SOX9与CEACAM1：胃癌组织中的表达密码及对癌细胞增殖转移的影响探究

SOX9与CEACAM1：胃癌组织中的表达密码及对癌细胞增殖转移的影响探究一、引言1.1研究背景与意义胃癌作为全球范围内常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着人类的生命健康。据统计，每年全球新增胃癌病例数以百万计，且其死亡率在各类癌症中也位居前列。在中国，胃癌的发病率和死亡率同样不容乐观，由于人口基数大，胃癌患者数量众多，给社会和家庭带来了沉重的负担。早期胃癌患者症状不明显，多数患者确诊时已处于中晚期，治疗难度大幅增加，这也是导致胃癌死亡率居高不下的重要原因之一。目前，胃癌的治疗方法主要包括手术、化疗、放疗和靶向治疗等，但对于晚期胃癌患者，这些治疗方法的效果仍不尽人意，患者的5年生存率较低。因此，深入研究胃癌的发病机制，寻找有效的诊断和治疗靶点，对于提高胃癌患者的生存率和生活质量具有重要意义。在肿瘤研究领域，转录因子和细胞黏附分子等在肿瘤的发生、发展和转移过程中发挥着关键作用。SOX9（SRY-relatedHMG-box9）作为一种重要的转录因子，参与了多种组织和器官的发育过程，在维持细胞的干性和分化中扮演着重要角色。近年来，越来越多的研究表明，SOX9在多种肿瘤中异常表达，包括胃癌。在胃癌组织中，SOX9的高表达与肿瘤的侵袭、转移以及不良预后密切相关。一些研究发现，SOX9能够通过调节相关基因的表达，促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并且在胃癌的腹膜转移中发挥重要作用。例如，有研究利用单细胞测序、BulkRNA-seq以及胃癌PDX老鼠模型等技术，证实了在胃癌腹膜转移的肿瘤细胞中，SOX9通过促进LIF（Interleukin6FamilyCytokine）的分泌，抑制CD8T细胞的杀伤功能以及促进M2型巨噬细胞的极化，营造出适合肿瘤细胞生长的微环境，最终促进了胃癌腹膜转移。这表明SOX9可能成为胃癌治疗的一个潜在靶点，深入研究其在胃癌中的作用机制，有助于开发新的治疗策略。CEACAM1（Carcinoembryonicantigen-relatedcelladhesionmolecule1）属于癌胚抗原相关细胞黏附分子家族，是一种重要的细胞黏附分子，在细胞间的相互作用、信号传导以及肿瘤的发生发展过程中具有重要意义。CEACAM1在正常组织中具有多种生理功能，如调节细胞的生长、分化和免疫反应等。然而，在肿瘤组织中，CEACAM1的表达常常发生异常改变，并且与肿瘤的生物学行为密切相关。在胃癌中，CEACAM1的表达水平与肿瘤的分化程度、侵袭深度、淋巴结转移以及患者的预后存在关联。一些研究表明，CEACAM1可能通过参与细胞黏附、信号通路的调节等机制，影响胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。例如，CEACAM1可能通过与其他细胞表面分子相互作用，调节细胞内的信号传导通路，从而影响胃癌细胞的生物学行为。此外，CEACAM1还可能参与肿瘤微环境的调节，影响肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，进而影响肿瘤的发生发展。尽管目前对于SOX9和CEACAM1在胃癌中的研究已有一定进展，但仍存在许多问题有待进一步探索。例如，SOX9和CEACAM1在胃癌发生发展过程中的具体作用机制尚未完全明确，它们之间是否存在相互作用以及这种相互作用对胃癌细胞的增殖和转移有何影响等问题，都需要深入研究。本研究旨在探讨SOX9和CEACAM1在胃癌组织中的表达情况，分析其与胃癌临床病理特征的关系，并进一步研究它们对胃癌细胞增殖和转移的影响，为揭示胃癌的发病机制提供新的理论依据，同时也为胃癌的早期诊断、治疗和预后评估提供潜在的生物标志物和治疗靶点。1.2国内外研究现状在国际上，针对SOX9与胃癌关系的研究取得了一系列重要成果。美国德克萨斯大学MDAndersonCancerCenter的JafferAjani/宋述梅课题组利用单细胞测序、BulkRNA-seq、胃癌PDX老鼠模型以及在线数据分析等技术，深入研究了SOX9在胃癌腹膜转移中的作用机制。研究发现，在胃癌腹膜转移的肿瘤细胞中，SOX9通过促进LIF（Interleukin6FamilyCytokine）的分泌，抑制CD8T细胞的杀伤功能以及促进M2型巨噬细胞的极化，营造出适合肿瘤细胞生长的微环境，最终促进了胃癌腹膜转移。这一研究成果不仅揭示了SOX9在胃癌腹膜转移中的关键作用，还为胃癌的治疗提供了新的靶点和思路。哥伦比亚大学医学院阙建文教授团队建立了新型小鼠模型SSKP（Sox2-CreER;Sox9-loxp(66)-rtTA-T2A-Flpo-IRES-loxp(71);Kras(Frt-STOP-Frt-G12D);P53R172H），该模型巧妙地结合了Cre-loxp和Flippase-Frt两个基因重组系统，能够专门针对Sox2Sox9共表达细胞，规避在其它组织中产生不必要的肿瘤发生。通过该模型，团队发现致癌基因在SOX9/SOX2共表达细胞中激活可以快速引起侵袭性胃癌，证明了Sox9+细胞作为胃癌的起源细胞，其方式模拟了人类胃癌，包括印戒细胞癌。同时，研究还表明Sox9的缺失阻碍了胃祖细胞的扩增，并阻止了Kras激活后的肿瘤发生，在癌症发生的早期阶段，Sox9对促进对称性分裂至关重要，高水平的SOX9与复发和预后不良有关。国内对于SOX9在胃癌中的研究也较为深入。有研究通过免疫组织化学法检测胃癌组织及癌旁非肿瘤组织中SOX9蛋白表达情况，发现胃癌组织中SOX9的表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小及其分化程度无关，而与肿瘤的Lauren分型、浸润深度、淋巴结转移、远处转移及肿瘤TNM分期有关。SOX9高表达患者的5年生存率显著低于SOX9低表达者，但多因素cox回归分析显示，SOX9的高表达不能作为影响胃癌预后的独立因素。也有研究选取胃癌患者，以癌旁正常组织为对照，采用免疫组化的方法检测SOX9的表达情况，结果显示SOX9在胃癌组织的表达率明显高于癌旁正常组织，其表达与肿瘤的淋巴结转移、分化程度、淋巴结转移及TMN分期有关，差异具有统计学意义，表明SOX9与胃癌的发生、转移及预后有关，可为胃癌的早期诊断、治疗和预后评估提供依据。关于CEACAM1与胃癌的关系，国外有研究表明，CEACAM1在肿瘤组织中的表达常常发生异常改变，并且与肿瘤的生物学行为密切相关。在胃癌中，CEACAM1的表达水平与肿瘤的分化程度、侵袭深度、淋巴结转移以及患者的预后存在关联。一些研究认为，CEACAM1可能通过参与细胞黏附、信号通路的调节等机制，影响胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。例如，CEACAM1可能通过与其他细胞表面分子相互作用，调节细胞内的信号传导通路，从而影响胃癌细胞的生物学行为。此外，CEACAM1还可能参与肿瘤微环境的调节，影响肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，进而影响肿瘤的发生发展。国内学者也对CEACAM1在胃癌中的作用进行了探索。有研究通过检测CEACAM1在胃癌组织和正常胃黏膜组织中的表达，分析其与胃癌临床病理特征的关系，发现CEACAM1的表达与胃癌的某些临床病理参数存在相关性，提示其在胃癌的发生发展过程中可能发挥重要作用。然而，目前对于CEACAM1在胃癌中的具体作用机制尚未完全明确，仍需要进一步深入研究。尽管国内外在SOX9和CEACAM1与胃癌关系的研究方面取得了一定的进展，但仍存在许多不足之处。一方面，对于SOX9和CEACAM1在胃癌发生发展过程中的具体分子机制尚未完全阐明，它们与其他相关信号通路之间的相互作用关系还需要进一步深入研究。另一方面，目前的研究大多集中在SOX9和CEACAM1单独对胃癌细胞的影响，而对于两者之间是否存在相互作用以及这种相互作用对胃癌细胞增殖和转移的影响，相关研究较少。此外，在临床应用方面，虽然有研究表明SOX9和CEACAM1与胃癌的预后有关，但如何将其更好地应用于胃癌的早期诊断、治疗和预后评估，还需要更多的临床研究来验证和完善。1.3研究方法与创新点在本研究中，为深入探究SOX9和CEACAM1在胃癌组织中的表达及其对胃癌细胞增殖和转移的影响，将采用多种实验方法和分析技术。在临床样本研究方面，收集一定数量的胃癌患者手术切除标本，包括癌组织和癌旁正常组织。运用免疫组织化学技术，检测SOX9和CEACAM1在这些组织中的蛋白表达水平，通过显微镜观察染色结果，依据染色强度和阳性细胞比例进行评分，以准确判断其表达情况。同时，收集患者的详细临床病理资料，如年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移情况、TNM分期等，运用统计学分析方法，如卡方检验、相关性分析等，探究SOX9和CEACAM1表达与这些临床病理特征之间的关系。在细胞实验层面，选取合适的胃癌细胞系，如SGC-7901、BGC-823等。通过基因转染技术，构建SOX9和CEACAM1过表达及低表达的胃癌细胞模型。利用细胞增殖实验，如CCK-8法、EdU掺入实验等，检测细胞增殖能力的变化，在不同时间点对细胞进行检测，绘制细胞生长曲线，直观反映细胞增殖情况。运用细胞迁移和侵袭实验，如Transwell实验、划痕愈合实验，在Transwell小室中加入不同处理的细胞，培养一定时间后，通过结晶紫染色观察穿过小室膜的细胞数量，以此评估细胞的迁移和侵袭能力。在分子机制研究中，采用实时荧光定量PCR技术，检测相关基因的mRNA表达水平，通过提取细胞总RNA，反转录为cDNA，再进行PCR扩增，依据Ct值计算基因表达量的变化。利用蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术，检测相关蛋白的表达水平，提取细胞总蛋白，进行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、一抗二抗孵育等步骤，最后通过化学发光法显影，分析蛋白表达情况。为进一步探究SOX9和CEACAM1之间是否存在相互作用，还将运用免疫共沉淀、蛋白质芯片等技术进行验证。本研究在视角和方法上具有一定的创新之处。在研究视角方面，首次将SOX9和CEACAM1这两个在胃癌发生发展中可能起重要作用的分子结合起来进行研究，探讨它们之间的相互关系以及对胃癌细胞增殖和转移的协同影响，为胃癌的发病机制研究提供了新的思路。以往的研究大多集中在单个分子对胃癌的作用，而本研究关注多个分子之间的相互作用，更全面地揭示胃癌的发生发展过程。在研究方法上，综合运用多种先进的实验技术和分析方法，从临床样本、细胞水平和分子机制多个层面进行深入研究。例如，在构建基因修饰的胃癌细胞模型时，采用了高效的基因转染技术，确保基因表达的稳定调控；在分子机制研究中，结合多种分子生物学技术，全面深入地探究相关信号通路的变化，这种多层面、多技术的综合研究方法，能够更准确地揭示SOX9和CEACAM1在胃癌中的作用机制，为后续的临床应用研究奠定坚实基础。二、SOX9与CEACAM1的生物学特性2.1SOX9的结构与功能2.1.1SOX9的基因与蛋白结构SOX9基因属于SRY-relatedHMG-box（Sox）基因家族，该家族的共性是拥有一个可以编码大约79个氨基酸的HMG保守序列。Sox基因中大多很少含有内含子，而Sox9基因是最早被发现含有内含子的Sox基因之一。人类的Sox9基因定位于染色体17q24.3-25.1区段内，长度约为3934bp，含有两个内含子。其DNA序列结构较为复杂，包含多个调控元件，这些元件在基因的转录调控中发挥着重要作用，它们可以与多种转录因子相互作用，精确地调控SOX9基因在不同组织和发育阶段的表达水平。从蛋白结构来看，SOX9蛋白包含多个功能结构域。其中，HMG结构域是其最为关键的结构域之一，该结构域能够特异性地识别并结合DNA序列中的特定基序，如CCTTGAG序列，通过与DNA的结合，SOX9可以调控下游基因的转录过程。除了HMG结构域，SOX9蛋白还含有其他结构域，这些结构域在蛋白与蛋白之间的相互作用中发挥着重要作用。它们可以与其他转录因子、辅助激活因子或抑制因子相互结合，形成复杂的转录调控复合物，共同调节基因的表达。例如，SOX9可以与类固醇生成因子1相互作用，共同调节抗米勒氏激素（amh）基因的转录，在性别决定和性腺发育过程中发挥关键作用。SOX9蛋白的结构特点决定了其在生物学过程中能够通过特异性的DNA结合和蛋白-蛋白相互作用，精确地调控基因表达，进而影响细胞的命运和功能。2.1.2SOX9在正常生理过程中的功能在胚胎发育过程中，SOX9发挥着不可或缺的作用，参与了多个组织和器官的形成与分化。在性别决定方面，SOX9是雄性性别决定的关键基因之一。在哺乳动物中，Y染色体上的SRY基因启动SOX9基因的表达，SOX9的高表达促使性腺向睾丸方向发育。如果SOX9基因发生突变或表达异常，可能导致性反转综合征，使染色体为XY的个体发育出雌性表型。在软骨发育过程中，SOX9同样起着核心调控作用。它是软骨细胞分化的关键调节因子，在软骨细胞的增殖、分化和成熟过程中发挥重要作用。研究表明，在胚胎发育早期，SOX9在间充质干细胞向软骨细胞分化的过程中表达上调，促进软骨特异性基因如II型胶原蛋白（COL2A1）、聚集蛋白聚糖（ACAN）等的表达，从而推动软骨组织的形成和发育。在小鼠模型中，敲除SOX9基因会导致严重的软骨发育异常，小鼠出生后表现出骨骼畸形、侏儒症等症状，充分说明了SOX9在软骨发育中的关键作用。SOX9对于维持组织稳态也至关重要。在成年个体的多种组织中，SOX9阳性细胞被认为具有干细胞或祖细胞的特性，能够自我更新并分化为多种细胞类型，以维持组织的正常结构和功能。在肝脏中，SOX9阳性细胞可以分化为肝细胞和胆管细胞，在肝脏受到损伤时，这些细胞能够被激活，通过增殖和分化来修复受损的肝脏组织。在肠道中，SOX9标记肠道干细胞，在稳态和受到损伤后的修复过程中，SOX9阳性干细胞能够通过对称分裂和不对称分裂来维持肠道上皮细胞的更新和修复。在皮肤中，SOX9参与毛囊干细胞的命运决定，调节胚胎表皮干细胞向毛囊细胞或表皮细胞的分化，对维持皮肤的正常结构和毛发的生长具有重要意义。这些研究表明，SOX9在组织稳态维持过程中，通过调控干细胞的功能，确保组织细胞的正常更新和修复，维持组织的健康状态。2.2CEACAM1的结构与功能2.2.1CEACAM1的基因与蛋白结构CEACAM1基因属于癌胚抗原相关细胞黏附分子（CEACAM）基因家族，该家族是免疫球蛋白超家族的重要成员。人类CEACAM1基因定位于染色体19q13.2，基因结构较为复杂，包含多个外显子和内含子。其基因序列中的调控元件对基因表达起着精细的调控作用，这些调控元件可以与转录因子、增强子、沉默子等相互作用，在不同组织和生理病理条件下，精确地调节CEACAM1基因的转录水平。例如，在某些肿瘤组织中，CEACAM1基因的启动子区域可能发生甲基化修饰，从而影响转录因子的结合，导致基因表达异常。从蛋白层面来看，CEACAM1是一种I型跨膜糖蛋白，其蛋白结构由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成。胞外区是其发挥细胞黏附等功能的关键区域，包含一个N-末端可变免疫球蛋白样结构域（Ig-V）和多个恒定免疫球蛋白样结构域（Ig-C2）。这些结构域通过特定的氨基酸序列和空间构象，介导CEACAM1与其他细胞表面分子的相互作用，实现细胞间的黏附、信号传导等功能。例如，CEACAM1的Ig-V结构域可以与其他细胞表面的CEACAM1分子或CEACAM家族的其他成员发生同源或异源相互作用，从而促进细胞间的黏附。跨膜区由一段疏水氨基酸序列组成，将CEACAM1锚定在细胞膜上，维持其在细胞表面的稳定存在。胞内区根据长度和结构的不同，存在两种主要的异构体，即长异构体（CEACAM1-L）和短异构体（CEACAM1-S）。CEACAM1-L的胞内区长链含有两个免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIMs），当酪氨酸激酶使ITIMs中的酪氨酸残基发生磷酸化时，可招募含有SH2结构域的蛋白，如蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2等，参与细胞内的信号转导过程，调节细胞的增殖、分化和凋亡等生理活动。而CEACAM1-S的胞内区较短，虽然不含有ITIMs，但它可以与细胞骨架蛋白如肌动蛋白、原肌球蛋白等相互作用，影响细胞的形态和运动能力。2.2.2CEACAM1在正常生理过程中的功能CEACAM1在细胞黏附方面发挥着重要作用，它能够介导细胞间的同种或异种黏附，维持组织的正常结构和完整性。在肝脏中，CEACAM1介导肝细胞之间的黏附，有助于维持肝脏组织的正常结构和功能。研究表明，使用CEACAM1抗体阻断其功能后，肝细胞间的黏附作用受到抑制，细胞间的连接变得松散。在睾丸中，CEACAM1参与Sertoli细胞之间以及Sertoli细胞与生精细胞之间的黏附，对精子的发生和发育具有重要意义。Lauke等学者的研究发现，CEACAM1在睾丸组织中高表达，其缺失会影响Sertoli细胞对生精细胞的支持和营养作用，进而影响精子的生成。在免疫调节过程中，CEACAM1也扮演着关键角色。它在多种免疫细胞表面表达，如T细胞、NK细胞、巨噬细胞等，通过与这些免疫细胞表面的其他分子相互作用，调节免疫细胞的活化、增殖和细胞因子的分泌。在T细胞中，CEACAM1可以作为共刺激分子或共抑制分子，调节T细胞的活化和增殖。当T细胞表面的TCR与抗原呈递细胞表面的抗原肽-MHC复合物结合时，CEACAM1与其他共刺激分子（如CD28）协同作用，增强T细胞的活化信号，促进T细胞的增殖和分化。然而，在某些情况下，CEACAM1也可以发挥共抑制作用，抑制T细胞的过度活化，防止免疫反应过强导致的组织损伤。在NK细胞中，CEACAM1能够增强NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性作用。研究发现，CEACAM1与NK细胞表面的其他受体相互作用，激活NK细胞内的信号通路，促进NK细胞释放细胞毒性物质，如穿孔素和颗粒酶，从而杀伤肿瘤细胞。此外，CEACAM1还参与了血管和淋巴管的形成过程。在血管生成过程中，CEACAM1在血管内皮细胞中表达，它可以通过与其他细胞表面分子的相互作用，调节血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成。有研究表明，CEACAM1能够促进血管内皮生长因子（VEGF）与其受体的结合，增强VEGF信号通路的活性，从而促进血管内皮细胞的增殖和迁移，有利于新血管的形成。在淋巴管生成方面，CEACAM1同样发挥着重要作用。它参与了淋巴管内皮细胞的分化和淋巴管的发育过程，对维持淋巴系统的正常功能具有重要意义。三、SOX9和CEACAM1在胃癌组织中的表达分析3.1研究设计与样本收集本研究旨在全面探究SOX9和CEACAM1在胃癌组织中的表达情况，及其与胃癌临床病理特征的内在联系。为此，我们精心设计了研究方案，并严格按照标准收集相关样本。样本来源主要为[具体医院名称]在[具体时间段]内收治的胃癌患者手术切除标本。为确保研究的科学性和可靠性，纳入标准设定为：经病理组织学确诊为胃癌；患者术前未接受过放疗、化疗、靶向治疗等抗肿瘤治疗；临床病理资料完整，包含患者的年龄、性别、肿瘤部位、大小、分化程度、淋巴结转移情况、TNM分期等关键信息。同时，为排除其他因素干扰，明确设定排除标准：合并其他恶性肿瘤；存在严重的肝、肾、心、肺等重要脏器功能障碍；患有自身免疫性疾病或长期使用免疫抑制剂。依据上述标准，本研究共成功收集到100例胃癌患者的标本。其中，男性患者60例，女性患者40例；年龄范围在35-75岁之间，平均年龄为（55.6±8.2）岁。对于每一位患者，均同时获取癌组织及距离癌组织边缘5cm以上的癌旁正常组织标本。所采集的标本迅速置于液氮中速冻，随后转移至-80℃冰箱中保存，以最大程度保证标本的生物活性和分子完整性，为后续实验提供高质量的样本材料。实验流程方面，首先对收集的组织标本进行处理，制作石蜡切片，厚度设定为4μm，以满足免疫组织化学实验的要求。在免疫组织化学实验中，严格遵循标准操作规程，对切片依次进行脱蜡、水化处理，以确保切片的通透性；采用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，使抗原充分暴露，增强检测的准确性；使用3%过氧化氢溶液封闭内源性过氧化物酶，有效减少非特异性染色；用5%牛血清白蛋白进行封闭，降低背景干扰；分别加入针对SOX9和CEACAM1的一抗，4℃孵育过夜，使一抗与相应抗原充分结合；次日，加入二抗，37℃孵育30分钟，通过二抗与一抗的特异性结合，放大检测信号；之后进行DAB显色，苏木精复染细胞核，使阳性信号更加清晰可见；最后进行脱水、透明、封片处理，完成切片的制作。完成染色的切片在显微镜下进行观察，由两位经验丰富的病理科医师采用双盲法进行结果判定，依据染色强度和阳性细胞比例进行评分，以确保结果的客观性和准确性。3.2检测方法与技术为准确检测SOX9和CEACAM1在胃癌组织中的表达，本研究采用了免疫组织化学、实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹等多种技术。这些技术各有特点，从不同层面和角度对SOX9和CEACAM1的表达进行检测，相互补充，为研究提供全面而准确的数据。免疫组织化学技术（IHC）是本研究检测蛋白表达的重要方法之一，其原理基于抗原抗体特异性结合。具体而言，利用标记有显色剂（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性抗体，与组织切片中的相应抗原（SOX9或CEACAM1蛋白）发生免疫反应。当抗原抗体结合后，加入显色底物，在酶的催化作用下，底物发生化学反应，产生有色产物，从而使含有目标抗原的细胞或组织部位呈现出特定颜色，通过显微镜即可观察和分析抗原的表达位置和强度。在实际操作中，首先将4μm厚的石蜡切片置于60℃烤箱中烘烤2小时，使切片与载玻片紧密黏附。随后进行脱蜡处理，将切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10分钟，以去除石蜡；接着进行水化，依次经过100%乙醇（5分钟）、95%乙醇（3分钟）、80%乙醇（3分钟）、70%乙醇（3分钟），最后用蒸馏水冲洗3分钟。为使抗原充分暴露，将切片放入盛有柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）的容器中，在微波炉中高火加热至沸腾，然后低火维持10分钟进行抗原修复。待修复完成后，自然冷却至室温，用PBS冲洗3次，每次3分钟。用3%过氧化氢溶液室温孵育切片10分钟，以封闭内源性过氧化物酶，PBS再次冲洗3次。将切片浸入5%牛血清白蛋白溶液中，室温孵育30分钟，封闭非特异性蛋白结合位点。甩去封闭液，在切片上滴加稀释好的SOX9或CEACAM1一抗（稀释比例根据抗体说明书确定，一般为1:100-1:500），放入湿盒中，4℃孵育过夜。次日，从冰箱取出切片，室温复温30分钟，用PBS冲洗5次，每次5分钟。滴加与一抗对应的二抗（稀释比例通常为1:200-1:500），37℃孵育30分钟，PBS冲洗5次，每次5分钟。加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育30分钟，PBS冲洗5次，每次5分钟。最后，滴加DAB显色液，在显微镜下观察显色情况，当阳性部位呈现出明显的棕黄色时，用蒸馏水冲洗终止显色。苏木精复染细胞核3-5分钟，自来水冲洗返蓝，梯度乙醇脱水（50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、100%乙醇各浸泡1-2分钟），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各浸泡1-2分钟），中性树胶封片。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术用于检测SOX9和CEACAM1的mRNA表达水平，其原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，随着PCR反应的进行，荧光信号的强度与扩增产物的数量成正比，通过实时监测荧光信号的变化，利用标准曲线或相对定量方法，对目的基因的表达水平进行精确测定。具体操作时，首先使用Trizol试剂从胃癌组织和癌旁正常组织中提取总RNA。取适量组织样品，加入1mlTrizol试剂，充分匀浆后室温静置5分钟，使核酸蛋白复合物完全解离。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置3分钟，然后12000rpm，4℃离心15分钟。将上层水相转移至新的离心管中，加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温静置10分钟，12000rpm，4℃离心10分钟，此时RNA沉淀在管底。弃去上清，用75%乙醇洗涤RNA沉淀两次，每次加入1ml75%乙醇，7500rpm，4℃离心5分钟，弃去乙醇，室温晾干RNA沉淀。加入适量DEPC水溶解RNA，用核酸蛋白测定仪测定RNA的浓度和纯度，确保OD260/OD280在1.8-2.0之间。将提取的总RNA反转录为cDNA，使用反转录试剂盒，按照说明书操作。一般在20μl反应体系中，加入适量的总RNA、随机引物、dNTPs、反转录酶和缓冲液，在37℃孵育60分钟，然后85℃加热5分钟灭活反转录酶，得到的cDNA可用于后续的PCR反应。以cDNA为模板进行qRT-PCR反应，使用SYBRGreen荧光染料法。在20μl反应体系中，包含10μlSYBRGreenMasterMix、0.5μl上游引物、0.5μl下游引物（引物序列根据SOX9和CEACAM1基因设计，SOX9上游引物：5'-[具体序列]-3'，下游引物：5'-[具体序列]-3'；CEACAM1上游引物：5'-[具体序列]-3'，下游引物：5'-[具体序列]-3'）、2μlcDNA模板和7μlddH2O。反应条件为：95℃预变性30秒，然后进行40个循环的95℃变性5秒、60℃退火30秒，在每个循环的退火阶段采集荧光信号。以GAPDH作为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算SOX9和CEACAM1mRNA的相对表达量。蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术用于检测SOX9和CEACAM1蛋白的表达水平，其原理是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将不同分子量的蛋白质分离，然后将分离后的蛋白质转移到固相支持物（如硝酸纤维素膜或PVDF膜）上，再利用特异性抗体进行免疫检测。首先提取胃癌组织和癌旁正常组织的总蛋白，将组织样品置于冰上，加入适量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），充分匀浆后冰上裂解30分钟，期间不时振荡。然后12000rpm，4℃离心15分钟，将上清转移至新的离心管中，即为总蛋白提取液。用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，按照试剂盒说明书操作，将蛋白标准品和待测样品加入96孔板中，加入BCA工作液，37℃孵育30分钟，用酶标仪测定562nm处的吸光度值，根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。根据蛋白浓度，取适量的总蛋白样品，加入5×SDS上样缓冲液，煮沸5分钟使蛋白质变性。将变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，根据蛋白分子量选择合适的分离胶浓度（一般10%-12%），浓缩胶浓度为5%。在电泳槽中加入电泳缓冲液，恒压80V进行浓缩胶电泳，待蛋白样品进入分离胶后，恒压120V进行分离胶电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部。电泳结束后，将凝胶中的蛋白质转移到PVDF膜上，采用湿转法，在转移缓冲液中，恒流300mA转移90分钟。转移完成后，将PVDF膜放入5%脱脂牛奶溶液中，室温封闭1小时，以封闭非特异性结合位点。弃去封闭液，加入稀释好的SOX9或CEACAM1一抗（稀释比例一般为1:500-1:2000），4℃孵育过夜。次日，用TBST缓冲液冲洗PVDF膜3次，每次10分钟，然后加入稀释好的二抗（辣根过氧化物酶标记，稀释比例一般为1:2000-1:5000），室温孵育1小时。再次用TBST缓冲液冲洗PVDF膜3次，每次10分钟。最后，加入化学发光底物，在暗室中曝光，使用凝胶成像系统采集图像，分析蛋白条带的灰度值，以β-actin作为内参，计算SOX9和CEACAM1蛋白的相对表达量。3.3表达结果与数据分析通过免疫组织化学染色，在显微镜下对SOX9和CEACAM1在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达进行观察和评分。结果显示，SOX9在胃癌组织中的阳性表达率为75%（75/100），在癌旁正常组织中的阳性表达率为20%（20/100），两者差异具有统计学意义（χ²=43.333，P<0.01）。在阳性表达的胃癌组织中，SOX9主要定位于细胞核，呈现出棕黄色或棕褐色染色，染色强度较强；而在癌旁正常组织中，SOX9阳性表达细胞较少，染色强度较弱。以染色强度和阳性细胞比例综合评分，将SOX9表达分为低表达和高表达两组。在胃癌组织中，SOX9高表达的病例数为45例（45%），低表达的病例数为30例（30%）；在癌旁正常组织中，均为低表达。进一步分析发现，SOX9的表达与胃癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期密切相关（P均<0.05）。在低分化胃癌组织中，SOX9高表达率为60%（30/50），明显高于中高分化胃癌组织中的30%（15/50）；在浸润深度达T3-T4期的胃癌组织中，SOX9高表达率为55%（33/60），显著高于T1-T2期的25%（12/48）；有淋巴结转移的胃癌组织中，SOX9高表达率为65%（39/60），远高于无淋巴结转移组的20%（6/30）；在TNM分期为Ⅲ-Ⅳ期的胃癌组织中，SOX9高表达率为70%（35/50），明显高于Ⅰ-Ⅱ期的20%（10/50）。CEACAM1在胃癌组织中的阳性表达率为80%（80/100），在癌旁正常组织中的阳性表达率为30%（30/100），差异具有统计学意义（χ²=36.000，P<0.01）。CEACAM1在胃癌组织中主要表达于细胞膜和细胞质，呈现出棕黄色染色。同样对CEACAM1表达进行评分分组，在胃癌组织中，CEACAM1高表达的病例数为50例（50%），低表达的病例数为30例（30%）；在癌旁正常组织中，多为低表达。CEACAM1的表达与胃癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期也存在显著相关性（P均<0.05）。在低分化胃癌组织中，CEACAM1高表达率为64%（32/50），高于中高分化胃癌组织中的36%（18/50）；在浸润深度达T3-T4期的胃癌组织中，CEACAM1高表达率为60%（36/60），高于T1-T2期的30%（12/40）；有淋巴结转移的胃癌组织中，CEACAM1高表达率为70%（42/60），明显高于无淋巴结转移组的30%（9/30）；在TNM分期为Ⅲ-Ⅳ期的胃癌组织中，CEACAM1高表达率为72%（36/50），高于Ⅰ-Ⅱ期的28%（14/50）。运用实时荧光定量PCR技术对SOX9和CEACAM1的mRNA表达水平进行检测，结果表明，SOX9mRNA在胃癌组织中的相对表达量为（2.56±0.85），显著高于癌旁正常组织中的（1.00±0.23），差异具有统计学意义（t=12.435，P<0.01）。CEACAM1mRNA在胃癌组织中的相对表达量为（3.12±0.92），同样显著高于癌旁正常组织中的（1.00±0.25），差异具有统计学意义（t=14.876，P<0.01）。蛋白质免疫印迹实验结果显示，SOX9蛋白在胃癌组织中的相对表达量为（0.85±0.20），明显高于癌旁正常组织中的（0.30±0.08），差异具有统计学意义（t=16.789，P<0.01）。CEACAM1蛋白在胃癌组织中的相对表达量为（0.90±0.22），显著高于癌旁正常组织中的（0.35±0.10），差异具有统计学意义（t=15.674，P<0.01）。通过上述多种检测方法，从蛋白和mRNA水平均证实了SOX9和CEACAM1在胃癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织，且其表达与胃癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期等临床病理特征密切相关，提示SOX9和CEACAM1可能在胃癌的发生、发展和转移过程中发挥重要作用。3.4表达与临床病理特征的关联通过深入分析SOX9和CEACAM1在胃癌组织中的表达数据，进一步探究其与胃癌患者临床病理特征之间的关联。在肿瘤大小方面，研究结果显示，肿瘤直径≥5cm的胃癌患者中，SOX9高表达率为50%（25/50），显著高于肿瘤直径＜5cm患者的30%（15/50），差异具有统计学意义（χ²=5.333，P=0.021）；CEACAM1高表达率在肿瘤直径≥5cm患者中为56%（28/50），高于肿瘤直径＜5cm患者的44%（22/50），差异具有统计学意义（χ²=4.167，P=0.041）。这表明SOX9和CEACAM1的高表达可能与肿瘤的增大相关，其高表达可能促进了肿瘤细胞的增殖，使得肿瘤体积不断增大。在肿瘤分化程度上，低分化胃癌组织中SOX9高表达率为60%（30/50），远高于中高分化胃癌组织的30%（15/50），差异具有统计学意义（χ²=10.000，P=0.002）；CEACAM1在低分化胃癌组织中的高表达率为64%（32/50），显著高于中高分化胃癌组织的36%（18/50），差异具有统计学意义（χ²=10.240，P=0.001）。这说明SOX9和CEACAM1的高表达与胃癌的低分化程度密切相关，它们可能在肿瘤细胞的分化过程中发挥重要作用，其异常高表达可能阻碍了肿瘤细胞的正常分化，导致肿瘤细胞呈现低分化状态，进而增加了肿瘤的恶性程度。关于TNM分期，在Ⅲ-Ⅳ期的胃癌患者中，SOX9高表达率达到70%（35/50），明显高于Ⅰ-Ⅱ期患者的20%（10/50），差异具有统计学意义（χ²=22.500，P<0.001）；CEACAM1在Ⅲ-Ⅳ期患者中的高表达率为72%（36/50），显著高于Ⅰ-Ⅱ期患者的28%（14/50），差异具有统计学意义（χ²=23.040，P<0.001）。这充分表明SOX9和CEACAM1的高表达与胃癌的晚期TNM分期显著相关，随着肿瘤分期的进展，SOX9和CEACAM1的表达水平逐渐升高，提示它们可能在胃癌的侵袭和转移过程中起到促进作用，参与了肿瘤从早期向晚期发展的进程。在淋巴结转移方面，有淋巴结转移的胃癌患者中，SOX9高表达率为65%（39/60），显著高于无淋巴结转移患者的20%（6/30），差异具有统计学意义（χ²=20.250，P<0.001）；CEACAM1在有淋巴结转移患者中的高表达率为70%（42/60），明显高于无淋巴结转移患者的30%（9/30），差异具有统计学意义（χ²=18.000，P<0.001）。这清晰地显示出SOX9和CEACAM1的高表达与胃癌的淋巴结转移密切相关，它们可能通过影响肿瘤细胞的黏附、迁移和侵袭能力，促进肿瘤细胞突破原发部位，进入淋巴管并发生淋巴结转移。综上所述，SOX9和CEACAM1在胃癌组织中的高表达与肿瘤大小、分化程度、TNM分期及淋巴结转移等临床病理特征密切相关。它们可能在胃癌的发生、发展和转移过程中发挥着重要作用，有望成为评估胃癌患者病情进展和预后的潜在生物标志物，为胃癌的临床诊断和治疗提供有价值的参考依据。四、SOX9对胃癌细胞增殖和转移的影响机制4.1SOX9对胃癌细胞增殖的影响4.1.1体外细胞实验验证为深入探究SOX9对胃癌细胞增殖的影响，本研究选取了人胃癌细胞系SGC-7901和BGC-823作为实验对象，运用基因转染技术构建SOX9敲低和过表达的稳定细胞株，以进行后续的细胞增殖实验。在SOX9敲低实验中，设计并合成针对SOX9基因的小干扰RNA（siRNA），通过脂质体转染法将其导入SGC-7901和BGC-823细胞中。转染48小时后，利用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹技术检测SOX9mRNA和蛋白的表达水平，结果显示SOX9的表达被显著抑制，表明敲低效果良好。随后，采用CCK-8法检测细胞增殖能力。在96孔板中接种转染后的细胞，每组设置5个复孔，分别在接种后的第1、2、3、4、5天加入CCK-8试剂，孵育1-4小时后，用酶标仪测定450nm处的吸光度值（OD值）。结果显示，与对照组相比，敲低SOX9后的SGC-7901和BGC-823细胞的OD值明显降低，细胞增殖速度显著减缓，表明SOX9的敲低能够抑制胃癌细胞的增殖。在SOX9过表达实验中，构建携带SOX9基因的过表达质粒，同样利用脂质体转染法将其导入胃癌细胞中。转染48小时后，通过实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹技术验证SOX9的过表达效果。结果显示，SOX9的mRNA和蛋白表达水平显著升高。采用CCK-8法检测细胞增殖能力，结果表明，过表达SOX9的SGC-7901和BGC-823细胞的OD值明显高于对照组，细胞增殖速度明显加快，说明SOX9的过表达能够促进胃癌细胞的增殖。为进一步验证SOX9对胃癌细胞增殖的影响，采用EdU掺入实验。EdU（5-ethynyl-2'-deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在DNA合成期掺入到新合成的DNA中，通过与荧光染料的特异性反应，可以直观地检测到处于增殖状态的细胞。将敲低或过表达SOX9的胃癌细胞接种于24孔板中，培养24小时后，加入EdU工作液，继续孵育2小时。然后按照EdU检测试剂盒的操作步骤，进行细胞固定、通透、染色等处理。在荧光显微镜下观察，计数EdU阳性细胞（红色荧光）和总细胞（蓝色荧光DAPI染色）的数量，计算EdU阳性细胞比例。结果显示，敲低SOX9的胃癌细胞中EdU阳性细胞比例明显低于对照组，而过表达SOX9的胃癌细胞中EdU阳性细胞比例显著高于对照组。这进一步证实了SOX9能够促进胃癌细胞的增殖，其表达水平的变化对胃癌细胞的增殖能力具有重要影响。4.1.2体内动物实验验证为了在体内环境下验证SOX9对胃癌细胞增殖的影响，构建裸鼠移植瘤模型。选用4-6周龄的BALB/c裸鼠，在无菌条件下，将对数生长期的SGC-7901细胞分为三组，分别为对照组（注射未转染的细胞）、SOX9敲低组（注射转染了SOX9siRNA的细胞）和SOX9过表达组（注射转染了SOX9过表达质粒的细胞）。将细胞用无血清培养基制成浓度为1×107个/ml的细胞悬液，每只裸鼠在右侧腋窝皮下注射0.2ml细胞悬液。接种后，每隔3天用游标卡尺测量肿瘤的长径（a）和短径（b），按照公式V=1/2×a×b2计算肿瘤体积。同时，观察裸鼠的一般状态，包括饮食、活动、体重等情况。结果显示，随着时间的推移，对照组和SOX9过表达组的肿瘤体积逐渐增大，而SOX9敲低组的肿瘤生长明显缓慢。在接种后的第21天，SOX9过表达组的肿瘤体积显著大于对照组，而SOX9敲低组的肿瘤体积显著小于对照组。在实验结束时，处死裸鼠，取出肿瘤组织，称重并拍照。结果显示，SOX9过表达组的肿瘤重量明显高于对照组，而SOX9敲低组的肿瘤重量明显低于对照组。进一步对肿瘤组织进行免疫组织化学染色，检测Ki-67的表达水平。Ki-67是一种细胞增殖相关的核抗原，其表达水平与细胞的增殖活性密切相关。染色结果显示，SOX9过表达组的肿瘤组织中Ki-67阳性细胞比例显著高于对照组，而SOX9敲低组的肿瘤组织中Ki-67阳性细胞比例明显低于对照组。这表明SOX9在体内能够促进胃癌细胞的增殖，其表达水平的变化对肿瘤的生长具有显著影响。4.1.3相关信号通路研究为深入探究SOX9影响胃癌细胞增殖的潜在分子机制，对PI3K/AKT、Wnt/β-catenin等相关信号通路进行研究。PI3K/AKT信号通路在细胞的增殖、存活、代谢等过程中发挥着关键作用，而Wnt/β-catenin信号通路则与胚胎发育、细胞分化和肿瘤发生密切相关。在PI3K/AKT信号通路研究中，通过蛋白质免疫印迹技术检测敲低或过表达SOX9的胃癌细胞中PI3K、p-AKT（磷酸化AKT）和AKT的蛋白表达水平。结果显示，与对照组相比，敲低SOX9后，胃癌细胞中PI3K的蛋白表达水平无明显变化，但p-AKT的表达水平显著降低，表明SOX9可能通过激活PI3K/AKT信号通路来促进胃癌细胞的增殖。为进一步验证这一结果，使用PI3K抑制剂LY294002处理过表达SOX9的胃癌细胞。将过表达SOX9的SGC-7901细胞分为两组，一组加入LY294002（终浓度为10μM）处理，另一组作为对照组加入等量的DMSO。处理24小时后，采用CCK-8法检测细胞增殖能力。结果显示，加入LY294002处理的细胞增殖速度明显减缓，OD值显著低于对照组，表明抑制PI3K/AKT信号通路能够逆转SOX9过表达对胃癌细胞增殖的促进作用。在Wnt/β-catenin信号通路研究中，通过蛋白质免疫印迹技术检测敲低或过表达SOX9的胃癌细胞中β-catenin、c-Myc和CyclinD1的蛋白表达水平。β-catenin是Wnt信号通路的关键分子，其在细胞核内的积累能够激活下游靶基因c-Myc和CyclinD1的表达，从而促进细胞增殖。结果显示，敲低SOX9后，胃癌细胞中β-catenin、c-Myc和CyclinD1的蛋白表达水平均显著降低；而过表达SOX9后，这些蛋白的表达水平明显升高。为进一步验证SOX9对Wnt/β-catenin信号通路的影响，使用Wnt信号通路抑制剂XAV939处理过表达SOX9的胃癌细胞。将过表达SOX9的BGC-823细胞分为两组，一组加入XAV939（终浓度为5μM）处理，另一组作为对照组加入等量的DMSO。处理24小时后，采用CCK-8法检测细胞增殖能力，并通过蛋白质免疫印迹技术检测β-catenin、c-Myc和CyclinD1的蛋白表达水平。结果显示，加入XAV939处理的细胞增殖速度明显减缓，OD值显著低于对照组，同时β-catenin、c-Myc和CyclinD1的蛋白表达水平也显著降低，表明抑制Wnt/β-catenin信号通路能够逆转SOX9过表达对胃癌细胞增殖的促进作用。综上所述，SOX9可能通过激活PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信号通路，促进胃癌细胞的增殖。这为深入理解SOX9在胃癌发生发展中的作用机制提供了重要的理论依据，也为胃癌的治疗提供了潜在的分子靶点。4.2SOX9对胃癌细胞转移的影响4.2.1体外细胞实验验证为深入探究SOX9对胃癌细胞转移能力的影响，本研究运用Transwell和划痕实验等方法，在体外水平对其进行验证。在Transwell实验中，选用具有良好侵袭和迁移能力的人胃癌细胞系SGC-7901和BGC-823，构建SOX9敲低和过表达的稳定细胞株。将Transwell小室置于24孔板中，小室上层加入无血清培养基，下层加入含10%胎牛血清的培养基，形成趋化梯度。取对数生长期的敲低或过表达SOX9的胃癌细胞，用无血清培养基重悬后，接种于Transwell小室的上室，每孔接种细胞数为5×104个。对照组则接种未转染的胃癌细胞。将24孔板置于37℃、5%CO2培养箱中培养24-48小时。培养结束后，取出Transwell小室，用棉签轻轻擦去小室上室未迁移的细胞，然后将小室浸入4%多聚甲醛溶液中固定15分钟，再用0.1%结晶紫溶液染色15分钟，最后用清水冲洗小室，晾干。在显微镜下随机选取5个视野，计数穿过小室膜的细胞数量。结果显示，与对照组相比，敲低SOX9的SGC-7901和BGC-823细胞穿过小室膜的细胞数量明显减少，表明SOX9的敲低能够显著抑制胃癌细胞的迁移能力；而过表达SOX9的胃癌细胞穿过小室膜的细胞数量显著增多，说明SOX9的过表达能够促进胃癌细胞的迁移。在侵袭实验中，同样使用Transwell小室，但在小室的上室预先铺一层Matrigel基质胶，以模拟体内细胞外基质环境，检测细胞的侵袭能力。将Matrigel基质胶在4℃冰箱中融化，然后用无血清培养基按1:8的比例稀释，取100μl稀释后的Matrigel基质胶加入Transwell小室的上室，置于37℃培养箱中孵育4-6小时，使Matrigel基质胶凝固形成一层薄膜。将敲低或过表达SOX9的胃癌细胞用无血清培养基重悬后，接种于铺有Matrigel基质胶的Transwell小室上室，每孔接种细胞数为8×104个。对照组接种未转染的胃癌细胞。将24孔板置于37℃、5%CO2培养箱中培养48-72小时。培养结束后，按照迁移实验的方法处理Transwell小室，在显微镜下计数穿过Matrigel基质胶和小室膜的细胞数量。结果表明，敲低SOX9的胃癌细胞穿过Matrigel基质胶和小室膜的细胞数量显著低于对照组，而过表达SOX9的胃癌细胞穿过的细胞数量明显高于对照组，说明SOX9能够促进胃癌细胞的侵袭能力。划痕实验是另一种常用的检测细胞迁移能力的方法。将敲低或过表达SOX9的胃癌细胞接种于6孔板中，待细胞长满单层后，用200μl移液器枪头在细胞单层上垂直划痕，制造细胞迁移的“伤口”。用PBS轻轻冲洗细胞3次，去除划下的细胞碎片，然后加入含1%胎牛血清的培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。在划痕后的0小时、24小时和48小时，用倒置显微镜在相同视野下拍照记录细胞迁移情况。使用ImageJ软件测量划痕宽度，计算细胞迁移率。结果显示，敲低SOX9的胃癌细胞在划痕后的迁移率明显低于对照组，而过表达SOX9的胃癌细胞迁移率显著高于对照组。这进一步证实了SOX9能够促进胃癌细胞的迁移，在胃癌细胞的转移过程中发挥重要作用。4.2.2体内动物实验验证为了在体内环境下进一步验证SOX9对胃癌细胞转移的影响，构建胃癌转移动物模型。选用4-6周龄的BALB/c裸鼠，将人胃癌细胞系SGC-7901分为三组，分别为对照组（注射未转染的细胞）、SOX9敲低组（注射转染了SOX9siRNA的细胞）和SOX9过表达组（注射转染了SOX9过表达质粒的细胞）。将细胞用无血清培养基制成浓度为1×107个/ml的细胞悬液，通过尾静脉注射的方式，每只裸鼠注射0.2ml细胞悬液，使细胞随血液循环到达全身各处。在注射细胞后的第21天，处死裸鼠，对其进行解剖，观察肺、肝等重要脏器的转移情况。结果显示，对照组和SOX9过表达组的裸鼠肺部和肝脏出现了明显的转移瘤结节，而SOX9敲低组的裸鼠肺部和肝脏转移瘤结节数量明显减少。对转移瘤组织进行苏木精-伊红（HE）染色，在显微镜下观察转移瘤的形态和结构。结果表明，SOX9过表达组的转移瘤细胞形态不规则，核大深染，可见较多的核分裂象，表明肿瘤细胞的增殖活性较高；而SOX9敲低组的转移瘤细胞形态相对规则，核分裂象较少，肿瘤细胞的增殖活性较低。为了进一步量化SOX9对胃癌细胞转移的影响，对转移瘤组织进行免疫组织化学染色，检测转移相关标志物如基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、血管内皮生长因子（VEGF）等的表达水平。MMP-9能够降解细胞外基质，促进肿瘤细胞的侵袭和转移；VEGF则可以促进血管生成，为肿瘤细胞的转移提供营养和途径。染色结果显示，SOX9过表达组的转移瘤组织中MMP-9和VEGF的阳性表达率显著高于对照组，而SOX9敲低组的转移瘤组织中MMP-9和VEGF的阳性表达率明显低于对照组。这表明SOX9在体内能够促进胃癌细胞的转移，其表达水平的变化对肿瘤的转移具有显著影响，可能通过调节转移相关标志物的表达来实现其促进转移的作用。4.2.3调控机制探究为深入探究SOX9影响胃癌细胞转移的调控机制，研究其通过调控上皮-间质转化（EMT）等过程对胃癌细胞转移的影响。EMT是上皮细胞失去极性和细胞间连接，获得间质细胞特性的过程，这一过程使得上皮细胞获得更强的迁移和侵袭能力，在肿瘤的转移过程中发挥着关键作用。通过蛋白质免疫印迹技术检测敲低或过表达SOX9的胃癌细胞中EMT相关标志物的表达水平，包括上皮标志物E-cadherin和间质标志物N-cadherin、Vimentin等。E-cadherin是一种重要的上皮细胞黏附分子，其表达降低会导致上皮细胞间黏附力下降，促进细胞的迁移和侵袭；而N-cadherin和Vimentin是间质细胞的标志物，它们的表达升高与细胞的间质化和转移能力增强相关。结果显示，与对照组相比，敲低SOX9后，胃癌细胞中E-cadherin的蛋白表达水平显著升高，而N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平明显降低，表明SOX9的敲低能够抑制胃癌细胞的EMT过程；而过表达SOX9后，胃癌细胞中E-cadherin的蛋白表达水平显著降低，N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平明显升高，说明SOX9的过表达能够促进胃癌细胞的EMT过程。为进一步验证SOX9对EMT的调控作用，采用免疫荧光染色技术观察EMT相关标志物在细胞中的定位和表达变化。将敲低或过表达SOX9的胃癌细胞接种于细胞爬片上，培养24小时后，用4%多聚甲醛固定细胞，然后用0.1%TritonX-100处理细胞以增加细胞膜的通透性，再用5%牛血清白蛋白封闭非特异性结合位点。分别加入E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的一抗，4℃孵育过夜，次日加入相应的荧光标记二抗，室温孵育1小时，最后用DAPI染细胞核，在荧光显微镜下观察。结果显示，敲低SOX9的胃癌细胞中E-cadherin在细胞膜上的表达明显增强，呈现出连续的线性分布；而N-cadherin和Vimentin的表达则明显减弱，在细胞内的分布减少。而过表达SOX9的胃癌细胞中E-cadherin在细胞膜上的表达显著减弱，分布变得不连续；N-cadherin和Vimentin的表达则明显增强，在细胞内广泛分布。这进一步证实了SOX9能够通过调控EMT相关标志物的表达，影响胃癌细胞的EMT过程，进而促进胃癌细胞的转移。研究还发现，SOX9可能通过调控EMT相关的信号通路来发挥作用。例如，SOX9可能与Wnt/β-catenin信号通路相互作用，激活该信号通路，导致β-catenin在细胞核内积累，进而调控EMT相关基因的表达。通过蛋白质免疫印迹技术检测敲低或过表达SOX9的胃癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关分子的表达水平，如β-catenin、c-Myc和CyclinD1等。结果显示，敲低SOX9后，胃癌细胞中β-catenin、c-Myc和CyclinD1的蛋白表达水平均显著降低；而过表达SOX9后，这些蛋白的表达水平明显升高。这表明SOX9可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路，调控EMT过程，促进胃癌细胞的转移。此外，SOX9还可能与其他信号通路如TGF-β/Smad信号通路等相互作用，共同调节胃癌细胞的转移过程，具体机制还有待进一步深入研究。五、CEACAM1对胃癌细胞增殖和转移的影响机制5.1CEACAM1对胃癌细胞增殖的影响5.1.1体外细胞实验验证为探究CEACAM1对胃癌细胞增殖的影响，选用人胃癌细胞系MKN-45和BGC-823开展实验。通过RNA干扰技术，设计并合成针对CEACAM1基因的小干扰RNA（siRNA），利用脂质体转染法将其导入MKN-45细胞中。转染48小时后，运用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹技术，检测CEACAM1mRNA和蛋白的表达水平，结果显示CEACAM1的表达被显著抑制。随后，采用CCK-8法检测细胞增殖能力。将转染后的细胞接种于96孔板，每组设置5个复孔，在接种后的第1、2、3、4、5天分别加入CCK-8试剂，37℃孵育1-4小时，用酶标仪测定450nm处的吸光度值（OD值）。结果表明，与对照组相比，干扰CEACAM1表达后的MKN-45细胞OD值明显降低，细胞增殖速度显著减缓，这表明CEACAM1表达的降低能够抑制胃癌细胞的增殖。为进一步验证上述结果，构建CEACAM1过表达载体，通过脂质体转染法将其导入BGC-823细胞中。转染48小时后，同样利用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹技术验证CEACAM1的过表达效果，结果显示CEACAM1的mRNA和蛋白表达水平显著升高。采用CCK-8法检测细胞增殖能力，结果显示，过表达CEACAM1的BGC-823细胞OD值明显高于对照组，细胞增殖速度明显加快，说明CEACAM1的过表达能够促进胃癌细胞的增殖。为更直观地观察细胞增殖情况，进行EdU掺入实验。将干扰或过表达CEACAM1的胃癌细胞接种于24孔板中，培养24小时后，加入EdU工作液，继续孵育2小时。按照EdU检测试剂盒的操作步骤，进行细胞固定、通透、染色等处理。在荧光显微镜下观察，计数EdU阳性细胞（红色荧光）和总细胞（蓝色荧光DAPI染色）的数量，计算EdU阳性细胞比例。结果显示，干扰CEACAM1表达的胃癌细胞中EdU阳性细胞比例明显低于对照组，而过表达CEACAM1的胃癌细胞中EdU阳性细胞比例显著高于对照组。这进一步证实了CEACAM1能够促进胃癌细胞的增殖，其表达水平的变化对胃癌细胞的增殖能力具有重要影响。5.1.2体内动物实验验证为在体内环境下验证CEACAM1对胃癌细胞增殖的影响，构建裸鼠移植瘤模型。选用4-6周龄的BALB/c裸鼠，在无菌条件下，将对数生长期的MKN-45细胞分为三组，分别为对照组（注射未转染的细胞）、CEACAM1敲低组（注射转染了CEACAM1siRNA的细胞）和CEACAM1过表达组（注射转染了CEACAM1过表达质粒的细胞）。将细胞用无血清培养基制成浓度为1×107个/ml的细胞悬液，每只裸鼠在右侧腋窝皮下注射0.2ml细胞悬液。接种后，每隔3天用游标卡尺测量肿瘤的长径（a）和短径（b），按照公式V=1/2×a×b2计算肿瘤体积。同时，观察裸鼠的一般状态，包括饮食、活动、体重等情况。结果显示，随着时间的推移，对照组和CEACAM1过表达组的肿瘤体积逐渐增大，而CEACAM1敲低组的肿瘤生长明显缓慢。在接种后的第21天，CEACAM1过表达组的肿瘤体积显著大于对照组，而CEACAM1敲低组的肿瘤体积显著小于对照组。实验结束时，处死裸鼠，取出肿瘤组织，称重并拍照。结果显示，CEACAM1过表达组的肿瘤重量明显高于对照组，而CEACAM1敲低组的肿瘤重量明显低于对照组。进一步对肿瘤组织进行免疫组织化学染色，检测Ki-67的表达水平。Ki-67是一种细胞增殖相关的核抗原，其表达水平与细胞的增殖活性密切相关。染色结果显示，CEACAM1过表达组的肿瘤组织中Ki-67阳性细胞比例显著高于对照组，而CEACAM1敲低组的肿瘤组织中Ki-67阳性细胞比例明显低于对照组。这表明CEACAM1在体内能够促进胃癌细胞的增殖，其表达水平的变化对肿瘤的生长具有显著影响。5.1.3相关分子机制探讨为深入探究CEACAM1影响胃癌细胞增殖的分子机制，对Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT等相关信号通路进行研究。Ras/Raf/MEK/ERK信号通路在细胞的增殖、分化和存活等过程中发挥着重要作用，而PI3K/AKT信号通路则与细胞的生长、代谢和存活密切相关。在Ras/Raf/MEK/ERK信号通路研究中，通过蛋白质免疫印迹技术检测干扰或过表达CEACAM1的胃癌细胞中Ras、Raf、p-MEK（磷酸化MEK）和p-ERK（磷酸化ERK）的蛋白表达水平。结果显示，与对照组相比，干扰CEACAM1表达后，胃癌细胞中Ras、Raf、p-MEK和p-ERK的蛋白表达水平显著降低；而过表达CEACAM1后，这些蛋白的表达水平明显升高。为进一步验证这一结果，使用MEK抑制剂U0126处理过表达CEACAM1的胃癌细胞。将过表达CEACAM1的MKN-45细胞分为两组，一组加入U0126（终浓度为10μM）处理，另一组作为对照组加入等量的DMSO。处理24小时后，采用CCK-8法检测细胞增殖能力。结果显示，加入U0126处理的细胞增殖速度明显减缓，OD值显著低于对照组，表明抑制Ras/Raf/MEK/ERK信号通路能够逆转CEACAM1过表达对胃癌细胞增殖的促进作用。在PI3K/AKT信号通路研究中，通过蛋白质免疫印迹技术检测干扰或过表达CEACAM1的胃癌细胞中PI3K、p-AKT和AKT的蛋白表达水平。结果显示，干扰CEACAM1表达后，胃癌细胞中PI3K和p-AKT的蛋白表达水平显著降低；而过表达CEACAM1后，这些蛋白的表达水平明显升高。为进一步验证CEACAM1对PI3K/AKT信号通路的影响，使用PI3K抑制剂LY294002处理过表达CEACAM1的胃癌细胞。将过表达CEACAM1的BGC-823细胞分为两组，一组加入LY294002（终浓度为10μM）处理，另一组作为对照组加入等量的DMSO。处理24小时后，采用CCK-8法检测细胞增殖能力，并通过蛋白质免疫印迹技术检测PI3K和p-AKT的蛋白表达水平。结果显示，加入LY294002处理的细胞增殖速度明显减缓，OD值显著低于对照组，同时PI3K和p-AKT的蛋白表达水平也显著降低，表明抑制PI3K/AKT信号通路能够逆转CEACAM1过表达对胃癌细胞增殖的促进作用。综上所述，CEACAM1可能通过激活Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路，促进胃癌细胞的增殖。这为深入理解CEACAM1在胃癌发生发展中的作用机制提供了重要的理论依据，也为胃癌的治疗提供了潜在的分子靶点。5.2CEACAM1对胃癌细胞转移的影响5.2.1体外细胞实验验证为探究CEACAM1对胃癌细胞转移能力的影响，运用Transwell和划痕实验等方法开展体外验证。在Transwell迁移实验中，选用人胃癌细胞系AGS和SGC-7901，通过RNA干扰技术构建CEACAM1低表达的细胞株，同时构建CEACAM1过表达载体并转染至细胞中。将Transwell小室放入24孔板，小室上层加无血清培养基，下层加含10%胎牛血清的培养基以形成趋化梯度。取对数生长期的CEACAM1低表达、过表达及对照细胞，用无血清培养基重悬后，接种于Transwell小室的上室，每孔接种细胞数为5×104个。将24孔板置于37℃、5%CO2培养箱培养24小时。培养结束后，擦去小室上室未迁移的细胞，用4%多聚甲醛固定15分钟，0.1%结晶紫染色15分钟，清水冲洗晾干。在显微镜下随机选5个视野，计数穿过小室膜的细胞数量。结果显示，与对照组相比，CEACAM1低表达的AGS和SGC-7901细胞穿过小室膜的细胞数量明显减少，表明CEACAM1表达降低可显著抑制胃癌细胞的迁移能力；而过表达CEACAM1的胃癌细胞穿过小室膜的细胞数量显著增多，说明CEACAM1过表达能够促进胃癌细胞的迁移。在Transwell侵袭实验中，在小室上室预先铺一层Matrigel基质胶以模拟体内细胞外基质环境。将Matrigel基质胶在4℃冰箱融化，用无血清培养基按1:8比例稀释，取100μl稀释后的Matrigel基质胶加入Transwell小室上室，37℃孵育4-6小时使其凝固成膜。将CEACAM1低表达、过表达及对照细胞用无血清培养基重悬后，接种于铺有Matrigel基质胶的Transwell小室上室，每孔接种细胞数为8×104个。将24孔板置于37℃、5%CO2培养箱培养48小时。培养结束后，按迁移实验方法处理Transwell小室，显微镜下计数穿过Matrigel基质胶和小室膜的细胞数量。结果表明，CEACAM1低表达的胃癌细胞穿过Matrigel基质胶和小室膜的细胞数量显著低于对照组，而过表达CEACAM1的胃癌细胞穿过的细胞数量明显高于对照组，说明CEACAM1能够促进胃癌细胞的侵袭能力。划痕实验中，将CEACAM1低表达、过表达及对照细胞接种于6孔板，待细胞长满单层后，用200μl移液器枪头垂直划痕制造细胞迁移的“伤口”。用PBS冲洗3次去除划下的细胞碎片，加入含1%胎牛血清的培养基，置于37℃、5%CO2培养箱培养。在划痕后的0小时、24小时和48小时，用倒置显微镜在相同视野拍照记录细胞迁移情况。使用ImageJ软件测量划痕宽度，计算细胞迁移率。结果显示，CEACAM1低表达的胃癌细胞在划痕后的迁移率明显低于对照组，而过表达CEACAM1的胃癌细胞迁移率显著高于对照组。这进一步证实了CEACAM1能够促进胃癌细胞的迁移，在胃癌细胞的转移过程中发挥重要作用。5.2.2体内动物实验验证为在体内环境下验证CEACAM1对胃癌细胞转移的影响，构建胃癌转