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药物分离与纯化技术课程电泳技术--SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术大纲1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳操作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术

SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后，使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。（一）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术SDS（十二烷基磺酸钠）能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键，破坏蛋白质的高级结构使其变性为松散的线状。SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质－SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同，长轴与蛋白质分子量成正比。（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理蛋白质—SDS复合物在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。两者关系：蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理

将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率，即可在标准曲线上求得分子量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术操作：即变性及非变性）1.制胶:（变性：buffer（电泳缓冲液）中加0.4%SDS）

a.分离胶：根据待分离样品的分子大小，选择一定浓度的分离胶，配制分离胶溶液：（丙烯酰胺:亚甲基双丙烯酰胺溶液）Acr:Bis=29:1，分离胶buffer,过硫酸铵（AP），四甲基乙二胺（TEMED），水。迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5h聚合完全。

b.浓缩胶：用浓缩胶buffer。插上梳子。（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳操作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术2.样品制备：

a.PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）:样品＋样品缓冲液（蔗糖或甘油＋指示剂溴酚蓝）

b.SDS:样品＋样品缓冲液（SDS，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝），煮沸2~5min，以除去亚稳态聚合。（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳特点SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术3.加样及电泳：

SDS:电极buffer（缓冲液）中加0.1%SDS，溴酚蓝距下端1cm时停止电泳。（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳特点SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术4.固定及染色a.固定

将凝胶浸于7％乙酸或12.5％TCA中固定蛋白质组分。b.染色

常用方法有考马斯亮蓝染色法、银染法（灵敏度比前者高100倍）其它的染色方法：氨基黑、阿尔辛蓝，过碘酸－Schiff

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