3.2.1基因工程的基本操作程序（第1课时）课件2025学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

第2节

基因工程的基本操作程序【本节聚焦】1.基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？2.基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？第1课时从社会中来思考：1.你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？2.培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤呢？转基因抗虫棉与普通棉花苏云金杆菌与载体拼接普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉提取导入抗虫基因（Bt抗虫蛋白基因）重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的

检测与鉴定(含抗虫基因）（含有并表达抗虫基因）从社会中来知识拓展：基因的结构基因1基因2基因3DNA片段放大基因通常是有遗传效应的DNA片段；能编码特定的蛋白质非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段获取目的基因一般获取哪一部分的DNA片段？基因编码区知识拓展：基因的结构与RNA聚合酶结合位点RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA启动子终止子本质：位置：作用：是一段有特殊序列结构的DNA片段；位于基因上游；也是一段有特殊序列结构的DNA片段；位于基因下游；终止转录本质：位置：作用：启动子终止子非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游原核细胞的基因结构知识拓展：基因的结构编码区非编码区非编码区内含子外显子启动子终止子外显子：内含子：能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列。能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列，然后在翻译前就被剪切掉。真核细胞的基因结构知识拓展：基因的结构【总结】原核细胞与真核细胞的基因结构比较不能编码蛋白质的序列=

非编码区原核生物的基因：不能编码蛋白质的序列真核生物的基因：=非编码区+内含子原核细胞真核细胞不同点编码区是

的编码区是间隔的、

的相同点都由能够编码蛋白质的

和具有调控作用的

区组成的连续不连续编码区非编码一、目的基因的筛选与获取(1)概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。(2)实例：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。1.目的基因资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。目的基因那么，如何筛选目的基因呢？一、目的基因的筛选与获取2.目的基因的筛选：苏云金杆菌制成杀虫剂掌握目的基因的功能掌握目的基因的结构防治棉花害虫发现杀虫作用与Bt基因有关掌握Bt基因的序列深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白)如何掌握？抗虫原理？

当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。思考：Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因怎么获得？一、目的基因的筛选与获取测序技术序列数据库序列比对工具利用测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因DNA测序仪核苷酸序列比对氨基酸序列比对美国国家生物信息中心测定核酸和蛋白质序列以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。拓展：掌握基因结构和功能的技术方法3、获取目的基因常用的方法①从生物组织中直接获取②人工合成③从基因文库中获取④利用PCR获取和扩增目的基因基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成基因组文库（某生物全部基因）部分基因文库（主要是cDNA文库）前提：方法：一、目的基因的筛选与获取DNA合成仪4、从基因文库中获取目的基因

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因组文库部分基因文库（包含一种生物的所有基因）（cDNA文库）（包含一种生物的一部分基因）一、目的基因的筛选与获取（1）基因文库概念（2）基因文库类型基因组DNA限制酶切基因组文库mRNA逆转录得cDNA,酶切cDNA文库拼接质粒，导入细菌中保存为文库一、目的基因的筛选与获取（3）基因文库的构建

先对目的基因进行扩增获取一个Bt基因之后，是否就该立即开始准备转基因操作？

抗虫基因快速获得大量抗虫基因苏云金杆菌提取一、目的基因的筛选与获取5.利用PCR获取和扩增目的基因PCR是

的缩写。它是一项根据＿＿＿＿＿的原理，在

提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对

的技术。（1）PCR的概念：中文全称原理操作环境目的PCR扩增仪聚合酶链式反应DNA半保留复制体外目的基因的核苷酸序列进行大量复制PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。离心管一、目的基因的筛选与获取(2)原理：DNA半保留复制，即在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。5.利用PCR获取和扩增目的基因一、目的基因的筛选与获取DNA复制的条件:原则:③能量：亲代DNA的两条链4种游离的脱氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等由细胞代谢提供的ATP①模板：②原料：④酶：

碱基互补配对原则从子链的5'端向3'端延伸方向:特点:边解旋边复制、半保留复制

、多起点双向复制体外复制怎么改进体外用高温代替体外需用耐高温的DNA聚合酶子链合成需要引物

引物为DNA聚合酶提供了游离的3′端，使DNA聚合酶从3′端延伸子链。(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能)5.利用PCR获取和扩增目的基因一、目的基因的筛选与获取引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物2什么是引物？3’5’DNA母链13’5’DNA母链2引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链，体内的DNA复制通常以RNA单链为引物体外（PCR）一般以DNA单链为引物用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。引物结合在模板链的3’端一、目的基因的筛选与获取体内DNA复制参与的组分在DNA复制中的作用PCR中参与的组分解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常为小的单链RNA）无需解旋酶，用高温代替DNA（目的基因）模板4种脱氧核苷酸(dNTP)耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）引物（通常与两条模板链结合的2种为小的单链DNA）反应还需要其它条件，如缓冲液（一般添加Mg2+）、和控温设备打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸(3)PCR的进行需要的条件5.利用PCR获取和扩增目的基因dNTP和ATP类似,不但可以提供原料还可以提供能量，无需添加ATP。一、目的基因的筛选与获取当温度超过_____以上时，

断裂，双链DNA解聚为两条

。

氢键单链DNA待扩增的DNA片段(1)变性：变性90℃3’3’5’5’3’5’3’5’不需要解旋酶思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。(4)PCR反应的过程5.利用PCR获取和扩增目的基因一、目的基因的筛选与获取(4)PCR反应的过程5.利用PCR获取和扩增目的基因当温度下降

到左右时，

种引物通过

与两条单链DNA结合。

3’5’3’5’碱基互补配对引物15’3’引物25’3’(2)复性：50℃两由于DNA双链是反向平行的，所以需要两种引物思考：为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？①因为Taq酶不能从0开始添加核苷酸。②引物结合在DNA模板链

3'端位置，引导子链从5'端→3'端方向复制。一、目的基因的筛选与获取(4)PCR反应的过程5.利用PCR获取和扩增目的基因当温度上升到____左右时，溶液中的4种_________在耐高温的_______________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

脱氧核苷酸DNA聚合酶72℃(3)延伸：(Taq酶)3’5’3’5’引物15’3’引物25’3’Taq酶3’Taq酶3’思考1：为什么温度要上升至72℃？思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？72℃是Taq酶的最适温度Taq酶结合在引物的3’端一、目的基因的筛选与获取耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（dNTP）引物待扩增的DNA片段（模板）5’5’

变性

复性

延伸温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。长度相同但C-G含量高的引物需要设定的复性温度较高(4)PCR反应的过程一、目的基因的筛选与获取(4)PCR反应的过程一、目的基因的筛选与获取①DNA分子有_____个②总链数_____条③不含引物的链数：___④含引物的链数_____⑤含引物1或2的链数：______⑥仅含引物1的DNA数：______⑦仅含引物2的DNA数：______⑧引物1、2均含有的DNA数：_____⑨不含引物的DNA数：______⑩需要引物的总数：______2n2n+122n+1-2循环n次：2n-1112n-202n+1-2★(4)PCR反应的过程一、目的基因的筛选与获取用PCR可以扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA一、目的基因的筛选与获取

利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段(即出现完整的目的基因)？5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’一、目的基因的筛选与获取(5)PCR产物鉴定PCR过程可以在

中自动完成，完成以后，常采用

来鉴定PCR的产物琼脂糖凝胶电泳PCR扩增仪探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理：一、实验原理(1)PCR利用了

原理，通过调节

来控制DNA双链的

，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。(2)PCR扩增DNA片段还利用了

的原理。一次PCR一般要经历

次循环。DNA的热变性温度解聚与结合DNA半保留复制305’--3’3’--5’3’--5’5’--3’5’--3’-5’5’-3’--5’5’--3’-5’5’-3’--5’3’--3’高温变性延伸复性低温中温1次循环一.实验原理2、DNA片段电泳鉴定的原理DNA分子具有______________，在一定的____下，这些基团可以带上________________，在_________的作用下，这些___________会向着____________________的电极移动，这个过程就是_____。可解离的基团pH正电荷或负电荷带电分子电泳与它所带电荷相反电场在凝胶中DNA分子的迁移速率与_____________、_________________和_______等有关。凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为________的________下被检测出来。凝胶的浓度染色300nm紫外灯DNA分子的大小构象探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）PCR仪电泳装置⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）微量离心管推动杆调节旋钮卸枪头按钮体积刻度吸液杆枪头（注意：加不同样品时，需要更换枪头）二、材料用具1.仪器:探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定二、材料用具2.试剂:(1)4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量为1pg-1μg）5～10μL总体积50μLPCR反应体系的配方为保证加入反应体系中的各试剂体积的准确性，建议按照加入体积的大小，由大到小依次加入各试剂，即先加入无菌水。为保护酶的活性，一般最后加入DNA聚合酶。探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)DNA片段的扩增①移液：用微量移液器依次将各组分加入微量离心管中。（注意：酶和缓冲液要在冰块上缓慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和缓冲液一般分装成小份，避免反复融化导致活性降低甚至失活）②离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）③反应：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min

使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合预变性：三、实验步骤探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定①熔化：电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。②倒模:将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。③凝固:待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。（2）制备凝胶三、实验步骤探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定（3）进行电泳①加液：将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。②加样：扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。③电泳：接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳④观察鉴定:取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。三、实验步骤探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定三、实验步骤注意：1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定四、实验结果及分析评价[思考1]你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？

以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带。[思考2]你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。①如果扩增不成功，可能的原因有：

漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。②如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：

引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好；模板DNA出现污染；Mg2＋浓度过高等。耐高温的DNA聚合酶失活；引物出现质量问题；变性时温度低，变性时间短;Mg2+浓度过低③未出现扩增条带可能的原因有：拓展：PCR引物设计DNA复制为何需要引物？

不能从头合成：DNA聚合酶无法在没有游离羟基（3'-OH）的情况下从头开始合成新链。它只能将核苷酸添加到已有的核酸链的3'-OH末端上。引物的作用:使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。合成引物的前提:要有一段已知目的基因的核苷酸序列。5’--3’-5’3’-引物子链延伸5’-3’引物子链延伸引物是决定PCR特异性的关键。3’--5’【典例1】对人干扰素基因进行PCR扩增时需要一对引物，应从下图中A、B、C、D四种单链DNA片段中选取__________（填字母）作为引物。B、C1、引物需位于目的基因的两侧、且能顺利扩增出目的基因2、引物只能与模板链的3’端结合，引导子链从5’端向3’端延伸拓展：PCR引物设计1、引物的选择总结：【典例2】(2023·山东，25节选)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物____________________。F2和R1或F1和R2拓展：PCR引物设计1、引物的选择总结:用PCR扩增分析法确定重组质粒中目的基因插入方向是否正确时，设计的一对引物的特点是：一个引物与目的基因序列互补，另一个引物与质粒序列互补，两引物延伸方向相对。拓展：PCR引物设计2、引物的设计原则【典例3】(2017·江苏)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（见图），请分别说明理由。(1)第1组：

。(2)第2组：

。引物Ⅰ′自身折叠后互补配对而失效引物Ⅰ与引物Ⅱ局部互补配对而失效5'3'5'3'3'5'【典例4】(2020·江苏，33节选)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图：若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)拓展：PCR引物设计2、引物的设计原则②和④总结:1.

若待扩增序列的两端已知，则所用两条引物的方向_____（相对或相反）2.若DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，则所选引物应朝向已知序列的_______（外侧或内侧）（即反向PCR技术）相对外侧拓展：PCR引物设计3、引物的修饰为了使PCR产物能连接到载体上，可以在扩增过程中添加限制酶识别位点。可在引物的

端添加限制酶识别位点.5′目的基因两侧无限制酶切位点？【典例5】研究者利用图中质粒构建重组DNA分子并导入大肠杆菌，获得生产胰岛素的工程菌，成为生产胰岛素的“活工厂”。已知胰岛素基因的α链为转录模板，据图分析，利用PCR扩增胰岛素基因时，需对引物

进行特殊处理，处理方式为

。3′5′mRNA3′5′3′5′强启动子BamHⅠSalⅠ②和③在引物③的5’端添加BamHⅠ识别序列和强启动子在引物②的5’端添加SalⅠ识别序列(1)据图分析，应选用

酶切割质粒，以保证质粒与目的基因高效重组。【典例6】

镉(Cd)作为一种重金属元素，会严重威胁人体健康。科研人员将Cd响应启动子CadR与绿色荧光蛋白基因(EGFP)组合在一起导入大肠杆菌，构建能够检测环境中Cd污染的生物传感器。已知LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。相关信息如图所示，其中P1、P2、P3表示引物。MunI和XhoI

(2)已知EGFP基因转录得到的RNA中缺乏起始密码子AUG。利用PCR技术获取EGFP基因时，为保证EGFP基因能正确插入载体且可以正常表达，除选择引物P1外，还需要选择引物

,并在其

5'端增加碱基序列

5'

3'。【典例6】

镉(Cd)作为一种重金属元素，会严重威胁人体健康。科研人员将Cd响应启动子CadR与绿色荧光蛋白基因(EGFP)组合在一起导入大肠杆菌，构建能够检测环境中Cd污染的生物传感器。已知LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。相关信息如图所示，其中P1、P2、P3表示引物。P2GAATTCATG

归纳总结：PCR引物设计原则扩增特异性扩增高效性引物拓展：PCR引物设计①引物与一段已知目的基因的核苷酸序列互补配对②引物__________________不应存在互补序列③引物_______可以修饰，______不可修饰④引物_______要适宜⑤引物__________要适宜长度GC含量3'端5'端自身及引物之间通常20-30bp45-55%课堂练习PCR无需解旋酶，用高温代替1.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是A.二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量D.二者遵循的碱基互补配对原则相同√课堂练习7/82.下图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端B.在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4√思考：能不能直接将目的基因导入受体细胞，为什么？如果不能，如何避免该结果的发生呢？

①游离的DNA进入细胞后，一般会直接被分解。

②就算没有被破坏且能进行转录和翻译，游离的DNA也无法跟着细胞分裂进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。核心工作——基因表达载体构建二、基因表达载体的构建1.目的：2.基因表达载体的组成：（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。思考：各个元件有什么作用？二、基因表达载体的构建目的基因：能控制表达所需要的特殊性状启动子：位置：基因的上游功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。复制原点：DNA复制的起始位点终止子：位置：基因的下游功能：终止转录标记基因：便于重组DNA分子的筛选。2.基因表达载体的组成：（启动子=起始密码?）（终止子=终止密码?）二、基因表达载体的构建启动子终止子起始密码子终止密码子本质位置功能DNA片段DNA片段mRNA上三个相邻的碱基mRNA上三个相邻的碱基目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号（编码氨基酸）翻译的结束信号（不编码氨基酸）二、基因表达载体的构建目的基因应该插入什么位置？

目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入

，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。启动子和终止子之间的部位诱导型启动子：诱导型启动子诱导物作用激活或抑制目的基因表达二、基因表达载体的构建3.基因表达载体的构建过程:DNA分子（含目的基因）限制酶处理带有黏性末端或平末端的切口带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种载体（质粒）二、基因表达载体的构建使用一种DNA限制酶进行切割（单酶切），是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？载体目的基因自连片段间的连接目的基因自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接正向连接反向连接11’22’122’1’22’1’1选择两种不同的限制酶同时对目的