单基因遗传病基因检测概述

单基因遗传病基因检测主要内容现状与展望检测方案背景介绍病例分享单个基因变异引起，符合孟德尔遗传规律常显（AD）常隐（AR）X连锁（XL）Y连锁（YL）线粒体遗传致畸、致残、致死，无有效治疗方法，重在预防先天性终身性遗传性临床表型和遗传异质性定义遗传方式危害性特点发病率单一发病率低，但种类多，总发病率达2.5%。其中，全球出生人口单病累计发病率为10/1000*什么是单基因遗传病？*数据来源：/genomics/public/geneticdiseases/en/index2.htmlSource:NorthCarolinaInstituteforRare,Orphan,andNeglectedDiseases机遇与挑战/statistics/entry单基因遗传病数目及检测机构/sites/GeneTests/?db=GeneTests7693种282817310119234全球基因检测实验室分布/常见基因检测技术方法优点缺点Array-CGH，SNPArray检测精度高、准确性高通量高检测1M以上的缺失/重复依赖已有数据库，不能发现新变异基因SNP具有种族差异（假阴性）MLPA同时检测缺失/重复一对引物检测多个位点检测已知突变基因SNP具有种族差异（假阴性）Sanger测序，PCR，qPCR明确、简单、对于已知基因或位点的检测快速有效 测序的“金标准”通量低成本高需要设计引物和探针，优化反应条件等，操作较复杂NGS通量高全面解决多基因、遗传异质性疾病、新变异位点等问题

多个个体同时检测（降低成本）准确性高SNV、缺失/重复的检测准确性高成本相对较高，但大样本测序成本低CNV灵敏度、准确性稍低检测周期相对较长主要内容现状与展望检测方案背景介绍病例分享单基因遗传病系列产品及检测策略全基因组疾病可对所有疾病检测结果包括大量临床意义不明突变，难以解释科研为主，没有用于临床可以用于PGD、胎儿基因组等用途费用高，周期长全基因组重测序扩增一个性状或一个疾病的基因检测点突变和缺失重复发现新突变、但不能发现新基因检测相关基因组合临床意义明确结果解释容易可以发现新突变、不能发现新基因可以检测75-85%致病突变对整个外显子组捕获测序发现点突变和缺失重复可能发现临床意义不明的突变，难以解释发现新基因单一疾病全外显子组疾病Sanger,QPCR,Panel单一疾病检测Panel疾病组合或全Panel检测全外显子组测序检测一类或一个系统疾病根据疾病类型不同设计不同的检测方案1单基因遗传病11大基因检测400+疾病，1200+基因单基因遗传病基因检测的意义辅助诊断确定致病突变，精确诊断；指导治疗指导医疗干预或治疗；指导预后保健；风险评估了解致病基因携带情况，评估患病风险；为受检者提供建议，采取适当措施降低患病风险；遗传咨询指导优生优育，避免将致病基因遗传给下一代技术方法目标区域捕获+新一代高通量测序技术检测技术

:目标序列捕获高通量测序（主要）PCR-Sanger定量PCR验证技术:PCR-Sanger定量PCRLR-PCR特点:准确、专业、高通量、高性价比

目标序列捕获高通量测序技术的优势MLPA、一代测序目标序列捕获+高通量测序13数据库分析正常人群遗传多态性数据库dbSNP频率信息Hapmap频率信息千人基因组93个中国人频率信息100个正常人频率信息Newlyreported单基因病突变数据库准确定位单基因疾病致病突变寻找新型致病基因发现新型致病位点OMIM:onlineMendelianinheritanceinMen./omimHGMD:HumanGeneMutationDatabase.CardiffUniversity,UKhttp://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.phpLOVD:LeidenOpenVariationDatabase.更强大的检测手段？不在芯片列表上的疾病？芯片无法检测的疾病？病因不明的疾病？尚未发生的疾病？全外显子组基因检测（WES）2临床全外显子组检测内容全外显子组测序单基因病主诉相关12类疾病其他主诉无关的偶然发现ACMG推荐报道的57个基因携带者筛查22,000多个基因180,000多个exon2752个基因4000多种疾病核心内容主诉相关检测2752基因4272种疾病（OMIM数据库）神经肌肉类疾病原发性免疫缺失智力障碍代谢病性发育障碍遗传性肿瘤遗传性肾病遗传性骨病矮小症遗传性眼病听力减退唇腭裂其他280个基因,119种疾病239个基因,212种疾病477个基因,444种疾病118个基因,80多种疾病195个基因,215种疾病108个基因,108种疾病394个基因,605种疾病374个基因,504种疾病463个基因,488种疾病222个基因,50多种疾病103个基因,98种疾病281个基因,308种疾病995个基因,1143种疾病主诉无关的偶然发现

——ACMG推荐报道的57个基因疾病疾病中文名基因HereditaryBreastandOvarianCancer遗传性乳腺癌和卵巢癌BRCA1,BRCA2Li-FraumeniSyndromeLi-Fraumeni综合征TP53Peutz-JeghersSyndromePeutz-Jeghers综合征STK11LynchSyndromeLynch综合征MLH1,MSH2,MSH6,PMS2Familialadenomatouspolyposis家族性腺瘤性息肉病APCMYH-AssociatedPolyposis;Adenomas,multiplecolorectal,FAPtype2;Colorectaladenomatouspolyposis,autosomalrecessive,withpilomatricomasMYH相关性息肉病；FAP2型多发性结肠直肠腺瘤MUTYHVonHippelLindausyndromeVonHippelLindau综合征VHLMultipleEndocrineNeoplasiaType1多发性内分泌瘤病1型MEN1MultipleEndocrineNeoplasiaType2多发性内分泌瘤病2型RETFamilialMedullaryThyroidCancer(FMTC)家族性骨髓甲状腺癌RET,NTRK1PTENHamartomaTumorSyndromePTEN错构瘤综合征PTENRetinoblastoma成视网膜细胞瘤RB1HereditaryParaganglioma-PheochromocytomaSyndrome遗传性副神经节瘤-嗜铬细胞瘤综合征SDHD,SDHAF2,SDHC,SDHBTuberousSclerosisComplex结节性硬化症TSC1,TSC2WT1-relatedWilmsWT1-相关型肾母细胞瘤WT1Neurofibromatosistype2多发性神经纤维瘤2NF2EDS-vasculartypeEhlers-Danlos综合征血管型COL3A1MarfanSyndrome,Loeys-DietzSyndromes,andFamilialThoracicAorticAneurysmsandDissectionsMarfan综合征，Loeys-Dietz综合征和家族性胸腔主动脉瘤和主动脉夹层FBN1,TGFBR1,TGFBR2,SMAD3,ACTA2,MYLK,MYH11Hypertrophiccardiomyopathy,Dilatedcardiomyopathy肥厚型心肌病MYBPC3,MYH7,TNNT2,TNNI3,TPM1,MYL3,ACTC1,PRKAG2,GLA,MYL2,LMNACatecholaminergicpolymorphicventriculartachycardia儿茶酚胺介导的多形性室速RYR2Arrhythmogenicrightventricularcardiomyopathy致心律失常性右室心肌病PKP2,DSP,DSC2,TMEM43,DSG2Romano-WardLongQTSyndromesTypes1,2,and3,BrugadaSyndromeRomano-Ward长QT综合征KCNQ1,KCNH2,SCN5AFamilialhypercholesterolemia家族性高胆甾醇血症LDLR,APOB,PCSK9Malignanthyperthermiasusceptibility恶性高热RYR1,CACNA1S全外显子组测序检测意义及重要性

SLC26A3(D652N)先天性氯化物腹泻Bartter综合症？118个近亲生育阿拉伯裔MDD患者10个患者纠正诊断100个智力低下者及正常父母（Trios）13个个体发现denovo突变，3个XR250个各种单基因病患者，62个检测出致病突变纠正诊断检出率高全外显子组测序检测的优势是目前最综合（覆盖基因全面，性价比高）的基因检测方式之一；可能会有一些揭示受检者未来患病风险的偶然发现；可以随着知识和研究水平的提高更新结果；有发现新基因的可能。单一疾病、单一系统分析全外分析单基因病检测策略（panel、全外）疑似遗传病患者表型明确异质性低PCR-Sanger测序阴性异质性高单基因Panel测序阴性表型对应疾病不明全外显子基因检测（家系）医生评估临床表型不在panel检测列表中、或无法判断疾病、或怀疑由新基因导致判断疾病在panel检测列表中服务流程样本类型及运输要求样品类型体积/总量运输/保存血样成人不低于5ml，婴幼儿不低于2ml。EDTA或柠檬酸钠抗凝，充分颠倒混匀，避免血液凝固，采集后如即刻寄送，室温（秋冬季）7天内送达，炎热天气（春夏季）3天内送达，冰袋/干冰运输最好。冻存外周血，需在-20℃保存，保存时间不超过2年，反复冻融不超过5次，需冰袋/干冰运输。DNA浓度不小于30ng/μL；DNA总量不低于3μg；OD260/280值在1.8-2.0之间，无降解，无蛋白或RNA污染。提取DNA后如即刻寄送，建议选择干冰运输；对于冻存的DNA样本，-20℃保存不超过2年，反复冻融不超过5次；不建议运送冻存DNA。肌肉活检组织100mg肌肉活检组织采集后应立即液氮冷冻保存，干冰运输。主要内容现状与展望检测方案背景介绍病例分享病例一、Leigh综合征临床信息患者信息：男，27岁临床表现：高热后逐渐出现复视、行走不稳4个月；双眼活动受限，四肢肌力III级，双上肢掌全颌反射(+)，双下肢Babinski征(+),四肢健反射低，双下肢音叉振动觉下降；头MRI：中脑双底节胼胝体压部多发异常信号；生化检测：血清乳酸slac:3.7mmol/l脑脊液乳酸csf-lac:3.74mmol/l临床诊断：线粒体脑病？MitoExon测序（线粒体遗传病panel）致病突变：MT-ATP6基因的m.9176T>C突变

患者和患者母亲sanger验证检测到患者母亲m.9176T>C杂合

突变，符合线粒体基因母系遗传

规律；致病突变与患者症状相符，

确定疾病和致病原因。基因染色体突变位置核苷酸改变氨基酸改变功能改变Hom/Het（突变率%）突变类型MT-ATP6chrM9176m.9176T>Cp.Leu217PromissenseHom(99.4%)Leigh综合征，已知致病突变患者

患者母亲

基因检测可以确定疾病和致病原因。25DMDMLPA结果：怎么办？病例二、假肥大性肌营养不良症--DMDDMD背景简介临床表现首先影响骨盆带肌肉，以后累及肩胛带肌肉。患儿双侧腓肠肌逐渐呈假性肥大，腱反射减弱或消失。实验室检查血中磷酸肌酸激酶（CK）浓度显著增高，肌电图和肌肉活体组织检查。分子机制DMD基因位于X染色体（Xp21.2），基因全长2.22Mb，是人类最大的基因，包含79个外显子编码区长11,334bp，编码Dystrophin蛋白，由3,777个氨基酸组成。2627DMD基因捕获及测序该病突变类型：-约60%缺失型，-5%-10%由微重复所致，-30-35%为点突变或框移突变，主要散发在整个DMD基因的编码区

DMD基因外显子长度和数目很大，常规Sanger测序检测成本高、效率低。高通量测序能覆盖多个外显子，还对其中的微重复、点突变、框移突变都能检测。纯合缺失型:EX3_7del杂合缺失型正常女性28ID=indel792;status=novel;support=V64/W20;reads_ratio=76.19%;mut_type=Het;region=Gene;gene=DMD;NM_ID=NM_004006;strand_of_gene=-;wild_type=AT;flank_+15=TTTTTTTTCAATGTC;function=insertion芯片捕获+测序结果恰当的方法有助于提高单基因病致病突变的检出率。案例三、脑白质病变29简要病史描述：一对夫妻结婚后生育一患儿，六岁不能行走。先证者主诉：出生至今不能跑跳、独走病史：系G2P1足月剖宫产，产时无窒息，出生即哭声低弱，吸吮无力，6月会竖头，2岁以后会坐，至今不能独走、跑跳，可短时独站十余秒，近1-2年有倒退，智力正常。体格检查：头围52cm，神清，心肺腹无异常，双上肢近端肌力III级，远端肌力III+级，双下肢肌力IV级，膝腱反射、跟腱反射可引出（减弱），跟腱挛缩，平卧不能爬起，腓肠肌无肥大，颌关节挛缩，牙齿咬合不全。患儿临床诊断：先天性肾上腺脑白质营养不良。基因检测结果：相关基因ABCD1未发生突变。女方再次怀孕，生育出一名疑似患者，主要表现为6个月不能抬头。30心肌酶CK491U/L,CK-MB28U/L，LDH-L352U/L，LDH-179U/L，AST79U/L，肝肾功能、电解质正常代谢酶学检查：酸性-β半乳糖脑苷脂酶GM1

己糖胺酶A（HexA）GM2

己糖胺酶B（HexB）Sandhoff病半乳糖脑苷脂酶Karbbe脑白质营养不良

β-葡糖脑苷脂酶GaucherDiseaseα-半乳糖脑苷脂酶FabryDisease

酸性α-葡萄糖苷酶PompeDisease

芳香硫酸酯酶A（ASA）MLD

酸性鞘磷脂酶（ASM）Niemannpick'sDisease血尿代谢筛查正常，脂酰肉碱正常，极长链脂肪酸正常。头颅MRI提示白质异常，胼胝体、脑干正常脑电图正常肌电图提示肌源性损害辅助检查先证者（哥哥）:31其弟:足月，剖宫产，产时无窒息，出生时家长即觉患儿吸吮无力，吃奶慢，哭声低弱，活动少，不会蹬被子，家长自觉患儿活动少，60天可竖头但不稳，3月可逗笑，6月不能抬头，9月不能独坐，康复治疗近1月觉好转。查体：头围40cm，四肢肌力IV级，肌张力低，双侧膝反射、跟腱反射未引出，颅神经检查未见异常，仰卧拉起时可竖头，俯卧时不能竖头。肌酶

AST:152U/L，LDH-L755U/L，LDH-1113U/L，CK5354U/L，CK-MB197U/L。肌电图提示肌源性损害4月时MRI正常头颅见白质异常，

胼胝体、脑干正常肌肉见腓肠肌、

大腿内侧肌群异常信号家族史32诊断思路

缺氧自身免疫性感染代谢性疾病脑血管病肿瘤中毒性

原发性继发性肌肉疾病脑白质病变肌营养不良肌病肌炎遗传性脑白质病33LAMA2：

父亲：

p.Lys682LysfsX22,c.2045_2046delAGSanger验证34对照母亲父亲先证者定量PCR验证EX5存在缺失35肌酶肌电图头颅核磁先天性肌营养不良1A型

(congenitalmusculardystrophy1A,MDC1A)遗传方式：常染色体隐性遗传致病基因：LAMA2先天性肌营养不良1A型背景介绍36c.2045_2046delAG/wtEX5del/wtEX5del/c.2045_2046delAGEX5del/c.2045_2046delAG参考文献:GuicheneyP,etal.PCRbasedmutationscreeningofthelamininalpha2chaingene(LAMA2):applicationtoprenataldiagnosisandsearchforfoundereffectsincongenitalmusculardystrophy.JMedGenet.1998Mar;35(3):211-7.生育指导自然怀孕+产前诊断领养供精/供卵PGD单基因+产前诊断准确的临床诊断，有利于寻找致病基因，指导下一胎生育。解决方案37病例四：贝氏肌营养不良（BMD）患者信息：男，40岁，成都人，无遗传病史现病史：双下肢肌肉渐近性无力、萎缩两年。辅助检查：CK4212.3/L,肌电图显示肌源性损害。疑诊贝氏肌营养不良（BMD）送检。经华大检测DMD基因：检测结果阴性。38患者患者正常人正常人撒网式的基因panel有助于寻找致病基因，辅助临床明确或修正诊断。

31个基因的组合疾病panel肢带型肌营养不良2B型：DYSF基因存在2个剪切突变，c.144+1G>A和c.342+1G>T杂合突变

筛查LCA17个已知相关基因，未见致病突变LCA:先天性利伯氏黑蒙全外显子组基因检测2460未经报道的变异10个无义突变改变了蛋白质的表达5个突变表达在视网膜上NMNAT1,LCA9,1p36.22病例五

、Gavin的故事——全外显子组寻找致病突变769G>Ap.Glu257Lys/507G>Ap.Trp169*+/+c.769G>A,p.Glu257Lysc.507G>A,p.Trp169*用Sanger法验证TheNMNAT1mutationinother10casesfrom9unrelatedfamilies错义突变无义突变ChiangPWetal.,2012验证9个家庭的10个病例均发现了NMNAT1突变在panel检测未果的情况下，全外显子组测序有助于寻找致病基因，甚至发现新的致病基因。主要内容现状与展望产品介绍背景介绍病例分享国际罕见病研究联盟CanadaFORGEPro