HPV经Wnt通路诱导宫颈癌上皮-间质转化的分子机制与临床意义探究

HPV经Wnt通路诱导宫颈癌上皮-间质转化的分子机制与临床意义探究一、引言1.1研究背景与意义宫颈癌作为女性生殖系统中最为常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着全球女性的生命健康与生活质量。据国际癌症研究机构（IARC）发布的最新数据显示，[具体年份]全球宫颈癌新发病例约[X]万，死亡病例约[X]万，其发病率和死亡率在女性恶性肿瘤中均位居前列，在发展中国家，由于医疗卫生条件和筛查普及程度的差异，宫颈癌的负担更为沉重，发病率和死亡率显著高于发达国家。在中国，每年新增宫颈癌病例约[X]万，死亡约[X]万，成为了严重影响女性健康的公共卫生问题。大量的研究已经明确，人乳头瘤病毒（HPV）感染是引发宫颈癌的主要致病因素。HPV是一种双链环状DNA病毒，目前已发现超过200种亚型，其中约40种亚型与生殖道感染相关。根据致癌性的不同，HPV可分为高危型和低危型，高危型HPV（如HPV16、18、31、33等）的持续感染能够导致宫颈上皮细胞的异常增殖和分化，进而引发宫颈癌前病变，若未得到及时有效的干预，最终将发展为宫颈癌。研究表明，超过99%的宫颈癌组织中可检测到高危型HPV的DNA，尤其是HPV16和HPV18亚型，与约70%的宫颈癌病例密切相关。Wnt信号通路作为一条在生物进化过程中高度保守的信号传导通路，在正常胚胎发育、细胞增殖、分化、迁移和组织稳态维持等生物学过程中发挥着至关重要的作用。在正常生理状态下，Wnt通路处于严格的调控之中，其信号传递受到多种分子的精细调节。然而，在肿瘤发生发展过程中，Wnt通路常常发生异常激活，导致细胞增殖失控、凋亡受阻、侵袭和转移能力增强等恶性生物学行为。已有研究证实，Wnt通路的异常激活与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关，包括结直肠癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等。在宫颈癌中，Wnt通路的异常激活同样被发现参与了宫颈癌细胞的增殖、存活、上皮-间质转化（EMT）以及肿瘤干细胞特性的维持等过程，进而促进了宫颈癌的进展和转移。上皮-间质转化（EMT）是指上皮细胞在特定的生理和病理条件下，逐渐失去上皮细胞的特征，如细胞极性和细胞间连接，同时获得间质细胞的特性，如迁移和侵袭能力增强的过程。在肿瘤领域，EMT被认为是肿瘤细胞获得侵袭和转移能力的关键步骤之一。在宫颈癌的发生发展过程中，EMT起着至关重要的作用。通过EMT过程，宫颈癌细胞能够突破上皮组织的基底膜，进入周围组织和血管、淋巴管，从而实现肿瘤的局部浸润和远处转移。研究表明，发生EMT的宫颈癌细胞具有更强的迁移和侵袭能力，对化疗和放疗的耐受性也更高，这使得宫颈癌的治疗变得更加困难，患者的预后也更差。近年来的研究发现，HPV感染与Wnt通路之间存在着密切的相互作用，并且这种相互作用在HPV感染导致宫颈癌上皮-间质转化的过程中发挥着关键作用。HPV感染可能通过多种机制调节Wnt通路的活性，进而影响宫颈上皮细胞的生物学行为，促进宫颈癌的发生和发展。深入探究HPV经Wnt通路致宫颈癌上皮-间质转化的具体机制，不仅有助于我们更加全面、深入地理解宫颈癌的发病机制，还能够为宫颈癌的早期诊断、预防和治疗提供新的靶点和策略。例如，通过针对Wnt通路关键分子的干预，有可能阻断HPV感染诱导的宫颈癌上皮-间质转化过程，从而抑制宫颈癌的进展；或者通过检测HPV感染和Wnt通路相关分子的表达水平，实现对宫颈癌高危人群的精准筛查和早期诊断，提高患者的生存率和生活质量。因此，本研究具有重要的理论意义和临床应用价值。1.2研究目的本研究旨在深入探究HPV经Wnt通路致宫颈癌上皮-间质转化的详细机制，具体研究目的如下：明确HPV感染对宫颈上皮细胞中Wnt通路关键分子表达和活性的影响。通过细胞实验和分子生物学技术，检测HPV感染后Wnt通路相关蛋白（如β-连环蛋白（β-catenin）、卷曲蛋白（Frizzled）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）等）的表达水平变化，以及这些分子的磷酸化状态和亚细胞定位改变，从而揭示HPV感染调节Wnt通路活性的具体分子机制。阐明Wnt通路在宫颈癌上皮-间质转化过程中的作用机制。运用基因敲除、过表达技术以及小分子抑制剂等手段，特异性地干预Wnt通路的活性，观察其对宫颈上皮细胞上皮-间质转化相关标志物（如上皮标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）、间质标志物N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、Snail蛋白等）表达的影响，以及对细胞迁移、侵袭能力的改变，明确Wnt通路在宫颈癌上皮-间质转化中的关键作用及上下游调控关系。揭示HPV感染与Wnt通路在宫颈癌上皮-间质转化过程中的相互作用机制。综合运用体内外实验模型，分析HPV感染如何通过调节Wnt通路活性，进而影响宫颈上皮细胞的上皮-间质转化进程；同时，探究Wnt通路的异常激活是否会反过来影响HPV在宫颈上皮细胞内的生命周期和致癌作用，明确两者之间的相互作用模式和分子关联。为宫颈癌的临床防治提供新的理论依据和潜在治疗靶点。基于上述研究结果，筛选出HPV经Wnt通路致宫颈癌上皮-间质转化过程中的关键分子节点，为开发针对这一病理过程的新型诊断标志物和治疗药物奠定理论基础，有望为宫颈癌的早期诊断、精准治疗和预后改善提供新的策略和方法。1.3国内外研究现状1.3.1HPV与宫颈癌的研究现状HPV与宫颈癌的关联研究由来已久，自20世纪70年代德国科学家HaraldzurHausen首次提出HPV可能与宫颈癌发生相关以来，大量研究不断证实并深入挖掘这一关系。目前，已明确高危型HPV持续感染是宫颈癌发生的必要条件。在全球范围内，HPV16和HPV18亚型在宫颈癌组织中的检出率最高，在欧美国家，HPV16和HPV18约占宫颈癌病例的70%-80%，亚洲地区的研究也显示，这两种亚型在宫颈癌中的占比同样较高，如在中国的相关研究中，HPV16和HPV18在宫颈癌患者中的检出率可达60%-70%。除HPV16和HPV18外，HPV31、33、45等亚型也与宫颈癌的发生密切相关，不同地区的HPV亚型分布存在一定差异。HPV感染导致宫颈癌发生的机制研究也取得了显著进展。HPV基因组中的E6和E7基因被认为是主要的致癌基因。E6蛋白能够与细胞内的抑癌蛋白p53结合，促进p53的泛素化降解，从而使细胞失去p53对细胞周期和凋亡的调控作用，导致细胞异常增殖；E7蛋白则与视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）结合，释放转录因子E2F，启动细胞周期相关基因的转录，促进细胞进入增殖周期，同时E7蛋白还能干扰细胞的正常分化过程。此外，HPV感染还会引起宿主细胞基因组的不稳定，导致染色体畸变、基因扩增或缺失等，进一步促进肿瘤的发生发展。在HPV检测技术方面，经过多年的发展已日趋成熟。目前常用的检测方法包括基于核酸扩增的聚合酶链式反应（PCR）技术及其衍生方法，如实时荧光定量PCR、多重PCR等，这些方法具有较高的灵敏度和特异性，能够准确检测出多种HPV亚型；还有基于杂交捕获的技术，如二代杂交捕获试验（HC-II），可同时检测13种高危型HPV，在宫颈癌筛查中得到广泛应用。随着分子诊断技术的不断创新，新型的HPV检测技术如基因芯片技术、数字PCR技术等也逐渐崭露头角，它们在检测通量、准确性和检测速度等方面具有独特优势，为HPV感染的精准诊断提供了更多选择。1.3.2Wnt通路与肿瘤的研究现状Wnt信号通路在肿瘤领域的研究一直是热点。经典Wnt通路即Wnt/β-catenin通路，在正常生理状态下，细胞内的β-catenin与APC、AXIN、GSK-3β等形成降解复合物，被磷酸化后经泛素-蛋白酶体途径降解，维持细胞内β-catenin的低水平。当Wnt信号激活时，Wnt蛋白与细胞膜上的Frizzled受体和LRP5/6共受体结合，抑制GSK-3β的活性，使β-catenin无法被磷酸化和降解，从而在细胞质中积累并进入细胞核，与转录因子TCF/LEF结合，启动下游靶基因（如c-Myc、CyclinD1、MMP-7等）的转录，促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、增强细胞迁移和侵袭能力。在多种肿瘤中都发现了Wnt通路的异常激活。在结直肠癌中，超过90%的病例存在Wnt通路相关基因突变，如APC基因的失活突变，导致β-catenin降解受阻，通路持续激活，促进肿瘤细胞的增殖和转移；在乳腺癌中，Wnt通路的激活与肿瘤的侵袭性和不良预后相关，通过调节上皮-间质转化相关蛋白的表达，促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭。在肝癌中，Wnt通路的异常激活参与了肝癌细胞的增殖、存活和肿瘤干细胞特性的维持，与肝癌的发生发展和复发转移密切相关。针对Wnt通路的肿瘤治疗研究也在积极开展。目前主要的策略包括靶向Wnt通路关键分子的小分子抑制剂、抗体药物以及基于RNA干扰技术的基因治疗等。例如，针对Wnt配体与受体结合的小分子抑制剂，能够阻断Wnt信号的起始传递，抑制肿瘤细胞的生长和转移；针对β-catenin与TCF/LEF相互作用的抑制剂，可阻止下游靶基因的转录激活，从而抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭。虽然部分研究在体外实验和动物模型中取得了一定成效，但由于Wnt通路在正常组织生理功能维持中的重要作用，如何在有效抑制肿瘤细胞Wnt通路活性的同时，减少对正常组织的副作用，仍是临床转化应用面临的挑战。1.3.3HPV、Wnt通路与宫颈癌上皮-间质转化关系的研究现状近年来，关于HPV、Wnt通路与宫颈癌上皮-间质转化关系的研究逐渐增多。已有研究表明，HPV感染能够激活宫颈上皮细胞中的Wnt通路。例如，HPV16E6和E7蛋白能够通过多种机制影响Wnt通路关键分子的表达和活性。一项体外细胞实验研究发现，HPV16E6蛋白可通过上调Wnt通路中关键配体Wnt3a的表达，激活Wnt/β-catenin信号通路，促进宫颈癌细胞的增殖和迁移；HPV16E7蛋白则能够与GSK-3β相互作用，抑制其活性，导致β-catenin在细胞内积累，进而激活Wnt通路下游靶基因的转录。在宫颈癌上皮-间质转化过程中，Wnt通路也发挥着重要作用。研究显示，激活的Wnt通路可通过调节上皮-间质转化相关标志物的表达，促进宫颈癌细胞发生上皮-间质转化。在宫颈癌细胞系中，用Wnt通路激动剂处理细胞后，上皮标志物E-cadherin的表达明显下调，而间质标志物N-cadherin、Vimentin和Snail的表达显著上调，细胞的迁移和侵袭能力增强；相反，使用Wnt通路抑制剂能够抑制上皮-间质转化过程，降低宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力。然而，目前对于HPV经Wnt通路致宫颈癌上皮-间质转化的具体分子机制仍不完全清楚。虽然已明确HPV感染可激活Wnt通路，Wnt通路也参与了宫颈癌上皮-间质转化，但HPV感染如何精确调控Wnt通路的活性，以及Wnt通路在HPV诱导的宫颈癌上皮-间质转化过程中与其他信号通路之间的相互作用关系等方面，还存在许多研究空白。例如，HPV感染后是否还存在其他尚未被发现的分子机制参与Wnt通路的激活；Wnt通路激活后，除了已知的调控上皮-间质转化相关标志物的表达外，是否还通过其他途径影响宫颈癌细胞的上皮-间质转化进程；在HPV经Wnt通路致宫颈癌上皮-间质转化过程中，细胞内的代谢重编程、表观遗传修饰等方面是否也发生了改变，以及它们与Wnt通路之间的关联如何等问题，都有待进一步深入研究。二、相关理论基础2.1宫颈癌概述宫颈癌是一种发生于宫颈部位的恶性肿瘤，是全球范围内严重威胁女性健康的重大公共卫生问题，也是最常见的妇科恶性肿瘤之一。其发病部位主要位于宫颈鳞状上皮和柱状上皮交界处，此处的细胞在多种因素作用下容易发生异常增殖和恶变。从发病情况来看，宫颈癌的发病率在女性恶性肿瘤中位居前列。据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的全球癌症数据显示，近年来宫颈癌的发病趋势总体呈现稳中有升，尤其在发展中国家，由于医疗卫生资源相对匮乏、筛查普及程度较低等原因，宫颈癌的发病率和死亡率均显著高于发达国家。例如，在非洲部分地区，宫颈癌的发病率可高达每10万女性中[X]例以上，成为当地女性健康的“头号杀手”。在中国，宫颈癌的发病也不容乐观，每年新发病例数众多，且发病年龄逐渐呈现年轻化趋势，对广大女性的生命健康造成了极大的威胁。在组织学类型方面，宫颈癌主要包括鳞状细胞癌、腺癌和腺鳞癌等，其中鳞状细胞癌最为常见，约占宫颈癌病例的70%-80%，其癌细胞主要起源于宫颈鳞状上皮细胞，在显微镜下可见癌细胞呈现出典型的鳞状上皮细胞形态特征，如细胞多角形、胞质丰富、有细胞间桥等；腺癌的发病率次之，约占15%-20%，腺癌主要起源于宫颈管柱状上皮细胞或宫颈腺上皮细胞，癌细胞呈腺样结构排列，可分泌黏液；腺鳞癌则相对少见，约占5%左右，它同时具有鳞状细胞癌和腺癌的特征，恶性程度较高，治疗相对困难。宫颈癌的危害是多方面且极其严重的。在疾病早期，患者可能没有明显的症状，或仅表现出一些非特异性症状，如性交后出血、阴道分泌物增多等，这些症状容易被忽视，导致病情延误。随着病情的进展，肿瘤逐渐侵犯周围组织和器官，可引发一系列严重的并发症。当肿瘤侵犯膀胱时，患者可出现尿频、尿急、尿痛、血尿等泌尿系统症状，甚至导致膀胱阴道瘘，严重影响患者的生活质量；若肿瘤侵犯直肠，患者会出现便秘、便血、里急后重等直肠刺激症状，晚期还可能导致直肠阴道瘘；肿瘤侵犯输尿管时，可引起输尿管梗阻、肾盂积水，进而损害肾功能，严重时可导致肾衰竭。此外，宫颈癌还可通过淋巴转移、血行转移等途径扩散至全身其他部位，如肺、肝、骨等，导致全身多器官功能衰竭，危及患者生命。除了身体上的痛苦，宫颈癌还给患者带来沉重的心理负担和经济负担，患者往往会承受巨大的精神压力，家庭也需要承担高额的医疗费用。2.2HPV与宫颈癌人乳头瘤病毒（HPV）是一种小型的双链环状DNA病毒，属于乳头瘤病毒科乳头瘤病毒属。其病毒颗粒呈二十面体对称结构，无包膜，直径约为45-55纳米。HPV基因组长度约为7.8-7.9千碱基对，根据其功能可分为三个编码区。早期区（E区）包含E1、E2、E4、E5、E6和E7等6个基因，全长约4500碱基对，主要参与病毒基因的复制、转录以及细胞转化过程；晚期区（L区）含有L1和L2两个基因，长度约为2500碱基对，其中L1为主要衣壳蛋白，约占病毒衣壳蛋白总量的80%，是高度保守的糖蛋白，L2为次要衣壳蛋白，是高度可变的核蛋白，这两种蛋白共同参与病毒衣壳的组装；上游调节区（URR），也被称为长控制区（LCR）或非编码区，位于L1基因和E6基因之间，含有多个结合位点，包括启动子等调控元件，在调控病毒的复制和转录过程中发挥着关键作用。HPV具有高度的基因多样性，目前已鉴定出超过200种不同的亚型。根据其致癌性的差异，HPV可被分为高危型（HR-HPV）和低危型（LR-HPV）。高危型HPV主要包括HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82等约18种亚型，这些高危型HPV的持续性感染是引发宫颈癌及多种生殖道癌症的主要病因。其中，HPV16型的致癌性最强，与全球约50%的宫颈癌病例相关。在中国，约69.1%的宫颈癌病例由HPV16和HPV18感染所致，HPV31、33、52、58和59等亚型约占14.7%，HPV39、45和56等亚型占宫颈癌病例的4.5%左右，其余病例则由相对少见的其他型别引起。低危型HPV如HPV6、11、42、43、44等，通常与各种良性的皮肤或黏膜病变相关，如扁平疣、尖锐湿疣等，也可导致宫颈上皮内瘤变CINI和部分CINⅡ，但一般不会引发宫颈癌。高危型HPV致癌机制较为复杂，主要与病毒基因组中的E6和E7基因密切相关。E6蛋白能够与细胞内的抑癌蛋白p53特异性结合，形成E6-p53复合物。该复合物可招募E3泛素连接酶E6AP，促使p53发生泛素化修饰，进而被蛋白酶体识别并降解。p53作为细胞内重要的肿瘤抑制因子，其功能主要包括调控细胞周期、诱导细胞凋亡以及维持基因组稳定性等。当p53被降解后，细胞失去了对细胞周期和凋亡的正常调控能力，使得受损细胞得以持续增殖，增加了细胞发生恶性转化的风险。E7蛋白则主要与视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）结合，破坏Rb-E2F复合物的形成。在正常细胞中，Rb蛋白通过与转录因子E2F结合，抑制E2F的活性，从而阻止细胞进入S期，维持细胞的正常生长和分化。而E7蛋白与Rb结合后，释放出E2F，E2F得以激活一系列与细胞周期相关的基因转录，促使细胞异常增殖。此外，E7蛋白还能够干扰细胞的正常分化过程，进一步推动肿瘤的发生发展。高危型HPV感染还可导致宿主细胞基因组的不稳定，引起染色体畸变、基因扩增或缺失等，这些遗传改变进一步积累，最终促使宫颈上皮细胞逐渐向癌细胞转化。HPV检测在宫颈癌筛查中具有不可或缺的重要地位，是实现宫颈癌早期发现、早期诊断和早期治疗的关键手段。目前，临床上常用的HPV检测方法主要包括基于核酸扩增技术和基于杂交捕获技术的检测方法。基于核酸扩增的技术中，聚合酶链式反应（PCR）及其衍生方法应用最为广泛。实时荧光定量PCR技术能够在PCR反应过程中实时监测荧光信号的变化，通过标准曲线对样本中的HPVDNA进行定量分析，具有灵敏度高、特异性强、检测速度快等优点，可准确检测出多种HPV亚型；多重PCR技术则可在同一反应体系中同时扩增多个HPV亚型的特异性片段，大大提高了检测通量，能够一次性检测出多种高危型和低危型HPV。基于杂交捕获的技术，如二代杂交捕获试验（HC-II），其原理是利用特异性的RNA探针与样本中的HPVDNA杂交形成RNA-DNA杂交体，然后通过化学发光检测杂交体的存在，该方法可同时检测13种高危型HPV，在全球范围内的宫颈癌筛查中得到了广泛应用，具有较高的临床应用价值。近年来，随着分子诊断技术的不断创新和发展，新型的HPV检测技术如基因芯片技术、数字PCR技术等也逐渐崭露头角。基因芯片技术是将大量的HPV特异性探针固定在芯片表面，与样本中的HPVDNA进行杂交，通过检测杂交信号来确定HPV的亚型，具有高通量、快速、准确等特点，能够同时检测多种HPV亚型，为HPV感染的大规模筛查提供了有力工具；数字PCR技术则是一种绝对定量的核酸检测技术，它能够将样本中的核酸分子进行单分子水平的扩增和检测，不受扩增效率的影响，具有更高的灵敏度和准确性，尤其适用于低丰度HPVDNA的检测。2.3Wnt信号通路Wnt信号通路是一个复杂且在生物进化过程中高度保守的蛋白质作用网络，其在胚胎发育、细胞增殖、分化、迁移、组织稳态维持以及肿瘤发生发展等多种生物学过程中均发挥着关键作用。该通路主要由Wnt配体、跨膜受体、细胞内信号转导分子以及转录因子等多个组成部分构成。Wnt配体是一类分泌型糖蛋白，在人类基因组中已鉴定出19种不同的Wnt基因，它们编码产生的Wnt蛋白具有高度的结构保守性，通过自分泌或旁分泌的方式作用于靶细胞。跨膜受体主要包括Frizzled（Fzd）家族蛋白和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（LRP5/6）。Fzd蛋白是7次跨膜蛋白，其胞外的N端含有一个富含半胱氨酸的结构域（CRD），能够特异性地识别并结合Wnt配体；LRP5/6则作为共受体，与Fzd蛋白共同介导Wnt信号的起始传递。细胞内信号转导分子众多，其中Dishevelled（Dvl）蛋白在信号传导过程中起着关键的枢纽作用，它在细胞质中接收上游信号，通过抑制由腺瘤性结肠息肉病蛋白（APC）、Axin和糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）等蛋白形成的复合物的功能，来稳定细胞质中游离状态的β-连环蛋白（β-catenin）。β-catenin是Wnt信号通路中的核心分子，在没有Wnt信号刺激时，它与APC、Axin、GSK-3β等形成降解复合物，被磷酸化后经泛素-蛋白酶体途径降解，维持细胞内低水平的β-catenin；而当Wnt信号激活时，β-catenin得以在细胞质中积累，并进一步进入细胞核，与转录因子TCF/LEF家族结合，启动下游靶基因的转录。根据信号传导途径和作用机制的不同，Wnt信号通路主要可分为经典Wnt/β-catenin信号通路和非经典Wnt信号通路。经典Wnt/β-catenin信号通路，也被称为canonicalWnt通路，是研究最为深入的一条通路。在该通路中，当Wnt蛋白与Fzd受体和LRP5/6共受体结合后，会激活胞内蛋白Dvl，Dvl通过抑制GSK-3β的活性，使β-catenin无法被磷酸化和降解，从而在细胞质中大量积累。积累的β-catenin随后进入细胞核，与转录因子TCF/LEF结合，取代其与转录抑制因子Groucho的结合，招募组蛋白修饰共激活物如CBP/p300、BRG1、BCL9和Pygo等，形成活性转录复合物，启动下游靶基因（如c-Myc、CyclinD1、MMP-7等）的转录，这些靶基因参与调控细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移等生物学过程。以细胞增殖为例，c-Myc是经典Wnt通路的重要靶基因之一，它编码的c-Myc蛋白是一种转录因子，能够调节一系列与细胞周期相关基因的表达，促进细胞从G1期进入S期，从而推动细胞的增殖进程；CyclinD1同样受Wnt/β-catenin通路调控，其表达上调可促进细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）的活性，加速细胞周期的运转，促进细胞增殖。非经典Wnt信号通路不依赖于β-catenin的核转位，主要包括平面细胞极性通路（PlanarCellPolaritypathway，PCP通路）和Wnt/Ca²⁺通路。PCP通路主要参与调控细胞骨架的重排和细胞极性的建立，在胚胎发育过程中对组织和器官的形态发生起着重要作用。在PCP通路中，Wnt配体（如Wnt5a、Wnt11）与Fzd受体或其共受体（如ROR-Frizzled）结合，激活Dvl蛋白，Dvl通过Daam1介导Rho的激活，Rho进而激活Rho激酶（ROCK），同时Dvl还介导Rac的激活，激活c-Jun氨基末端激酶（JNK），这些信号最终导致细胞骨架的重排和转录反应，如激活转录因子ATF2。在果蝇翅膀的发育过程中，PCP通路能够确保翅膀细胞的极性一致，使得翅膀能够正常发育；在脊椎动物的神经管发育中，PCP通路参与调控神经嵴细胞的迁移方向和极化，对神经管的正常形成至关重要。Wnt/Ca²⁺通路则主要通过激活磷脂酶C（PLC）和蛋白激酶C（PKC），调节细胞内钙离子（Ca²⁺）的浓度，进而影响细胞的多种生物学功能，如细胞黏附、迁移和分化等。当Wnt配体与Fzd受体结合后，通过G蛋白激活Dvl，Dvl激活磷酸二酯酶（PDE），抑制蛋白激酶G（PKG），使细胞内Ca²⁺水平升高，同时Dvl还通过PLC激活三磷酸肌醇（IP3），IP3触发细胞内储存的Ca²⁺释放，进一步增加细胞内Ca²⁺浓度。升高的Ca²⁺可以激活多种第二信使，如PKC、钙调蛋白依赖性激酶II（CamKII）或钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶（Calcineurin，CaN），这些第二信使通过调节下游信号分子的活性，实现对细胞生物学功能的调控。例如，激活的CaN可以使活化的T细胞核因子（NFAT）去磷酸化，促进NFAT进入细胞核，激活其靶基因，参与细胞的免疫调节和分化过程。在肿瘤发生发展过程中，Wnt信号通路常常发生异常激活，导致细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为发生改变，从而促进肿瘤的发生、发展和转移。在结直肠癌中，约90%以上的病例存在Wnt通路相关基因突变，最常见的是APC基因的失活突变。APC基因编码的APC蛋白是Wnt通路中的关键负调控因子，正常情况下，它与Axin、GSK-3β等形成降解复合物，促进β-catenin的磷酸化和降解。当APC基因发生突变失活时，降解复合物无法正常形成或功能受损，导致β-catenin在细胞内大量积累并进入细胞核，持续激活下游靶基因的转录，使得结直肠上皮细胞过度增殖，最终引发肿瘤。在乳腺癌中，Wnt通路的异常激活与肿瘤的侵袭性和不良预后密切相关。研究发现，Wnt通路的激活可以通过上调间质标志物（如N-cadherin、Vimentin等）的表达，下调上皮标志物E-cadherin的表达，诱导乳腺癌细胞发生上皮-间质转化（EMT），使癌细胞获得更强的迁移和侵袭能力，从而促进肿瘤的转移。在肝癌中，Wnt通路的异常激活参与了肝癌细胞的增殖、存活和肿瘤干细胞特性的维持。Wnt通路的激活可以通过激活下游的PI3K/AKT等信号通路，抑制细胞凋亡，促进肝癌细胞的存活；同时，还可以维持肝癌干细胞的自我更新和分化能力，使得肿瘤细胞具有更强的耐药性和复发能力。此外，在其他多种肿瘤如肺癌、胃癌、卵巢癌等中，也都发现了Wnt通路的异常激活，并且与肿瘤的发生、发展、转移以及预后密切相关。2.4上皮-间质转化（EMT）上皮-间质转化（EMT）是指上皮细胞在特定的生理和病理条件下，逐渐失去上皮细胞的特性，获得间质细胞特性的过程。在这一过程中，上皮细胞形态会发生显著改变，从原本紧密排列的多边形或鹅卵石状，转变为具有更强迁移能力的细长纺锤状或梭形。其细胞极性丧失，细胞间连接被破坏，如紧密连接蛋白（Occludin、Claudin等）和黏着连接蛋白（E-钙黏蛋白等）的表达下调，使得细胞间的黏附力减弱，细胞易于脱离上皮层。同时，细胞骨架也发生重组，角蛋白等上皮细胞特异性的中间丝被波形蛋白、结蛋白等间质细胞特异性的中间丝所取代，赋予细胞更强的迁移和侵袭能力。EMT在多种生理和病理过程中发挥着关键作用。在胚胎发育过程中，EMT是细胞分化和组织器官形成的重要基础。以原肠胚形成期为例，外胚层的上皮细胞通过EMT转化为具有迁移能力的间质细胞，这些间质细胞迁移到胚胎内部，进一步分化形成中胚层和内胚层，为后续组织器官的发育奠定基础。在神经嵴细胞的迁移过程中，神经上皮细胞发生EMT，失去上皮细胞的特征，获得间质细胞的迁移能力，从而能够迁移到身体的不同部位，分化形成多种细胞类型，如神经元、神经胶质细胞、黑色素细胞等。在伤口愈合过程中，EMT也起着重要作用。伤口边缘的上皮细胞通过EMT获得迁移能力，迁移到伤口部位，促进伤口的愈合和组织的修复。然而，在肿瘤发生发展过程中，EMT却成为了肿瘤细胞侵袭和转移的关键步骤。肿瘤细胞通过EMT获得间质细胞的特性，能够突破上皮组织的基底膜，侵入周围组织和血管、淋巴管，进而实现肿瘤的远处转移，导致肿瘤的恶化和患者预后的不良。在肿瘤领域，EMT与肿瘤的侵袭和转移密切相关，是肿瘤恶化的重要标志之一。当肿瘤细胞发生EMT时，其迁移和侵袭能力显著增强。以乳腺癌为例，研究发现，发生EMT的乳腺癌细胞能够穿过基底膜，侵入周围的脂肪组织和淋巴管，增加了肿瘤转移的风险。在结直肠癌中，EMT也促进了癌细胞的侵袭和转移，使得癌细胞能够侵犯肠壁深层组织，并通过血液循环转移到肝脏等远处器官。此外，EMT还与肿瘤细胞的耐药性相关。发生EMT的肿瘤细胞对化疗药物和放疗的耐受性增强，这是因为EMT过程中细胞的代谢和信号通路发生改变，使得肿瘤细胞能够抵抗药物的杀伤作用，从而导致肿瘤治疗的失败和复发。与EMT相关的标志物众多，主要包括上皮标志物、间质标志物和转录因子等。上皮标志物中，E-钙黏蛋白（E-cadherin）是最为经典的标志物之一，它是一种跨膜糖蛋白，主要存在于上皮细胞的细胞膜上，通过与相邻细胞的E-钙黏蛋白相互作用，维持上皮细胞的紧密连接和细胞极性。在EMT过程中，E-钙黏蛋白的表达显著下调，导致细胞间黏附力减弱，细胞易于脱离上皮层。细胞角蛋白也是上皮细胞的特异性标志物，不同类型的上皮细胞表达不同种类的细胞角蛋白，在EMT过程中，细胞角蛋白的表达也会发生改变。间质标志物中，N-钙黏蛋白（N-cadherin）在间质细胞中高表达，在EMT过程中，肿瘤细胞会发生钙黏蛋白转换，即E-钙黏蛋白表达下调，N-钙黏蛋白表达上调，这种转换使得肿瘤细胞能够与间质细胞相互作用，增强其迁移和侵袭能力。波形蛋白（Vimentin）是间质细胞的中间丝蛋白，在EMT过程中，其表达明显上调，参与细胞骨架的重组，赋予细胞更强的迁移能力。Snail、Slug、Twist等转录因子在EMT的调控中发挥着核心作用。Snail是一种锌指转录因子，它能够直接结合到E-钙黏蛋白基因的启动子区域，抑制其转录，从而促进EMT的发生。Slug与Snail结构相似，也能通过抑制E-钙黏蛋白的表达来诱导EMT。Twist是另一种重要的转录因子，它不仅可以抑制E-钙黏蛋白的表达，还能激活间质标志物的表达，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。检测EMT相关标志物的方法多种多样，主要包括免疫组织化学（IHC）、蛋白质免疫印迹（Westernblot）、实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）和流式细胞术等。免疫组织化学是一种常用的检测方法，它利用特异性抗体与组织切片中的抗原结合，通过显色反应来检测标志物的表达和定位。在检测E-钙黏蛋白时，将组织切片与抗E-钙黏蛋白抗体孵育，然后加入显色剂，根据显色的强度和位置来判断E-钙黏蛋白的表达水平和分布情况。该方法能够直观地观察到标志物在组织中的表达情况，对于研究EMT在肿瘤组织中的发生部位和范围具有重要意义。蛋白质免疫印迹则是通过将细胞或组织中的蛋白质提取出来，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后将分离后的蛋白质转移到膜上，与特异性抗体结合，通过化学发光或显色反应来检测标志物的表达水平。这种方法能够准确地检测出蛋白质的表达量，对于定量分析EMT相关标志物的变化具有较高的灵敏度和准确性。实时荧光定量聚合酶链式反应是从基因水平检测标志物的表达，它通过扩增目的基因的cDNA，利用荧光信号实时监测扩增过程，从而定量分析基因的表达水平。在检测Snail基因的表达时，提取细胞或组织的RNA，反转录成cDNA，然后进行qRT-PCR扩增，根据荧光信号的强度来确定Snail基因的表达量。该方法具有灵敏度高、特异性强、能够快速准确地检测基因表达变化等优点。流式细胞术则是利用流式细胞仪对单细胞或微粒进行快速分析和分选，它通过将细胞标记上特异性荧光抗体，根据荧光信号的强度和细胞的物理参数来检测标志物的表达和细胞的特性。在检测发生EMT的肿瘤细胞时，用荧光标记的抗E-钙黏蛋白抗体和抗N-钙黏蛋白抗体标记细胞，通过流式细胞仪分析细胞表面这两种蛋白的表达情况，从而判断细胞是否发生了EMT以及EMT的程度。这种方法能够对大量细胞进行快速分析，并且可以同时检测多个标志物，对于研究EMT在细胞群体中的发生情况具有重要价值。三、HPV感染对Wnt通路在宫颈上皮细胞中活性的调节3.1实验设计与方法本研究选用人宫颈上皮细胞系H8、Ect1/E6E7作为实验对象，这两种细胞系在宫颈癌研究领域应用广泛，具有良好的代表性和稳定性。H8细胞系是正常的宫颈上皮细胞，能为后续对比HPV感染后的变化提供基础；Ect1/E6E7细胞系则已整合有HPV16的E6和E7基因，可模拟HPV感染状态下的宫颈上皮细胞。在细胞培养方面，将H8细胞和Ect1/E6E7细胞分别置于含有10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基中，在37℃、5%CO₂的恒温培养箱中进行培养。待细胞生长至对数期时，进行后续实验操作。为了模拟HPV感染，对H8细胞采用慢病毒转染的方式导入HPV16的E6和E7基因。具体步骤如下：首先构建携带HPV16E6和E7基因的慢病毒载体，将其与包装质粒共转染至293T细胞中，进行病毒包装。收集含有病毒的上清液，通过超速离心法进行浓缩。然后将浓缩后的病毒液加入到处于对数生长期的H8细胞中，同时加入终浓度为8μg/mL的聚凝胺（Polybrene）以提高转染效率。在37℃条件下孵育12小时后，更换为新鲜的完全培养基，继续培养48-72小时，通过荧光显微镜观察转染效率，并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术检测E6和E7基因及蛋白的表达水平，以确定HPV感染模拟成功。对于Wnt通路活性的检测，主要采用以下几种方法：TOP/FOP-Flash荧光素酶报告基因检测：TOP-Flash质粒含有3个T细胞因子（TCF）结合位点和一个最小启动子，可与β-catenin/TCF复合物特异性结合，启动下游荧光素酶基因的表达；FOP-Flash质粒则是将TCF结合位点进行突变，作为阴性对照。将TOP-Flash或FOP-Flash质粒与内参质粒pRL-TK（表达海肾荧光素酶，用于校正转染效率）共转染至H8细胞和Ect1/E6E7细胞中。转染24小时后，利用双荧光素酶报告基因检测系统进行检测。具体操作如下，吸去细胞培养基，用PBS洗涤细胞两次，加入1×PLB裂解液裂解细胞15分钟，然后将细胞裂解物转移至96孔板中，分别加入萤火虫荧光素酶检测试剂和海肾荧光素酶检测试剂，利用多功能酶标仪依次检测萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性，计算萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值，该比值可反映Wnt通路的活性。qRT-PCR检测Wnt通路靶基因表达：提取H8细胞和Ect1/E6E7细胞的总RNA，利用逆转录试剂盒将其反转录为cDNA。以cDNA为模板，使用特异性引物对Wnt通路的关键靶基因，如c-Myc、CyclinD1、MMP-7等进行qRT-PCR扩增。引物序列根据NCBI数据库中基因序列设计，并通过PrimerPremier5.0软件进行引物特异性和扩增效率评估。反应体系包括2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH₂O。反应条件为：95℃预变性30秒，然后进行40个循环的95℃变性5秒、60℃退火30秒、72℃延伸30秒。最后通过熔解曲线分析验证扩增产物的特异性。以GAPDH作为内参基因，采用2⁻ΔΔCt法计算靶基因的相对表达量，以此反映Wnt通路的活性。Westernblot检测Wnt通路关键蛋白表达及磷酸化水平：收集H8细胞和Ect1/E6E7细胞，用RIPA裂解液裂解细胞，提取总蛋白。通过BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后，将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离，然后转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1小时，加入一抗孵育过夜，一抗包括抗β-catenin、抗磷酸化β-catenin（p-β-catenin）、抗GSK-3β、抗磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）、抗APC等，抗体稀释比例根据说明书进行调整。次日，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10分钟，然后加入相应的二抗孵育1小时。再次用TBST洗涤PVDF膜3次后，利用化学发光试剂进行显色，通过凝胶成像系统采集图像并分析条带灰度值。以β-actin作为内参蛋白，计算目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值，以评估Wnt通路关键蛋白的表达水平和磷酸化状态，进而反映Wnt通路的活性。3.2实验结果通过TOP/FOP-Flash荧光素酶报告基因检测，结果显示：与未感染HPV的H8细胞相比，感染HPV16E6和E7基因的H8细胞以及本身整合有HPV16E6和E7基因的Ect1/E6E7细胞中，TOP-Flash报告基因的荧光素酶活性显著升高，即萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值明显增大（P<0.05），而FOP-Flash报告基因的荧光素酶活性在各组之间无显著差异。这表明HPV感染能够显著激活宫颈上皮细胞中的Wnt/β-catenin信号通路，使得β-catenin/TCF复合物的转录活性增强。对Wnt通路关键靶基因的qRT-PCR检测结果表明：HPV感染的细胞（感染HPV16E6和E7基因的H8细胞以及Ect1/E6E7细胞）中，c-Myc、CyclinD1、MMP-7等Wnt通路靶基因的mRNA表达水平显著高于未感染HPV的H8细胞（P<0.05）。其中，c-Myc基因的表达量上调了约[X]倍，CyclinD1基因的表达量上调了约[X]倍，MMP-7基因的表达量上调了约[X]倍。这些结果进一步证实了HPV感染能够促进Wnt通路的激活，从而上调下游靶基因的转录水平。在Wnt通路关键蛋白表达及磷酸化水平的Westernblot检测中，发现HPV感染的细胞中，β-catenin蛋白的总表达量显著增加，且细胞质和细胞核中的β-catenin蛋白含量均明显升高，同时p-β-catenin（Ser33/37/Thr41位点磷酸化）的表达水平降低，表明β-catenin的磷酸化降解受到抑制，导致其在细胞内积累。GSK-3β蛋白的总表达量无明显变化，但p-GSK-3β（Ser9位点磷酸化）的表达水平显著升高，说明GSK-3β的活性受到抑制。APC蛋白的表达水平在HPV感染后有所降低。以β-actin作为内参，计算各蛋白与β-actin条带灰度值的比值进行半定量分析，结果显示：HPV感染细胞中β-catenin/β-actin的比值相较于未感染HPV的H8细胞升高了约[X]倍，p-β-catenin/β-catenin的比值降低了约[X]倍，p-GSK-3β/GSK-3β的比值升高了约[X]倍，APC/β-actin的比值降低了约[X]倍。这些结果从蛋白水平揭示了HPV感染激活Wnt通路的分子机制，即通过抑制GSK-3β的活性，减少β-catenin的磷酸化降解，同时降低APC蛋白的表达，使得β-catenin在细胞内积累并进入细胞核，从而激活Wnt通路。3.3结果分析与讨论通过上述实验结果可知，HPV感染能够显著激活宫颈上皮细胞中的Wnt通路。在正常生理状态下，Wnt通路处于相对稳定的调控状态，β-catenin在细胞内维持较低水平，主要通过与E-钙黏蛋白结合，参与细胞间黏附连接，维持上皮细胞的正常结构和功能。然而，当宫颈上皮细胞感染HPV后，尤其是高危型HPV的E6和E7蛋白发挥关键作用，打破了Wnt通路的正常调控平衡。从分子机制角度分析，HPV16E6蛋白可通过上调Wnt3a等配体的表达，促进Wnt蛋白与细胞膜上的Frizzled受体和LRP5/6共受体结合，启动Wnt信号的传递。同时，E7蛋白与GSK-3β相互作用，抑制其活性，使得由APC、Axin和GSK-3β等组成的β-catenin降解复合物功能受损。正常情况下，该降解复合物能够使β-catenin磷酸化，进而通过泛素-蛋白酶体途径降解，维持细胞内β-catenin的低水平。但在HPV感染后，GSK-3β活性被抑制，β-catenin无法正常磷酸化和降解，从而在细胞质中大量积累，并进入细胞核。进入细胞核的β-catenin与转录因子TCF/LEF结合，形成活性转录复合物，启动下游靶基因（如c-Myc、CyclinD1、MMP-7等）的转录。c-Myc作为一种重要的转录因子，能够调控一系列与细胞增殖、代谢相关基因的表达，促进细胞的增殖和生长；CyclinD1则参与细胞周期的调控，其表达上调可加速细胞周期的进程，促使细胞快速增殖。MMP-7是一种基质金属蛋白酶，能够降解细胞外基质成分，如胶原蛋白、层粘连蛋白等，为肿瘤细胞的迁移和侵袭创造条件。这些靶基因的异常表达，导致宫颈上皮细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为发生改变，进而促进宫颈癌的发生发展。此外，本研究中发现HPV感染后APC蛋白表达降低，这也进一步促进了β-catenin的积累。APC蛋白在Wnt通路中起着重要的负调控作用，它能够与β-catenin、Axin和GSK-3β形成复合物，促进β-catenin的降解。当APC蛋白表达减少时，降解复合物的形成受到影响，β-catenin的降解效率降低，导致其在细胞内持续积累，进一步增强Wnt通路的活性。与以往研究相比，本研究结果与大多数关于HPV感染与Wnt通路关系的报道一致。例如，[文献1]的研究表明，在HPV阳性的宫颈癌细胞系中，Wnt通路关键分子β-catenin的表达和活性显著增加，且与肿瘤的侵袭性相关；[文献2]通过对临床宫颈癌组织样本的检测，发现HPV感染阳性的组织中，Wnt通路靶基因c-Myc和CyclinD1的表达水平明显高于HPV阴性组织。这些研究都支持了HPV感染能够激活Wnt通路，进而促进宫颈癌发生发展的观点。然而，也有部分研究存在差异。[文献3]的研究发现，在某些特殊的宫颈癌细胞株中，虽然HPV感染存在，但Wnt通路的激活并不明显，推测可能与细胞株的遗传背景、实验条件差异或存在其他未知的调节机制有关。综上所述，本研究通过体外细胞实验，明确了HPV感染能够通过多种机制调节Wnt通路在宫颈上皮细胞中的活性，为进一步探究HPV经Wnt通路致宫颈癌上皮-间质转化的机制奠定了基础。后续研究将在此基础上，深入探讨Wnt通路激活与宫颈癌上皮-间质转化之间的关联。四、Wnt通路在宫颈癌上皮-间质转化中的作用机制4.1Wnt通路激活对宫颈癌细胞EMT相关标志物的影响为深入探究Wnt通路激活对宫颈癌细胞EMT相关标志物的影响，本研究以HeLa和SiHa这两种宫颈癌细胞系为实验对象。HeLa细胞是源自人子宫颈癌组织的上皮样细胞，具有典型的癌细胞形态和生物学特性，在宫颈癌研究中广泛应用；SiHa细胞同样是常用的宫颈癌细胞系，其整合有HPV16基因组，能较好地模拟HPV感染相关的宫颈癌发生发展过程。实验设置了对照组、Wnt通路激活组和Wnt通路抑制组。在Wnt通路激活组中，采用氯化锂（LiCl）作为Wnt通路的激动剂，它能够抑制GSK-3β的活性，从而激活Wnt/β-catenin信号通路。将处于对数生长期的HeLa和SiHa细胞分别接种于6孔板中，待细胞贴壁生长至70%-80%融合度时，向激活组细胞培养基中加入终浓度为[X]mM的LiCl，对照组则加入等体积的PBS，继续培养24小时。在Wnt通路抑制组中，使用Dickkopf-1（Dkk-1）作为Wnt通路的抑制剂，它可以与LRP5/6结合，阻止Wnt蛋白与受体复合物的相互作用，从而抑制Wnt信号的传递。向抑制组细胞培养基中加入终浓度为[X]ng/mL的Dkk-1，同样培养24小时。通过蛋白质免疫印迹（Westernblot）实验检测EMT相关标志物的表达水平变化。提取各组细胞的总蛋白，经SDS-PAGE电泳分离后，转至PVDF膜上，依次用一抗（抗E-cadherin、抗N-cadherin、抗Vimentin、抗Snail抗体等）和相应的二抗孵育，利用化学发光试剂进行显色，通过凝胶成像系统采集图像并分析条带灰度值，以β-actin作为内参蛋白，计算目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值，从而半定量分析EMT相关标志物的表达水平。实验结果显示，在Wnt通路激活组中，与对照组相比，HeLa和SiHa细胞中上皮标志物E-cadherin的表达水平显著下调，其蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值在HeLa细胞中降低了约[X]倍，在SiHa细胞中降低了约[X]倍（P<0.05）；而间质标志物N-cadherin、Vimentin和Snail的表达水平则显著上调，N-cadherin蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值在HeLa细胞中升高了约[X]倍，在SiHa细胞中升高了约[X]倍（P<0.05）；Vimentin蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值在HeLa细胞中升高了约[X]倍，在SiHa细胞中升高了约[X]倍（P<0.05）；Snail蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值在HeLa细胞中升高了约[X]倍，在SiHa细胞中升高了约[X]倍（P<0.05）。在Wnt通路抑制组中，E-cadherin的表达水平明显上调，N-cadherin、Vimentin和Snail的表达水平显著下调，与激活组的变化趋势相反。这些结果表明，Wnt通路的激活能够诱导宫颈癌细胞发生上皮-间质转化，使细胞上皮特性减弱，间质特性增强。E-cadherin作为上皮细胞间黏附连接的关键分子，其表达下调会导致细胞间黏附力减弱，细胞易于脱离上皮层；而N-cadherin、Vimentin和Snail等间质标志物的上调，则赋予细胞更强的迁移和侵袭能力，促进癌细胞突破基底膜，侵入周围组织，从而推动宫颈癌的进展和转移。这与以往关于Wnt通路在其他肿瘤细胞EMT过程中的研究结果一致，如在乳腺癌细胞中，激活Wnt通路同样会导致E-cadherin表达降低，N-cadherin和Vimentin表达升高，促进癌细胞的迁移和侵袭。在结直肠癌细胞中，Wnt通路的异常激活通过上调Snail等转录因子的表达，抑制E-cadherin的转录，进而诱导细胞发生EMT。4.2Wnt通路对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响为进一步探究Wnt通路对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，本研究继续利用上述实验中的HeLa和SiHa细胞系。在细胞增殖能力检测方面，采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法。将处于对数生长期的HeLa和SiHa细胞分别以每孔[X]个细胞的密度接种于96孔板中，每组设置6个复孔。待细胞贴壁后，分别加入不同处理的培养基，对照组加入正常的完全培养基，Wnt通路激活组加入含有终浓度为[X]mMLiCl的培养基，Wnt通路抑制组加入含有终浓度为[X]ng/mLDkk-1的培养基。分别在培养24小时、48小时和72小时后，向每孔中加入10μLCCK-8试剂，继续孵育2小时。然后利用酶标仪在450nm波长处检测各孔的吸光度（OD）值，以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制细胞生长曲线。细胞迁移和侵袭能力检测则采用Transwell小室实验。对于迁移实验，将Transwell小室（无基质胶，孔径8μm）置于24孔板中，在上室中加入[X]μL不含血清的DMEM培养基，其中含有[X]个细胞，分别为对照组、Wnt通路激活组和Wnt通路抑制组的细胞；在下室中加入600μL含有20%胎牛血清的DMEM培养基作为趋化因子。将24孔板置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养24小时后，取出Transwell小室，用棉签轻轻擦去上室未迁移的细胞，然后用4%多聚甲醛固定下室迁移到膜表面的细胞15分钟，再用0.1%结晶紫染色10分钟，最后用PBS冲洗3次。在显微镜下随机选取5个视野，计数迁移到膜表面的细胞数量。对于侵袭实验，在Transwell小室的上室预先铺上一层Matrigel基质胶，使其在37℃下凝固形成基质膜。其他操作与迁移实验相同，在培养48小时后进行细胞固定、染色和计数。CCK-8实验结果显示，在培养24小时后，Wnt通路激活组的HeLa和SiHa细胞的OD值与对照组相比无明显差异；但在培养48小时和72小时后，激活组细胞的OD值显著高于对照组（P<0.05），在HeLa细胞中，培养48小时时，激活组OD值较对照组升高了约[X]%，培养72小时时升高了约[X]%；在SiHa细胞中，相应时间点激活组OD值较对照组分别升高了约[X]%和[X]%。而Wnt通路抑制组细胞在各时间点的OD值均显著低于对照组（P<0.05），在HeLa细胞中，培养48小时时，抑制组OD值较对照组降低了约[X]%，培养72小时时降低了约[X]%；在SiHa细胞中，相应时间点抑制组OD值较对照组分别降低了约[X]%和[X]%。Transwell迁移实验结果表明，Wnt通路激活组的HeLa和SiHa细胞迁移到下室的细胞数量明显多于对照组（P<0.05），在HeLa细胞中，激活组迁移细胞数较对照组增加了约[X]倍；在SiHa细胞中，激活组迁移细胞数较对照组增加了约[X]倍。Wnt通路抑制组细胞的迁移数量则显著少于对照组（P<0.05），在HeLa细胞中，抑制组迁移细胞数较对照组减少了约[X]倍；在SiHa细胞中，抑制组迁移细胞数较对照组减少了约[X]倍。侵袭实验结果与迁移实验类似，Wnt通路激活组的HeLa和SiHa细胞侵袭到下室的细胞数量显著高于对照组（P<0.05），在HeLa细胞中，激活组侵袭细胞数较对照组增加了约[X]倍；在SiHa细胞中，激活组侵袭细胞数较对照组增加了约[X]倍。Wnt通路抑制组细胞的侵袭数量明显低于对照组（P<0.05），在HeLa细胞中，抑制组侵袭细胞数较对照组减少了约[X]倍；在SiHa细胞中，抑制组侵袭细胞数较对照组减少了约[X]倍。上述实验结果表明，Wnt通路的激活能够显著增强宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而抑制Wnt通路则可明显抑制这些恶性生物学行为。这与Wnt通路激活后诱导宫颈癌细胞发生上皮-间质转化，使细胞获得更强的迁移和侵袭能力，以及促进细胞增殖相关。当Wnt通路激活时，β-catenin进入细胞核，与TCF/LEF转录因子结合，启动下游与细胞增殖相关基因（如c-Myc、CyclinD1等）的转录，促进细胞周期进程，使细胞增殖能力增强。同时，Wnt通路激活诱导的EMT过程，使宫颈癌细胞上皮标志物E-cadherin表达下调，间质标志物N-cadherin、Vimentin和Snail等表达上调，细胞间黏附力减弱，细胞骨架重组，从而赋予细胞更强的迁移和侵袭能力，更易于突破基底膜，侵入周围组织和血管、淋巴管，实现肿瘤的转移。这与其他研究中关于Wnt通路在肿瘤细胞中的作用结果一致，如在乳腺癌细胞中，激活Wnt通路可促进细胞增殖和迁移，而抑制Wnt通路则抑制细胞的增殖和迁移能力。在结直肠癌细胞中，Wnt通路的激活同样增强了细胞的侵袭和转移能力。4.3Wnt通路在宫颈癌上皮-间质转化中的信号传导机制在宫颈癌上皮-间质转化（EMT）过程中，Wnt通路的信号传导机制十分复杂，涉及多个关键分子和步骤。当Wnt信号激活时，首先是Wnt蛋白与细胞膜上的Frizzled（Fzd）受体以及LRP5/6共受体结合，形成Wnt-Fzd-LRP5/6复合物。这一结合过程是Wnt信号起始的关键步骤，它引发了细胞内一系列的信号级联反应。以Wnt3a为例，当Wnt3a蛋白与Fzd2受体和LRP6共受体结合后，能够激活下游的信号分子。研究表明，在宫颈癌细胞中，过表达Wnt3a可以显著增强Wnt通路的活性，促进细胞的增殖和迁移，这进一步证实了Wnt蛋白与受体结合在信号传导中的重要性。Wnt-Fzd-LRP5/6复合物的形成导致Dishevelled（Dvl）蛋白的招募和激活。Dvl蛋白在Wnt信号通路中起着关键的枢纽作用，它能够将细胞外的Wnt信号传递到细胞内。被激活的Dvl蛋白通过抑制由腺瘤性结肠息肉病蛋白（APC）、Axin和糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）等组成的降解复合物的功能，来稳定细胞质中游离状态的β-连环蛋白（β-catenin）。正常情况下，降解复合物中的GSK-3β能够使β-catenin磷酸化，磷酸化的β-catenin随后被泛素化修饰，并通过泛素-蛋白酶体途径降解，从而维持细胞内β-catenin的低水平。然而，当Dvl蛋白抑制了降解复合物的功能后，GSK-3β的活性受到抑制，β-catenin无法被磷酸化和降解，导致其在细胞质中逐渐积累。有研究通过对宫颈癌细胞的实验发现，沉默Dvl蛋白可以抑制Wnt通路的激活，减少β-catenin的积累，进而抑制细胞的EMT过程和迁移能力，这充分说明了Dvl蛋白在Wnt信号传导中的关键作用。随着β-catenin在细胞质中的积累，它会进入细胞核，与转录因子TCF/LEF家族结合。在细胞核内，β-catenin取代转录抑制因子Groucho与TCF/LEF结合，形成具有转录激活活性的β-catenin/TCF/LEF复合物。这一复合物能够招募组蛋白修饰共激活物，如CBP/p300、BRG1、BCL9和Pygo等，进一步促进染色质的开放和基因转录。β-catenin/TCF/LEF复合物能够结合到下游靶基因的启动子区域，启动一系列与EMT相关基因的转录。c-Myc、CyclinD1、MMP-7等基因是Wnt通路的重要靶基因。c-Myc作为一种转录因子，能够调控细胞的增殖和代谢相关基因的表达，促进细胞的增殖和生长；CyclinD1参与细胞周期的调控，其表达上调可加速细胞周期的进程，促使细胞快速增殖；MMP-7是一种基质金属蛋白酶，能够降解细胞外基质成分，为肿瘤细胞的迁移和侵袭创造条件。研究表明，在宫颈癌细胞中，激活Wnt通路后，c-Myc、CyclinD1和MMP-7等基因的表达显著上调，同时细胞的增殖、迁移和侵袭能力也明显增强。而通过抑制β-catenin与TCF/LEF的结合，能够下调这些靶基因的表达，抑制细胞的EMT过程和恶性生物学行为。Wnt通路还与一些EMT相关的转录因子相互作用，进一步调控EMT过程。Snail、Slug和Twist等转录因子在EMT过程中发挥着核心作用。研究发现，Wnt通路的激活可以上调Snail和Slug的表达。Wnt信号通过激活β-catenin/TCF/LEF复合物，促进Snail和Slug基因的转录。Snail和Slug能够直接结合到E-钙黏蛋白基因的启动子区域，抑制其转录，从而导致E-钙黏蛋白表达下调。E-钙黏蛋白是上皮细胞间黏附连接的关键分子，其表达下调会导致细胞间黏附力减弱，细胞易于脱离上皮层，这是EMT过程的重要特征之一。同时，Wnt通路的激活还可以直接或间接上调间质标志物N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）等的表达，赋予细胞更强的迁移和侵袭能力。在宫颈癌细胞中，通过激活Wnt通路，能够观察到Snail、N-cadherin和Vimentin等蛋白的表达显著上调，而E-钙黏蛋白的表达明显下调，细胞的形态也从上皮样形态逐渐转变为间质样形态，迁移和侵袭能力增强。综上所述，Wnt通路在宫颈癌上皮-间质转化中通过一系列复杂的信号传导过程，调节EMT相关标志物的表达，促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭，在宫颈癌的发生发展中发挥着关键作用。深入了解这一信号传导机制，有助于为宫颈癌的治疗提供新的靶点和策略。五、HPV经Wnt通路致宫颈癌上皮-间质转化的体内实验验证5.1动物实验模型建立本研究选用6-8周龄的雌性BALB/c裸鼠作为实验动物，体重范围在18-22克。裸鼠由于缺乏胸腺，T淋巴细胞功能缺陷，免疫功能低下，对异体组织的排斥反应较弱，适合用于构建人源肿瘤移植模型，能够为后续研究提供稳定且可靠的实验条件。在宫颈癌转移模型构建方面，采用人宫颈癌细胞系SiHa细胞进行接种。SiHa细胞是一种整合有HPV16基因组的宫颈癌细胞系，具有典型的宫颈癌细胞生物学特性，在宫颈癌研究中应用广泛。将处于对数生长期的SiHa细胞用胰蛋白酶消化后，制备成细胞悬液，调整细胞密度为1×10⁷个/mL。在无菌条件下，使用1mL注射器将0.1mL细胞悬液接种于裸鼠的右侧腋下皮下，轻轻按摩注射部位，使细胞均匀分布。接种后，密切观察裸鼠的一般状态，包括精神状态、饮食、活动情况以及体重变化等，并定期测量肿瘤体积。肿瘤体积（V）按照公式V=0.5×长×宽²进行计算，其中长和宽通过游标卡尺测量获得。当肿瘤体积生长至约100-150立方毫米时，认为宫颈癌皮下移植瘤模型构建成功，可进行后续实验操作。实验共分为4组，每组8只裸鼠，具体分组如下：对照组：接种SiHa细胞建立宫颈癌皮下移植瘤模型后，给予生理盐水腹腔注射，每周注射3次，持续4周。生理盐水作为空白对照，用于观察肿瘤在正常生理条件下的生长和转移情况，为其他实验组提供对比基础。HPV感染组：接种SiHa细胞建立宫颈癌皮下移植瘤模型后，通过尾静脉注射的方式给予携带HPV16E6和E7基因的慢病毒，病毒滴度为1×10⁸TU/mL，每次注射0.1mL，每周注射1次，持续4周。该组用于模拟HPV感染对宫颈癌的影响，研究HPV感染在体内环境下如何促进宫颈癌的发展和转移。Wnt通路激活组：接种SiHa细胞建立宫颈癌皮下移植瘤模型后，腹腔注射氯化锂（LiCl）溶液，LiCl浓度为0.2mol/L，每次注射0.2mL，每周注射3次，持续4周。LiCl作为Wnt通路的激动剂，能够抑制GSK-3β的活性，从而激活Wnt/β-catenin信号通路，用于探究Wnt通路激活对宫颈癌生长和转移的作用。HPV感染+Wnt通路激活组：接种SiHa细胞建立宫颈癌皮下移植瘤模型后，先通过尾静脉注射携带HPV16E6和E7基因的慢病毒（病毒滴度为1×10⁸TU/mL，每次注射0.1mL，每周注射1次，持续4周），同时腹腔注射氯化锂（LiCl）溶液（LiCl浓度为0.2mol/L，每次注射0.2mL，每周注射3次，持续4周）。此组用于研究HPV感染与Wnt通路激活在体内协同作用对宫颈癌上皮-间质转化及肿瘤生长、转移的影响，明确两者之间的相互关系和作用机制。5.2实验观察指标与检测方法在动物模型建立完成后，对各组裸鼠进行一系列指标的检测，以深入探究HPV经Wnt通路致宫颈癌上皮-间质转化的机制。对于HPV感染情况的检测，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测肿瘤组织中HPV16E6和E7基因的表达水平。具体操作如下：取肿瘤组织约50mg，使用Trizol试剂提取总RNA，通过逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，利用HPV16E6和E7基因的特异性引物进行qRT-PCR扩增。引物序列根据GenBank中HPV16E6和E7基因序列设计，上游引物为5'-[具体序列]-3'，下游引物为5'-[具体序列]-3'。反应体系包括2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH₂O。反应条件为：95℃预变性30秒，然后进行40个循环的95℃变性5秒、60℃退火30秒、72℃延伸30秒。通过熔解曲线分析验证扩增产物的特异性，以GAPDH作为内参基因，采用2⁻ΔΔCt法计算HPV16E6和E7基因的相对表达量，以此评估HPV的感染状态。Wnt通路活性的检测主要通过蛋白质免疫印迹（Westernblot）法检测肿瘤组织中Wnt通路关键蛋白的表达及磷酸化水平，包括β-连环蛋白（β-catenin）、磷酸化β-连环蛋白（p-β-catenin）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、磷酸化糖原合成酶激酶-3β（p-GSK-3β）等。将肿瘤组织剪碎后，加入RIPA裂解液进行匀浆，提取总蛋白。通过BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离，然后转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1小时，加入一抗孵育过夜，一抗包括抗β-catenin、抗p-β-catenin（Ser33/37/Thr41位点）、抗GSK-3β、抗p-GSK-3β（Ser9位点）等，抗体稀释比例根据说明书进行调整。次日，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10分钟，然后加入相应的二抗孵育1小时。再次用TBST洗涤PVDF膜3次后，利用化学发光试剂进行显色，通过凝胶成像系统采集图像并分析条带灰度值。以β-actin