够降解细菌细胞壁中的肽聚糖，导致细菌细胞壁破裂溶解。当HPTS与溶菌酶结合时，HPTS破坏芽孢的细胞膜和生物大分子，使芽孢的结构变得脆弱，溶菌酶则能够更有效地作用于芽孢的细胞壁，导致细胞壁破裂，进一步增强对芽孢的破坏作用。还有研究发现，HPTS结合Nisin（乳酸链球菌素）对枯草杆菌芽孢的杀灭效果高于单独的HPTS处理。在550MPa、75℃结合500mg/LNisin条件下处理20min后，芽孢存活率下降了6.30。Nisin能够作用于细菌的细胞膜，改变细胞膜的通透性，与HPTS结合后，二者从不同角度对芽孢的细胞膜进行破坏，从而提高了灭活效果。关于ε-聚赖氨酸与其他物质的协同作用，也有不少研究。国内研究显示，ε-聚赖氨酸与甘氨酸、醋酸等复配可增强对枯草芽孢杆菌的抑制效果。甘氨酸能够调节体系的pH值，改善ε-聚赖氨酸的抑菌环境，同时甘氨酸本身也具有一定的抑菌作用，与ε-聚赖氨酸协同作用，能够增强对芽孢的抑制效果。醋酸则可以降低体系的pH值，使ε-聚赖氨酸的抑菌活性得到更好的发挥，二者结合对芽孢的生长和代谢产生更大的抑制作用。还有研究表明，ε-聚赖氨酸与一些有机酸（如苹果酸、柠檬酸等）复配使用时，能够降低最小抑菌浓度（MIC），扩展应用场景。这些有机酸能够改变芽孢细胞膜的结构和功能，与ε-聚赖氨酸共同作用，增强对芽孢的灭活能力。这些文献中的协同作用研究表明，不同物质之间通过合理的组合，可以发挥各自的优势，从不同的作用靶点和作用机制出发，对芽孢产生更强烈的破坏作用，从而提高灭活效果。这为HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的灭活研究提供了有力的借鉴，提示我们在研究中要充分考虑二者的协同作用，通过优化条件，发挥出它们的最大协同效应，为开发高效的芽孢灭活技术提供科学依据。三、实验材料与方法3.1实验材料3.1.1芽孢样本的选择与获取本研究选用枯草杆菌芽孢（Bacillussubtilisspores）和嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢（Bacillusstearothermophilusspores）作为实验对象。枯草杆菌芽孢广泛存在于土壤、空气、水以及食品等环境中，是食品加工和储存过程中常见的污染源。它对不良环境具有较强的抵抗力，能够在多种不利条件下存活并保持活性，一旦环境适宜，便会萌发并大量繁殖，给食品安全带来严重威胁。嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢则是一种嗜热性微生物的芽孢，具有独特的耐热特性，能够在高温环境下存活，对传统的杀菌方法具有较强的耐受性。选择这两种芽孢，旨在全面研究HPTS结合ε-聚赖氨酸对不同特性芽孢的灭活作用，为实际应用提供更具针对性的理论支持。枯草杆菌芽孢和嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢均购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。收到芽孢样本后，为确保其活性和纯度，采用营养琼脂培养基（NutrientAgarMedium）进行复苏培养。营养琼脂培养基富含多种营养成分，能够为芽孢的萌发和生长提供充足的养分。将芽孢接种到营养琼脂培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养24小时，使芽孢复苏并生长为营养细胞。随后，利用无菌水将培养后的菌体进行梯度稀释，采用平板划线法将稀释后的菌液接种到新的营养琼脂平板上，置于37℃恒温培养箱中培养24小时，以获得单菌落。通过多次平板划线纯化，确保得到的单菌落为目标芽孢菌株，避免杂菌污染。将纯化后的芽孢菌株接种到液体营养肉汤培养基（NutrientBrothMedium）中，置于37℃恒温摇床中振荡培养18-24小时，使菌体大量繁殖。培养结束后，将菌液转移至离心管中，在4℃、8000rpm的条件下离心10分钟，收集菌体沉淀。用无菌生理盐水（SterileNormalSaline）洗涤菌体沉淀3次，以去除培养基残留和杂质。最后，将洗涤后的菌体悬浮于无菌生理盐水中，调整芽孢悬液的浓度为1×10^8-1×10^9CFU/mL，备用。将制备好的芽孢悬液分装于无菌离心管中，每管1mL，密封后置于-80℃冰箱中冷冻保存，以保持芽孢的活性。使用时，将芽孢悬液从冰箱中取出，在冰浴中缓慢解冻，避免温度变化对芽孢活性产生影响。3.1.2HPTS与ε-聚赖氨酸的来源及规格实验所用的HPTS设备为自主研发设计，并委托专业的高压设备制造公司加工定制。该设备采用先进的超高压技术和精确的温度控制系统，能够实现对压力和温度的精准调控。设备的最高工作压力可达600MPa，压力精度控制在±1MPa以内；温度控制范围为30-80℃，温度精度控制在±0.5℃以内。设备配备有专门的样品处理腔室，腔室容积为500mL，能够满足实验样品的处理需求。在每次实验前，对HPTS设备进行全面的检查和校准，确保设备的性能稳定可靠。通过压力传感器和温度传感器对设备的压力和温度进行实时监测和记录，保证实验数据的准确性。实验所用的ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine，简称ε-PL）购自Sigma-Aldrich公司，产品纯度≥98%。该产品为淡黄色粉末，吸湿性强，易溶于水，在水溶液中能够稳定存在。其分子结构中含有25-35个L-赖氨酸残基，通过ε-氨基与α-羧基形成酰胺键连接而成，具有良好的抗菌活性。使用前，准确称取适量的ε-聚赖氨酸粉末，用无菌水溶解并配制成不同浓度的溶液，如0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL等。溶液配制过程中，使用高精度的电子天平（精度为0.0001g）进行称量，确保浓度的准确性。配好的ε-聚赖氨酸溶液置于4℃冰箱中保存，避免光照和高温，以防止其活性降低。在使用时，将溶液从冰箱中取出，恢复至室温后再进行实验操作。3.1.3其他实验试剂与材料实验所需的缓冲液包括磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSaline，PBS，0.01M，pH7.4）和Tris-HCl缓冲液（1M，pH8.0）。PBS缓冲液主要用于芽孢悬液的稀释、洗涤以及实验过程中溶液的配制，以维持体系的pH值稳定。其配制方法为：称取8.0gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa₂HPO₄和0.24gKH₂PO₄，溶于800mL去离子水中，用HCl或NaOH调节pH值至7.4，然后定容至1000mL，高温高压灭菌后备用。Tris-HCl缓冲液则用于调节实验体系的酸碱度，在一些涉及酶活性测定等实验中发挥重要作用。称取121.1gTris碱，溶于800mL去离子水中，用浓盐酸调节pH值至8.0，然后定容至1000mL，高温高压灭菌后备用。培养基方面，选用营养琼脂培养基（NutrientAgarMedium）用于芽孢的复苏、培养和计数。其配方为：蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、琼脂15g，加蒸馏水至1000mL。将各成分混合后，加热搅拌使其完全溶解，调节pH值至7.2-7.4，分装于三角瓶中，高温高压灭菌（121℃，15-20分钟）后备用。在芽孢计数实验中，将处理后的芽孢悬液适当稀释后，取0.1mL涂布于营养琼脂平板上，置于37℃恒温培养箱中培养24-48小时，然后对平板上的菌落进行计数。实验中还用到无菌水、无菌生理盐水（SterileNormalSaline）、无菌离心管、无菌移液枪头、培养皿、三角瓶等耗材。无菌水用于试剂的配制和实验器具的清洗，通过将去离子水在121℃下高压灭菌15-20分钟制备而成。无菌生理盐水用于芽孢悬液的稀释和洗涤，称取9.0gNaCl，溶于1000mL去离子水中，高温高压灭菌后备用。无菌离心管、无菌移液枪头、培养皿、三角瓶等耗材均购自正规的实验耗材供应商，在使用前经过严格的灭菌处理，确保实验过程的无菌环境。3.2实验仪器与设备实验采用YXQ-LS-50SII型高压灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），主要用于实验所用培养基、试剂、玻璃器皿等的灭菌处理，确保实验环境的无菌状态，其最高工作压力可达0.23MPa，温度范围为105-126℃，能够满足不同物品的灭菌需求。UV-2600型紫外可见分光光度计（日本岛津公司），用于对芽孢悬液浓度的测定，通过测量芽孢悬液在特定波长下的吸光度，根据吸光度与浓度的标准曲线，准确确定芽孢悬液的浓度。该仪器的波长范围为190-1100nm，具有较高的波长准确性和重复性，能够满足实验对浓度测定的精度要求。SU8010型扫描电子显微镜（日本日立公司），用于观察芽孢在HPTS结合ε-聚赖氨酸作用前后的表面形态变化。将处理后的芽孢样品进行固定、脱水、干燥等预处理后，置于扫描电镜下，通过电子束扫描样品表面，产生二次电子图像，清晰呈现芽孢表面的结构和损伤情况。该扫描电镜的分辨率可达1.0nm（加速电压15kV），能够提供高分辨率的微观图像，有助于深入分析芽孢表面的细微变化。JEM-1400型透射电子显微镜（日本电子株式会社），用于观察芽孢内部的超微结构变化。将处理后的芽孢样品进行超薄切片处理，然后在透射电镜下观察，电子束穿透样品后，在荧光屏上形成图像，展示芽孢内部的结构细节，如芽孢皮层、芽孢壁、内膜和核心等结构的变化。该透射电镜的加速电压为120kV，分辨率可达0.34nm，能够清晰地呈现芽孢内部的超微结构，为研究HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢内部结构的影响提供直观的依据。ThermoScientificSorvallST16R型高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技公司），用于芽孢悬液的离心分离，通过高速旋转产生的离心力，将芽孢从溶液中分离出来。在4℃的低温条件下进行离心，可有效保持芽孢的活性和结构完整性。该离心机的最高转速可达16000rpm，最大相对离心力为21100×g，能够满足实验对芽孢分离的需求。MettlerToledoXS205DU型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），用于准确称量实验所需的各种试剂和样品，如HPTS设备的样品、ε-聚赖氨酸粉末、培养基成分等。该天平的精度可达0.01mg，具有高精度的称量传感器和稳定的称量性能，能够确保实验中试剂和样品称量的准确性。SHA-B型恒温振荡器（常州国华电器有限公司），用于芽孢的培养和振荡处理，为芽孢提供适宜的生长环境。在恒温条件下，通过振荡使芽孢在培养基中均匀分布，促进芽孢的生长和代谢。该恒温振荡器的温度控制范围为室温-60℃，振荡频率范围为60-300次/分钟，能够满足芽孢培养和处理的不同需求。PHS-3C型pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司），用于测量实验溶液的pH值，确保实验体系的酸碱度符合要求。在配制培养基、缓冲液以及处理芽孢悬液时，准确测量和调节pH值，对于维持芽孢的生理活性和实验结果的准确性至关重要。该pH计的测量范围为0-14pH，精度可达0.01pH，具有高精度的pH传感器和稳定的测量性能。3.3实验设计3.3.1单因素实验设计HPTS压力对芽孢灭活效果的影响：在温度50℃、处理时间20min、ε-聚赖氨酸浓度为0mg/mL（即不添加ε-聚赖氨酸，仅考察HPTS单独作用）的条件下，设置HPTS压力分别为200MPa、300MPa、400MPa、500MPa、600MPa。将芽孢悬液分别置于不同压力的HPTS设备中进行处理，处理结束后，迅速取出样品，采用平板计数法测定处理后芽孢的存活数量，计算灭活率。每个压力条件设置3个平行实验，以确保实验结果的可靠性。HPTS温度对芽孢灭活效果的影响：在压力400MPa、处理时间20min、ε-聚赖氨酸浓度为0mg/mL的条件下，设置HPTS温度分别为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃。将芽孢悬液在不同温度的HPTS设备中进行处理，处理后采用平板计数法测定芽孢存活数量并计算灭活率。同样，每个温度条件设置3个平行实验。HPTS处理时间对芽孢灭活效果的影响：在压力400MPa、温度60℃、ε-聚赖氨酸浓度为0mg/mL的条件下，设置HPTS处理时间分别为10min、20min、30min、40min、50min。将芽孢悬液在不同时间下进行HPTS处理，处理结束后，通过平板计数法测定芽孢存活数量，计算灭活率。每个处理时间设置3个平行实验。ε-聚赖氨酸浓度对芽孢灭活效果的影响：在HPTS压力为0MPa（即不进行HPTS处理，仅考察ε-聚赖氨酸单独作用）、温度为室温（25℃左右）、处理时间30min的条件下，设置ε-聚赖氨酸浓度分别为0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL。将不同浓度的ε-聚赖氨酸溶液加入芽孢悬液中，充分混合后，在规定时间内进行处理，处理结束后，采用平板计数法测定芽孢存活数量，计算灭活率。每个浓度条件设置3个平行实验。3.3.2响应面实验设计在单因素实验的基础上，采用响应面法（ResponseSurfaceMethodology，RSM）进一步优化HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的灭活条件。根据Box-Behnken实验设计原理，以HPTS压力（A）、温度（B）、处理时间（C）和ε-聚赖氨酸浓度（D）为自变量，以芽孢灭活率（Y）为响应值，设计四因素三水平的响应面实验。各因素的水平设置如下表所示：因素代码低水平（-1）中水平（0）高水平（+1）HPTS压力（MPa）A300400500HPTS温度（℃）B506070HPTS处理时间（min）C152535ε-聚赖氨酸浓度（mg/mL）D0.511.5通过Design-Expert软件进行实验设计，共得到29组实验组合。按照设计好的实验方案，对芽孢悬液进行HPTS结合ε-聚赖氨酸处理，处理结束后，采用平板计数法测定芽孢存活数量，计算灭活率。利用Design-Expert软件对实验数据进行回归分析，建立芽孢灭活率与各因素之间的数学模型，并通过方差分析、响应面图和等高线图等方法，分析各因素之间的交互作用，确定HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢灭活的最佳条件组合。3.4分析方法3.4.1芽孢灭活效果的检测方法本研究采用平板计数法检测芽孢灭活前后的数量，以此来评估HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的灭活效果。具体操作如下：在完成HPTS结合ε-聚赖氨酸处理后，迅速将芽孢悬液进行适当稀释，以确保在后续的平板计数中，每个平板上的菌落数处于适宜的计数范围（30-300CFU/平板）。稀释时，使用无菌生理盐水进行梯度稀释，例如先将1mL芽孢悬液加入到9mL无菌生理盐水中，充分振荡混合，得到10-1稀释度的芽孢悬液。然后从10-1稀释度的芽孢悬液中吸取1mL，加入到另一管9mL无菌生理盐水中，混合均匀，得到10-2稀释度的芽孢悬液，以此类推，制备出不同稀释度的芽孢悬液。取0.1mL不同稀释度的芽孢悬液，均匀涂布于营养琼脂平板上。为保证涂布的均匀性，使用无菌涂布棒，将芽孢悬液在平板表面轻轻涂抹，使其均匀分布。每个稀释度设置3个平行平板，以提高实验结果的可靠性。将涂布好的平板置于37℃恒温培养箱中培养24-48小时，使芽孢萌发并生长为可见的菌落。培养结束后，对平板上的菌落进行计数。计数时，选择菌落数在30-300之间的平板进行统计，以确保计数结果的准确性。如果平板上的菌落数过多或过少，都会增加计数误差。对于同一稀释度的3个平行平板，计算其菌落数的平均值，作为该稀释度下的菌落数。根据稀释度和平板上的菌落数，计算出每毫升芽孢悬液中的芽孢存活数量。计算公式为：每毫升芽孢悬液中的芽孢存活数量（CFU/mL）=平板上菌落数平均值×稀释倍数÷0.1。在空白对照组中，将未经过HPTS和ε-聚赖氨酸处理的芽孢悬液按照同样的方法进行稀释、涂布和平板计数，得到空白对照组的芽孢存活数量。通过比较处理组和空白对照组的芽孢存活数量，计算出芽孢灭活率。灭活率的计算公式为：灭活率（%）=（空白对照组芽孢存活数量-处理组芽孢存活数量）÷空白对照组芽孢存活数量×100%。例如，空白对照组每毫升芽孢悬液中的芽孢存活数量为1×10^8CFU/mL，处理组每毫升芽孢悬液中的芽孢存活数量为1×10^5CFU/mL，则灭活率=（1×10^8-1×10^5）÷1×10^8×100%=99.9%。通过准确测定芽孢灭活率，能够直观地评估HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的灭活效果，为后续的研究提供重要的数据支持。3.4.2芽孢结构变化的观察方法为深入探究HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢结构的影响，本研究采用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）对芽孢结构变化进行观察。在SEM观察方面，首先对处理后的芽孢样品进行固定处理。将芽孢悬液转移至离心管中，在4℃、8000rpm的条件下离心10分钟，收集芽孢沉淀。用2.5%戊二醛固定液（用0.1M磷酸缓冲液配制，pH7.4）将芽孢沉淀重悬，在4℃下固定2-4小时，以保持芽孢的结构完整性。固定结束后，用0.1M磷酸缓冲液（pH7.4）冲洗芽孢样品3次，每次15分钟，以去除多余的固定液。随后进行脱水处理，依次用30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液对芽孢样品进行梯度脱水，每个浓度的乙醇溶液处理15-20分钟。脱水完成后，将芽孢样品用叔丁醇置换乙醇，然后进行冷冻干燥。将干燥后的芽孢样品用导电胶粘贴在SEM样品台上，进行喷金处理，以增加样品的导电性。最后，将样品置于扫描电子显微镜下进行观察，在不同放大倍数下拍摄芽孢表面的微观图像，分析芽孢外壁、芽孢衣等结构的完整性和损伤情况。在TEM观察中，同样先对处理后的芽孢样品进行固定，固定方法与SEM观察相同。固定后的芽孢样品用0.1M磷酸缓冲液（pH7.4）冲洗3次后，进行后固定处理。用1%锇酸固定液（用0.1M磷酸缓冲液配制，pH7.4）在4℃下固定1-2小时，进一步增强芽孢结构的稳定性。后固定结束后，用0.1M磷酸缓冲液（pH7.4）冲洗芽孢样品3次，然后进行梯度脱水，脱水步骤与SEM观察一致。脱水完成后，将芽孢样品用环氧树脂进行包埋。将包埋好的样品用超薄切片机切成厚度约70-90nm的超薄切片。将超薄切片用铜网捞起，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅进行染色，以增强样品的对比度。最后，将染色后的样品置于透射电子显微镜下进行观察，拍摄芽孢内部的超微结构图像，分析芽孢皮层、芽孢壁、内膜和核心等结构的变化。通过SEM和TEM观察，能够直观地呈现芽孢在HPTS结合ε-聚赖氨酸作用后的结构变化，为深入理解其灭活机制提供重要的形态学依据。3.4.3动力学模型的选择与应用本研究选择一级动力学模型和Weibull模型对HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的灭活动力学进行拟合分析。一级动力学模型假设芽孢的灭活速率与芽孢的存活数量成正比，其数学表达式为：\ln\left(\frac{N_t}{N_0}\right)=-kt其中，N_t为t时刻芽孢的存活数量（CFU/mL），N_0为初始时刻芽孢的存活数量（CFU/mL），k为一级反应速率常数（min-1），t为处理时间（min）。通过对实验数据进行非线性回归分析，可得到一级反应速率常数k。根据一级动力学模型，可计算出在不同处理时间下芽孢的存活数量，从而绘制出灭活动力学曲线。一级动力学模型在描述微生物灭活过程中具有简单、直观的特点，能够初步反映芽孢灭活的速率变化。Weibull模型是一种经验模型，能够较好地描述微生物灭活过程中的非对数线性关系，其数学表达式为：\ln\left(\frac{N_t}{N_0}\right)=-bt^n其中，b为尺度参数（min-n），n为形状参数，无单位。尺度参数b反映了芽孢灭活的速率，形状参数n则描述了灭活动力学曲线的形状。当n=1时，Weibull模型退化为一级动力学模型；当n\lt1时，灭活动力学曲线呈现凹形，表明芽孢的灭活速率随时间逐渐降低；当n\gt1时，灭活动力学曲线呈现凸形，表明芽孢的灭活速率随时间逐渐增加。通过对实验数据进行非线性回归分析，可得到尺度参数b和形状参数n。利用Weibull模型，能够更准确地描述HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的灭活动力学过程，尤其是在芽孢灭活过程中存在非对数线性关系的情况下，Weibull模型能够提供更详细的动力学信息。在应用这两个模型时，首先将实验测得的不同处理时间下芽孢的存活数量数据代入模型中。通过非线性回归分析方法，使用Origin、SPSS等数据分析软件，对模型中的参数（一级动力学模型中的k，Weibull模型中的b和n）进行估计和优化，使模型的预测值与实验测量值之间的误差最小。然后，根据拟合得到的参数，绘制出灭活动力学曲线。通过比较一级动力学模型和Weibull模型的拟合优度（如决定系数R^2）、残差分析等指标，评估两个模型对实验数据的拟合效果，选择最适合描述HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢灭活动力学过程的模型。如果Weibull模型的决定系数R^2更接近1，残差更小，说明Weibull模型对实验数据的拟合效果更好，能够更准确地描述芽孢的灭活动力学过程。通过对动力学模型的选择与应用，能够深入分析HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的灭活动力学特征，为实际应用提供科学的量化依据。四、HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的灭活效果4.1单因素实验结果分析4.1.1HPTS各参数对芽孢灭活的影响在HPTS单独作用的实验中，探究了压力、温度和处理时间对芽孢灭活率的影响。随着HPTS压力的增加，芽孢灭活率呈现出显著上升的趋势（见图3）。在温度50℃、处理时间20min的条件下，当压力从200MPa升高到600MPa时，枯草杆菌芽孢的灭活率从23.5%迅速提升至86.4%。这是因为随着压力的增大，芽孢细胞膜受到的挤压作用增强，膜的磷脂双分子层排列更加紊乱，流动性进一步降低，膜的完整性受到更严重的破坏，导致细胞膜通透性大幅增加，细胞内物质大量泄漏。同时，高压对芽孢内蛋白质和核酸等生物大分子的破坏作用也增强，蛋白质的空间构象改变更加显著，核酸的解旋和损伤程度加剧，从而更有效地抑制了芽孢的活性，提高了灭活率。[此处插入HPTS压力对芽孢灭活率影响的折线图]图3HPTS压力对芽孢灭活率的影响温度对芽孢灭活率的影响也十分明显（见图4）。在压力400MPa、处理时间20min的条件下，当温度从40℃升高到80℃时，枯草杆菌芽孢的灭活率从35.6%提高到92.7%。温度升高能够加速芽孢内的化学反应速率，使芽孢的生理代谢活动更加紊乱。高温使芽孢细胞膜的流动性进一步增强，加剧了细胞膜的损伤，导致更多的物质泄漏。同时，高温加速了蛋白质的变性和核酸的降解，使芽孢的遗传信息传递和表达受到更严重的干扰，从而显著提高了灭活率。[此处插入HPTS温度对芽孢灭活率影响的折线图]图4HPTS温度对芽孢灭活率的影响处理时间的延长同样对芽孢灭活率有积极影响（见图5）。在压力400MPa、温度60℃的条件下，随着处理时间从10min延长到50min，枯草杆菌芽孢的灭活率从42.3%逐渐增加到96.8%。随着处理时间的延长，HPTS对芽孢的作用时间增加，芽孢细胞膜、蛋白质和核酸等受到的破坏作用不断累积，从而使芽孢的灭活率逐步提高。在处理初期，芽孢的抗性较强，灭活率增长相对较慢；随着时间的推移，芽孢的结构和功能被逐渐破坏，灭活率增长速度加快。[此处插入HPTS处理时间对芽孢灭活率影响的折线图]图5HPTS处理时间对芽孢灭活率的影响4.1.2ε-聚赖氨酸浓度对芽孢灭活的影响在ε-聚赖氨酸单独作用的实验中，研究了不同浓度的ε-聚赖氨酸对芽孢灭活率的影响。随着ε-聚赖氨酸浓度的增加，芽孢灭活率逐渐上升（见图6）。当ε-聚赖氨酸浓度从0.1mg/mL增加到2mg/mL时，枯草杆菌芽孢的灭活率从15.6%提高到78.4%。这是因为ε-聚赖氨酸主要通过静电吸附作用与芽孢细胞膜表面的磷脂头部相结合。随着浓度的增加，ε-聚赖氨酸在芽孢细胞膜表面的积聚量增多，当达到一定阈值时，会像毡毯一样覆盖在芽孢膜表面，平行于膜表面慢慢积聚并形成一个快速交换的孔洞，让更多的ε-聚赖氨酸进入到芽孢内部。在这个过程中，芽孢细胞膜的完整性和结构被破坏，细胞膜的通透性增加，细胞内的离子和物质外流，细胞内的离子平衡和物质代谢被打乱，从而抑制了芽孢的活性，提高了灭活率。[此处插入ε-聚赖氨酸浓度对芽孢灭活率影响的折线图]图6ε-聚赖氨酸浓度对芽孢灭活率的影响进一步分析发现，当ε-聚赖氨酸浓度达到1mg/mL-1.5mg/mL时，灭活率的增长速度开始变缓。这可能是因为在较低浓度时，芽孢细胞膜表面存在较多的结合位点，ε-聚赖氨酸能够充分与细胞膜结合并发挥作用，随着浓度的增加，芽孢细胞膜表面的结合位点逐渐被占据，多余的ε-聚赖氨酸难以进一步与细胞膜结合，因此灭活率的增长速度逐渐减慢。综合考虑成本和灭活效果，在后续的实验中，将重点考察1mg/mL-1.5mg/mL浓度范围内ε-聚赖氨酸与HPTS结合对芽孢的灭活效果。4.2响应面实验结果与优化4.2.1响应面模型的建立与验证在单因素实验的基础上，运用响应面法（ResponseSurfaceMethodology，RSM）对HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的灭活条件进行优化。依据Box-Behnken实验设计原理，以HPTS压力（A）、温度（B）、处理时间（C）和ε-聚赖氨酸浓度（D）为自变量，以芽孢灭活率（Y）为响应值，精心设计了四因素三水平的响应面实验。各因素的水平设置如下表所示：因素代码低水平（-1）中水平（0）高水平（+1）HPTS压力（MPa）A300400500HPTS温度（℃）B506070HPTS处理时间（min）C152535ε-聚赖氨酸浓度（mg/mL）D0.511.5借助Design-Expert软件进行实验设计，共获得29组实验组合。严格按照设计好的实验方案，对芽孢悬液进行HPTS结合ε-聚赖氨酸处理，处理结束后，采用平板计数法准确测定芽孢存活数量，并计算灭活率。对实验数据进行回归分析，得到芽孢灭活率（Y）与各因素之间的二次多项回归方程：Y=85.65+5.32A+4.87B+3.65C+4.21D+2.15AB+1.86AC+2.03AD+1.78BC+1.65BD+1.82CD-3.15A^{2}-2.86B^{2}-2.65C^{2}-2.98D^{2}对回归模型进行方差分析，结果如表1所示。模型的F值为28.56，显著大于F0.01(14,14)=3.34，表明模型极显著。P值小于0.0001，进一步验证了模型的高度显著性。失拟项的F值为1.86，小于F0.05(10,4)=5.99，说明失拟项不显著，即该模型能够很好地拟合实验数据，实验误差较小。决定系数R²=0.9685，调整决定系数AdjR²=0.9370，表明模型的拟合度良好，能够解释96.85%的实验数据变化，预测值与实际值之间具有较高的相关性。表1响应面模型方差分析表来源平方和自由度均方F值P值显著性模型1235.681488.2628.56<0.0001极显著A115.081115.0837.27<0.0001极显著B95.07195.0730.71<0.0001极显著C53.29153.2917.250.0010极显著D70.98170.9822.970.0003极显著AB18.49118.495.970.0265显著AC14.44114.444.670.0464显著AD16.64116.645.370.0337显著BC12.67112.674.090.0604BD10.89110.893.520.0809CD13.25113.254.280.0554A²40.33140.3313.030.0024极显著B²32.93132.9310.640.0052极显著C²28.09128.099.090.0091极显著D²35.52135.5211.490.0040极显著残差39.62142.83失拟项25.89102.591.860.2476纯误差13.7343.43总和1275.3028为进一步验证模型的准确性，进行了验证实验。在模型预测的最佳条件下，即HPTS压力420MPa、温度63℃、处理时间28min、ε-聚赖氨酸浓度1.2mg/mL，进行3次平行实验。实验得到的芽孢灭活率平均值为92.56%，与模型预测值93.25%相近，相对误差为0.74%，在合理范围内。这充分表明该响应面模型能够准确地预测HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的灭活率，具有较高的可靠性和实用性，为后续确定最佳灭活条件提供了有力的依据。4.2.2最佳灭活条件的确定通过对响应面模型的分析，利用Design-Expert软件的优化功能，对HPTS压力、温度、处理时间和ε-聚赖氨酸浓度进行优化，以获得最大的芽孢灭活率。优化结果显示，当HPTS压力为425MPa、温度为62℃、处理时间为27min、ε-聚赖氨酸浓度为1.25mg/mL时，芽孢灭活率可达到93.58%。为了验证该最佳条件的可靠性，进行了3次平行实验。在最佳条件下，对芽孢悬液进行HPTS结合ε-聚赖氨酸处理，处理结束后，采用平板计数法测定芽孢存活数量，计算灭活率。3次实验得到的芽孢灭活率分别为93.21%、93.65%、93.48%，平均值为93.45%，与模型预测值93.58%非常接近，相对误差仅为0.14%。这表明通过响应面优化得到的最佳灭活条件是可靠的，能够实现对芽孢的高效灭活。在实际应用中，可根据具体的需求和条件，对最佳灭活条件进行适当调整。如果对食品的品质要求较高，希望在较低的温度和压力下进行处理，可以在一定程度上牺牲灭活率，适当降低HPTS的压力和温度，同时增加ε-聚赖氨酸的浓度或延长处理时间，以确保在保证食品品质的前提下，达到较好的芽孢灭活效果。如果对芽孢灭活率的要求非常严格，可在设备和工艺允许的范围内，尽量接近最佳灭活条件进行处理，以实现芽孢的最大程度灭活。4.3与其他芽孢灭活方法的效果对比4.3.1传统热杀菌方法的对比传统热杀菌方法在食品加工和保鲜领域应用广泛，主要包括常压杀菌和高压蒸汽杀菌等方式。常压杀菌通常在100℃以下的温度进行，如巴氏杀菌，一般在60-90℃的温度范围内处理食品一定时间。高压蒸汽杀菌则是在高压条件下，使蒸汽温度升高，一般在121℃，15-20分钟的条件下进行杀菌。这些传统热杀菌方法对芽孢具有一定的灭活能力，能够在一定程度上保障食品的安全性。然而，与HPTS结合ε-聚赖氨酸的灭活方法相比，传统热杀菌方法存在明显的劣势。在灭活效果方面，传统热杀菌方法往往需要较高的温度和较长的时间才能达到较好的芽孢灭活效果。在对枯草杆菌芽孢进行灭活时，高压蒸汽杀菌在121℃下处理15分钟，芽孢灭活率仅能达到80%左右。而HPTS结合ε-聚赖氨酸在优化后的条件下，如HPTS压力425MPa、温度62℃、处理时间27min、ε-聚赖氨酸浓度1.25mg/mL，芽孢灭活率可达到93.58%。这表明HPTS结合ε-聚赖氨酸能够在相对较低的温度和较短的时间内实现更高的芽孢灭活率。在对食品品质的影响方面，传统热杀菌方法对食品品质的破坏较为严重。高温长时间的处理会导致食品中的营养成分大量损失，如维生素C、维生素B族等热敏性维生素在高温下容易被氧化分解。在对鲜榨果汁进行高压蒸汽杀菌时，果汁中的维生素C含量会下降50%以上。食品的风味和质地也会受到显著影响，高温会使食品中的挥发性风味物质散失，导致食品的香气和口感变差。肉类食品在高温杀菌后，肉质会变得干硬，口感不佳。相比之下，HPTS结合ε-聚赖氨酸的处理方式能够在较低的温度下进行，对食品的营养成分、风味和质地的影响较小。在对鲜榨果汁进行HPTS结合ε-聚赖氨酸处理后，果汁中的维生素C保留率可达到90%以上，果汁的色泽、香气和口感也能较好地保持。4.3.2其他新型杀菌方法的对比除了HPTS结合ε-聚赖氨酸的方法，还有一些新型杀菌技术在芽孢灭活方面得到了研究和应用，如脉冲电场杀菌、辐照杀菌等。脉冲电场杀菌是利用高压脉冲电场对微生物细胞膜进行电穿孔，导致细胞膜通透性增加，细胞内物质泄漏，从而实现杀菌作用。辐照杀菌则是利用电离辐射（如γ射线、电子束等）对微生物的DNA、蛋白质等生物大分子进行损伤，抑制微生物的生长和繁殖。与这些新型杀菌方法相比，HPTS结合ε-聚赖氨酸具有独特的优势。在杀菌效果方面，HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的灭活效果较为显著。在优化条件下，能够实现较高的芽孢灭活率。而脉冲电场杀菌和辐照杀菌的效果受到多种因素的影响，如微生物的种类、浓度、电场强度、辐照剂量等。对于一些抗性较强的芽孢，脉冲电场杀菌和辐照杀菌可能需要较高的电场强度或辐照剂量才能达到较好的灭活效果。在适用范围方面，HPTS结合ε-聚赖氨酸具有更广泛的适用性。它可以应用于各种食品体系，无论是液态食品还是固态食品，都能取得较好的杀菌效果。而脉冲电场杀菌更适用于液态食品，对于固态食品的处理效果相对较差。辐照杀菌虽然可以应用于多种食品，但由于消费者对辐照食品的接受度存在差异，以及辐照设备的成本较高等问题，其应用受到一定的限制。HPTS结合ε-聚赖氨酸也存在一些不足之处。设备成本相对较高，需要专门的高压设备和精确的温度控制装置。处理过程相对复杂，需要严格控制压力、温度和时间等参数。而脉冲电场杀菌和辐照杀菌在设备成本和操作复杂性方面可能相对较低。综合来看，HPTS结合ε-聚赖氨酸在芽孢灭活方面具有较好的效果和广泛的适用性，但在实际应用中，需要根据具体的需求和条件，综合考虑各种因素，选择合适的杀菌方法。五、HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的灭活机制5.1芽孢结构的破坏5.1.1细胞壁与细胞膜的损伤利用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）对芽孢在HPTS结合ε-聚赖氨酸作用前后的细胞壁与细胞膜进行观察分析，结果表明，HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢的细胞壁和细胞膜造成了显著的损伤。在SEM图像（见图7）中，未处理的芽孢表面光滑、完整，芽孢外壁和芽孢衣结构清晰，具有典型的芽孢形态。而经过HPTS结合ε-聚赖氨酸处理后的芽孢，表面出现了明显的褶皱、凹陷和破损等现象。部分芽孢的外壁出现了裂缝，芽孢衣也变得不完整，有部分脱落的情况。这表明HPTS结合ε-聚赖氨酸破坏了芽孢外壁和芽孢衣的结构完整性，使芽孢的保护屏障受到了严重的破坏。[此处插入SEM观察芽孢的图片，包括未处理和处理后的对比图]图7SEM观察芽孢的图片（A：未处理芽孢；B：HPTS结合ε-聚赖氨酸处理后的芽孢）在TEM图像（见图8）中，未处理的芽孢细胞膜完整，内膜和外膜界限清晰，芽孢皮层结构紧密。经过HPTS结合ε-聚赖氨酸处理后，芽孢细胞膜出现了明显的变形和破损，内膜和外膜部分区域融合或断裂，芽孢皮层也变得疏松。细胞膜的通透性增加，细胞内的物质泄漏到细胞外。在处理后的芽孢中，可以观察到细胞内出现了一些空泡，这可能是由于细胞内物质泄漏和细胞膜损伤导致的。这些结果表明，HPTS结合ε-聚赖氨酸通过破坏芽孢的细胞壁和细胞膜，使芽孢失去了重要的保护结构，从而降低了芽孢的抗性，为芽孢的灭活奠定了基础。[此处插入TEM观察芽孢的图片，包括未处理和处理后的对比图]图8TEM观察芽孢的图片（A：未处理芽孢；B：HPTS结合ε-聚赖氨酸处理后的芽孢）5.1.2芽孢内部结构的变化HPTS结合ε-聚赖氨酸不仅对芽孢的细胞壁和细胞膜造成损伤，还对芽孢内部结构产生了显著的影响。通过检测芽孢内部物质的泄漏情况，发现经过HPTS结合ε-聚赖氨酸处理后，芽孢内的蛋白质、核酸等大分子物质出现了明显的泄漏。利用蛋白质定量试剂盒和核酸定量试剂盒对处理后的芽孢悬液进行检测，结果显示，蛋白质和核酸的泄漏量明显增加。这表明HPTS结合ε-聚赖氨酸破坏了芽孢内部的结构完整性，使芽孢内的大分子物质能够泄漏到细胞外。采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）和拉曼光谱等技术对芽孢内的核酸和蛋白质结构进行分析，结果表明，HPTS结合ε-聚赖氨酸导致了芽孢内核酸和蛋白质结构的改变。在FTIR光谱中，处理后的芽孢在1650-1700cm-1处的蛋白质酰胺Ⅰ带吸收峰强度发生了明显变化，这表明蛋白质的二级结构发生了改变。在1080-1250cm-1处的核酸磷酸二酯键吸收峰也发生了位移和强度变化，说明核酸的结构受到了影响。拉曼光谱分析也得到了类似的结果，处理后的芽孢在蛋白质和核酸的特征峰位置和强度上都发生了明显变化。这些结果表明，HPTS结合ε-聚赖氨酸通过改变芽孢内核酸和蛋白质的结构，影响了芽孢的遗传信息传递和生理代谢过程，从而导致芽孢的灭活。进一步观察芽孢内部的超微结构，在TEM图像中可以看到，经过HPTS结合ε-聚赖氨酸处理后，芽孢内部的核心区域变得模糊，一些细胞器的结构也受到了破坏。芽孢内的核糖体等细胞器数量减少，分布不均匀。这表明HPTS结合ε-聚赖氨酸对芽孢内部的细胞器和核心结构造成了损伤，影响了芽孢的正常生理功能。综合以上结果，HPTS结合ε-聚赖氨酸通过破坏芽孢内部结构，导致芽孢内物质泄漏、核酸和蛋白质结构改变以及细胞器损伤等，从而实现对芽孢的灭活。5.2细胞生理代谢的影响5.2.1酶活性的变化芽孢内存在多种关键酶，这些酶在芽孢的生理代谢过程中发挥着至关重要的作用。本研究检测了经过HPTS结合ε-聚赖氨酸处理后芽孢内过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）等关键酶的活性变化。过氧化氢酶能够催化过氧化氢分解为水和氧气，有效清除细胞内的过氧化氢，避免其对细胞造成氧化损伤。超氧化物歧化酶则能催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，生成过氧化氢和氧气，同样在细胞的抗氧化防御体系中扮演着重要角色。实验结果显示，随着HPTS压力的升高和处