单元三抗生素类药物的发酵生产项目二青霉素的发酵生产任务二青

单元三抗生素类药物的发酵生产项目二青霉素的发酵生产

任务二青霉素的发酵生产斜面米孢子种子罐发酵罐过滤萃取脱色结晶干燥冷冻干燥孢子工业盐成品青霉素生产工艺流程

青霉素发酵生产流程图1.生产流程2.种子制备

种子制备阶段包括孢子培养和种子培养两个过程，孢子培养以产生丰富的孢子为目的，而种子培养以繁殖大量健壮的菌丝体（种子罐培养）为主要目的。（1）生产孢子的制备将砂土孢子用甘油、葡萄糖和蛋白胨组成的培养基进行斜面培养后，移到大米或小米固体培养基上，于25℃培养7天，孢子成熟后进行真空干燥，并以这种形式低温保存备用。（2）生产种子的制备一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝。培养基：葡萄糖、乳糖、玉米浆等。接种量：每吨培养基不少于200亿孢子温度：（27±1）℃；通气量：1：3（体积比）；搅拌转速：300-350r/min；培养时间：40h左右（2）生产种子的制备二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖。培养基：葡萄糖、玉米浆等。接种量：10%；温度：（25±1）℃；空气流量：1:（1-5）；搅拌转速：250-280r/min；培养时间：10-14h，种子质量要求：菌丝稠密，菌丝团很少，菌丝粗壮，有中小空胞，处在第Ⅲ～Ⅳ期。3.培养基（1）碳源青霉菌能利用多种碳源如乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、天然油脂等。乳糖能被产生菌缓慢利用而维持青霉素分泌的有利条件，故为最佳碳源，但因货源少、价格高，普遍使用有困难。天然油脂如玉米油、豆油也能被缓慢利用作为有效的碳源，但不可能大规模使用。目前，普遍采用淀粉经酶水解的葡萄糖糖化液（DE值50％以上）进行流加。(2)氮源青霉素工业发酵中，可选用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或麸子粉，并补加无机氮源。玉米浆是淀粉生产的副产品，含精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等多种氨基酸和β-苯乙胺，所以是青霉素发酵的最佳氮源。国产量少，而产品质量也不稳定，国内青霉素工业发酵中少用，国外用量较大。花生饼粉作为青霉素发酵的氮源，要调整配方，且装料系数会受影响，但生产水平可以达到用玉米浆的技术指标。国内生产上采用的氮源是花生饼粉。此外，麸皮粉、玉米胚芽粉和尿素也在生产中使用。(3)无机盐主要包括硫、磷、钙、镁、钾等盐类。这些无机离子的浓度对青霉菌的生长和青霉素的生物合成均有影响：①硫的浓度降低时，青霉素产量减少至30%；②磷的浓度降低时，青霉素的产量减少50%；③培养基中碳酸钙主要起缓冲pH的作用；④钙、镁、钾等阳离子总浓度控制在300mmol/L为好，其中的比例为钾30%，钙20%，镁41%，这种条件下，青霉素的产量最高；⑤三价铁离子对青霉素生物合成有显著影响，一般发酵液中铁离子超过30～40μg/ml，则发酵单位增长缓慢。(4)前体种类：苯乙酸及其衍生物，

苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等青霉菌可将前体直接结合到产物分子中，也可作为养料和能源利用，毒性：抑制细胞生长和青霉素合成。发酵液中前体浓度始终维持在0.l%为宜。苯乙酸对发酵有影响，一般以苯乙酰胺较好。(4)前体前体的氧化pH：苯乙酸被菌体氧化的速率，随培养基的pH值上升而增加。菌龄：年轻的菌丝不氧化前体，而仅利用它来构成青霉素分子。随着菌龄的增大，氧化能力渐渐增加。培养基成分：培养基成分对前体的氧化程度有较大影响，合成培养基比复合培养基对前体的氧化量少。策略：低浓度流加时期：合成阶段操作变量要求水平操作变量要求水平发酵罐容积150～200m3发酵液pH值6.5～6.9装料率80%初始菌丝浓度1～2kg（干重）/m3输入机械功率2～4kW/m3补料液中葡萄糖浓度约500kg/m3空气流量30～60m3/（m3∙h）葡萄糖流加率1.0～2.5kg/（m3∙h）空气压力（表压）0.2MPa发酵液中铵氮浓度0.25～0.3kg/m3罐压（表压）0.035～0.07MPa发酵液中前体浓度1kg/m3液相体积传氧系数200h-1发酵液中溶氧浓度>30%饱和度发酵液温度25℃发酵周期180～220h青霉素发酵的一般工艺要求4.发酵工艺控制（1）补料的影响及控制在分批发酵中，常常因为前期基质浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏（或抑制）或对菌丝生长产生抑制（如葡萄糖和铵的阻遏或抑制，苯乙酸的生长抑制），而后期基质浓度低，限制了菌丝生长和产物合成。为了避免这一现象，在青霉素发酵中通常采用分批补料操作法，即对容易产生阻遏、抑制和限制作用的基质（葡萄糖、胺、苯乙酸等）进行缓慢流加，以维持一定的最适浓度。青霉素发酵过程中的补料主要包括碳源物质、氮源物质、前体等。①葡萄糖的流加：加糖的依据是发酵液中的残糖量及pH值，最好是根据排气中CO2及O2量来控制。一般在残糖降至0.6％左右，pH值上升时开始加糖。一般要求是，如果加糖后pH值高于要求时，可增加加糖量；pH值低于要求时，要减少加糖量。

②氮源的补充：在发酵60～70h后，补加氮源也可以提高发酵单位。如分次补给硫酸铵，可以延长发酵周期，提高青霉素的产量。③前体：在基础料中添加前体0.07%，当发酵单位上升到2500U/ml时开始补充前体，一般4h补充一次。发酵液中苯乙酸的浓度不超过0.1%为宜；残余的苯乙酰胺浓度在0.05%～0.08%为准。④在发酵过程中与料液一起补入表面活性剂如新洁尔灭，或聚氧乙烯、山梨糖醇酐、单油酸酯、单月桂酸酯和三油酸酯等非离子表面活性剂也能增加青霉素的产量。⑤在青霉素发酵过程中加入少量可溶性高分子化合物如聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、聚二乙胺或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）能使青霉素产率增加38%。最适pH6.5－6.9左右，避免超过7.0，青霉素在碱性条件下不稳定，易水解pH值过高，可加糖、硫酸或无机氮源；pH值较低可加入CaCO3、氢氧化钠、氨或尿素，也可提高通气量。补糖来控制pH值比用酸、碱来调节好（2）pH值的影响及控制青霉菌生长适宜温度27℃，合成适宜温度20℃变温控制，不同阶段不同温度生长阶段：较高温度，缩短生长时间生产阶段：适当降低温度，以利于青霉素合成（3）温度的影响及控制＜30％饱和氧浓度，产率急剧下降＜10％饱和氧浓度，造成不可逆的损害临界溶氧浓度：30％发酵前期主要是菌丝生长，搅拌速度应高些，发酵中、后期降低转速不但能节约电能消耗，而且有利于青霉素的合成、分泌。发酵罐的搅拌速度一般以1