促血管生成素 -1 对糖尿病鼠肾TSP -1和PEDF的调控机制与肾脏保护作用研究

促血管生成素-1对糖尿病鼠肾TSP-1和PEDF的调控机制与肾脏保护作用研究一、引言1.1研究背景糖尿病肾病（DiabeticNephropathy，DN）作为糖尿病最为常见且严重的微血管并发症之一，已成为糖尿病患者致残与致死的关键因素。近年来，随着全球糖尿病患者数量的急剧攀升，DN的发病率也呈显著上升趋势。据统计，在糖尿病患者中，DN的发病率约为20%-40%，在一些国家或地区，DN甚至已跃居终末期肾病（End-StageRenalDisease，ESRD）病因的首位。我国的情况同样不容乐观，DN的发病率持续上升，目前已成为ESRD的第二位原因，仅次于各种肾小球肾炎。一旦DN发展至ESRD阶段，患者不仅需要承受巨大的身心痛苦，还面临着沉重的经济负担，其治疗难度也远高于其他肾脏疾病。因此，深入探究DN的发病机制，寻找有效的防治措施，已成为当今医学领域亟待解决的重要课题。目前认为，DN的发病机制极为复杂，是遗传因素与长期高血糖等环境因素相互作用的结果。在这一过程中，肾小球血流量、肾小球滤过率及压力增加，肾组织缺血、缺氧，蛋白非酶糖基化，多元醇途径活化及氧化应激等多种异常情况相继出现，且长期存在，最终导致肾小球系膜基质及基底膜合成增加同时降解减少，引发DN。尽管对DN发病机制的研究已取得了一定进展，但仍有许多未知领域有待探索，尤其是在细胞因子和信号通路方面，其具体作用机制尚不完全明确。促血管生成素-1（Angiopoietin-1，Ang-1）作为血管生成素家族的重要成员，在血管生成、血管稳定及维持血管内皮细胞功能等方面发挥着关键作用。正常生理状态下，Ang-1通过与受体酪氨酸激酶Tie2结合，激活一系列下游信号通路，促进血管内皮细胞的存活、增殖和迁移，同时抑制血管通透性，维持血管的正常结构和功能。在糖尿病肾病中，肾脏血管系统发生明显的病理改变，包括肾小球毛细血管基底膜增厚、血管内皮细胞损伤、血管通透性增加等，这些改变均与Ang-1的表达和功能异常密切相关。已有研究表明，在糖尿病肾病动物模型和患者中，肾脏组织中Ang-1的表达水平明显降低，且其表达水平与疾病的严重程度呈负相关。这提示Ang-1可能在糖尿病肾病的发生发展过程中扮演着重要角色，其表达异常或许是导致肾脏血管病变的关键因素之一。血小板反应蛋白-1（Thrombospondin-1，TSP-1）是一种多功能的细胞外基质糖蛋白，在体内广泛表达。TSP-1具有抑制血管生成、调节细胞增殖和凋亡、促进细胞黏附和迁移等多种生物学功能。在肾脏中，TSP-1主要由肾小管上皮细胞、肾间质成纤维细胞及浸润入肾组织的巨噬细胞等分泌。研究发现，在糖尿病肾病的病理过程中，TSP-1的表达显著上调。高血糖状态可通过多种信号通路诱导肾脏细胞分泌TSP-1增加，而TSP-1的过度表达又可通过抑制血管内皮细胞的增殖和迁移，诱导内皮细胞凋亡，从而抑制肾脏血管的生成，进一步加重肾脏缺血、缺氧，促进糖尿病肾病的发展。此外，TSP-1还可通过调节细胞外基质的合成和降解，促进肾小球系膜细胞的增殖和基质积聚，导致肾小球硬化和肾小管间质纤维化。因此，TSP-1在糖尿病肾病的发病机制中具有重要作用，其异常表达可能是糖尿病肾病进展的重要推动因素。色素上皮衍生因子（PigmentEpithelium-DerivedFactor，PEDF）是一种高效的内源性血管生成抑制因子，同时具有神经营养保护、调节血管通透性等多种生物学活性。PEDF主要由视网膜色素上皮细胞分泌，在眼、中枢神经系统、肝脏、肾脏等多种组织中均有表达。在糖尿病肾病中，PEDF的表达明显减少。研究表明，PEDF可通过抑制血管内皮生长因子（VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF）的表达和活性，阻断VEGF与其受体的结合，从而抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成，发挥其抗血管生成作用。此外，PEDF还可抑制转化生长因子-β1（TransformingGrowthFactor-β1，TGF-β1）和结缔组织生长因子（ConnectiveTissueGrowthFactor，CTGF）的表达，减少细胞外基质的合成和积聚，抑制肾小球系膜细胞的增殖和纤维化，从而对糖尿病肾病起到保护作用。因此，PEDF表达的减少可能导致糖尿病肾病患者肾脏血管生成异常和纤维化加重，在糖尿病肾病的发生发展中具有重要意义。综上所述，Ang-1、TSP-1和PEDF在糖尿病肾病的发病机制中均具有重要作用，它们之间可能存在着复杂的相互作用关系，共同影响着糖尿病肾病的发生发展。深入研究它们在糖尿病肾病中的作用及相互关系，对于揭示糖尿病肾病的发病机制，寻找新的治疗靶点，具有重要的理论意义和临床价值。1.2研究目的与意义本研究旨在通过建立糖尿病肾病大鼠模型，深入探讨促血管生成素-1（Ang-1）对糖尿病鼠肾中血小板反应蛋白-1（TSP-1）和色素上皮衍生因子（PEDF）表达的影响，从而进一步揭示糖尿病肾病的发病机制，为临床治疗糖尿病肾病提供新的理论依据和潜在治疗靶点。糖尿病肾病作为糖尿病常见且严重的微血管并发症，严重威胁着患者的生命健康。目前，尽管对糖尿病肾病的治疗取得了一定进展，但仍缺乏有效的根治方法。因此，深入研究糖尿病肾病的发病机制，寻找新的治疗靶点和干预措施，具有重要的临床意义。Ang-1、TSP-1和PEDF在糖尿病肾病的发生发展过程中均发挥着重要作用。然而，它们之间的相互作用关系以及在糖尿病肾病中的具体调控机制尚未完全明确。通过本研究，有望揭示Ang-1与TSP-1、PEDF之间的内在联系，为阐明糖尿病肾病的发病机制提供新的视角。同时，本研究结果可能为糖尿病肾病的治疗提供新的靶点和策略，具有潜在的临床应用价值。此外，本研究对于丰富血管生成和肾脏疾病相关的基础理论知识也具有一定的学术意义，有助于推动相关领域的进一步发展。二、相关理论基础2.1糖尿病肾病概述2.1.1糖尿病肾病的定义与发病机制糖尿病肾病是糖尿病最常见且严重的微血管并发症之一，是由于糖尿病代谢异常引发的肾小球硬化，并伴有尿蛋白增加、肾功能进行性减退的一种疾病。糖尿病肾病的发病机制十分复杂，是多因素共同作用的结果，至今尚未完全明确。以下将从高血糖、代谢紊乱、血流动力学改变、氧化应激、遗传因素等多个方面对其发病机制进行阐述。高血糖作为糖尿病肾病发病的始动因素，在糖尿病肾病的发生发展过程中起着关键作用。长期高血糖状态可通过多种途径导致肾脏损伤。一方面，高血糖可使肾脏局部糖代谢异常，激活多元醇通路。该通路中，葡萄糖在醛糖还原酶的作用下转化为山梨醇，山梨醇不能自由通过细胞膜，在细胞内大量堆积，导致细胞内渗透压升高，细胞肿胀、变性，最终引起肾脏细胞损伤。另一方面，高血糖还可促使蛋白非酶糖基化反应增强，产生大量糖化终末产物（AdvancedGlycationEnd-products，AGEs）。AGEs可与肾脏组织中的多种蛋白质结合，形成不可逆的交联产物，改变蛋白质的结构和功能。这些交联产物可沉积在肾小球基底膜、系膜区及肾小管间质等部位，导致肾小球基底膜增厚、系膜基质增多、肾小管间质纤维化，从而影响肾脏的正常功能。此外，AGEs还可与细胞表面的特异性受体（ReceptorforAdvancedGlycationEnd-products，RAGE）结合，激活细胞内的信号转导通路，如核因子-κB（NuclearFactor-κB，NF-κB）通路等，诱导炎症因子、细胞因子及生长因子等的表达增加，进一步加重肾脏的炎症反应和损伤。代谢紊乱在糖尿病肾病的发病机制中也起着重要作用。糖尿病患者常伴有脂质代谢紊乱，表现为血脂异常，如甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇升高，高密度脂蛋白胆固醇降低。血脂异常可通过多种机制导致肾脏损伤。氧化低密度脂蛋白（OxidizedLow-DensityLipoprotein，ox-LDL）具有细胞毒性作用，可直接损伤血管内皮细胞，促进单核细胞和巨噬细胞的浸润，引发炎症反应。ox-LDL还可刺激系膜细胞增殖，促进细胞外基质合成增加，导致肾小球硬化。此外，脂质代谢紊乱还可通过影响肾脏血流动力学、激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统（Renin-Angiotensin-AldosteroneSystem，RAAS）等途径，间接加重肾脏损伤。血流动力学改变是糖尿病肾病发病的重要机制之一。在糖尿病早期，由于血糖升高，肾脏为了维持正常的代谢功能，会出现肾小球高灌注、高压力和高滤过的“三高”状态。这种血流动力学改变可使肾小球毛细血管内皮细胞受损，通透性增加，导致蛋白质滤过增加，出现微量白蛋白尿。随着病情的进展，肾小球高灌注、高压力和高滤过持续存在，可引起肾小球系膜细胞增生、系膜基质增多，最终导致肾小球硬化和肾功能减退。此外，血流动力学改变还可通过激活RAAS，使血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）生成增加，进一步加重肾脏的血流动力学异常和损伤。氧化应激在糖尿病肾病的发生发展过程中也发挥着重要作用。糖尿病患者体内由于高血糖、高血脂等因素的影响，可产生大量的活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS），如超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等。这些ROS可通过多种途径导致肾脏损伤。ROS可直接损伤细胞膜、蛋白质和核酸等生物大分子，引起细胞功能障碍和凋亡。ROS还可激活NF-κB等信号通路，诱导炎症因子、细胞因子及生长因子等的表达增加，促进炎症反应和纤维化进程。此外，氧化应激还可通过抑制抗氧化酶的活性，如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等，进一步加重体内的氧化应激状态，形成恶性循环，导致肾脏损伤不断加重。遗传因素在糖尿病肾病的发病中也起着一定的作用。研究表明，糖尿病肾病具有一定的家族聚集性，遗传因素在糖尿病肾病的易感性中占20%-40%。目前已发现多个与糖尿病肾病相关的基因，如血管紧张素原基因、血管紧张素转换酶基因、醛糖还原酶基因等。这些基因的多态性可影响肾脏对糖尿病损伤的易感性和反应性，从而参与糖尿病肾病的发病过程。然而，遗传因素在糖尿病肾病发病中的具体作用机制仍有待进一步深入研究。除上述因素外，炎症反应、细胞因子、生长因子等在糖尿病肾病的发病机制中也具有重要作用。炎症反应可导致肾脏组织的免疫损伤，促进糖尿病肾病的发展。多种细胞因子和生长因子，如转化生长因子-β1、血管内皮生长因子、结缔组织生长因子等，可通过调节细胞增殖、分化、凋亡及细胞外基质合成等过程，参与糖尿病肾病的病理生理过程。这些因素相互作用、相互影响，共同促进了糖尿病肾病的发生发展。2.1.2糖尿病肾病的病理特征与临床表现糖尿病肾病的病理特征具有一定的特异性，主要表现为肾脏肥大、肾小球基底膜增厚、系膜基质增多、肾小球硬化以及肾小管间质纤维化等。在糖尿病肾病早期，肾脏体积可增大，表现为肾脏肥大。这是由于高血糖等因素刺激肾脏细胞增殖和肥大，导致肾脏重量增加。随着病情的进展，肾小球基底膜逐渐增厚。肾小球基底膜主要由Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白等组成，高血糖状态下，这些成分的合成增加且结构发生改变，导致基底膜增厚。增厚的肾小球基底膜可使肾小球滤过屏障功能受损，蛋白质滤过增加，从而出现蛋白尿。系膜基质增多也是糖尿病肾病的重要病理特征之一。系膜细胞在糖尿病肾病的发生发展过程中起着关键作用，高血糖、细胞因子等因素可刺激系膜细胞增殖，并合成和分泌大量的细胞外基质，如胶原、纤维连接蛋白等，导致系膜基质增多。系膜基质的增多可进一步压迫肾小球毛细血管，影响肾小球的血流灌注和滤过功能。肾小球硬化是糖尿病肾病晚期的典型病理改变，可分为结节性肾小球硬化和弥漫性肾小球硬化两种类型。结节性肾小球硬化表现为肾小球系膜区出现圆形或椭圆形的结节状病变，又称Kimmelstiel-Wilson结节，主要由系膜基质和糖化的蛋白质组成。弥漫性肾小球硬化则表现为肾小球系膜基质广泛增多，肾小球毛细血管袢受压、闭塞，最终导致肾小球荒废。肾小管间质纤维化在糖尿病肾病的进展中也起着重要作用。肾小管上皮细胞在高血糖、氧化应激等因素的作用下，可发生损伤、凋亡和转分化，转化为肌成纤维细胞，分泌大量的细胞外基质，导致肾小管间质纤维化。肾小管间质纤维化可使肾小管萎缩，间质炎症细胞浸润，进一步加重肾功能损害。糖尿病肾病的临床表现多种多样，早期通常无明显症状，随着病情的进展，可逐渐出现蛋白尿、水肿、高血压、肾功能减退等症状。蛋白尿是糖尿病肾病最早出现的临床表现之一，也是诊断糖尿病肾病的重要依据。早期多表现为微量白蛋白尿，即尿白蛋白排泄率在30-300mg/24h之间，此时尿常规检查蛋白常为阴性。随着病情的进展，尿白蛋白排泄率逐渐增加，可发展为大量白蛋白尿，即尿白蛋白排泄率>300mg/24h，此时尿常规检查蛋白可呈阳性。蛋白尿的出现不仅提示肾脏损伤的存在，还与糖尿病肾病的进展密切相关，大量蛋白尿可加速肾功能的恶化。水肿也是糖尿病肾病常见的临床表现之一，多发生在大量蛋白尿之后。由于大量蛋白质从尿中丢失，导致血浆白蛋白水平降低，血浆胶体渗透压下降，水分从血管内进入组织间隙，从而引起水肿。早期水肿多为眼睑和下肢轻度水肿，随着病情的加重，可逐渐发展为全身性水肿。此外，水肿还可能与肾脏排泄水钠功能障碍、RAAS激活等因素有关。高血压在糖尿病肾病患者中也较为常见，且血压升高的程度与糖尿病肾病的进展密切相关。高血压可进一步加重肾脏的血流动力学异常和损伤，促进糖尿病肾病的发展。糖尿病肾病患者的高血压发生机制较为复杂，主要与RAAS激活、水钠潴留、交感神经系统兴奋、血管内皮功能障碍等因素有关。肾功能减退是糖尿病肾病的最终结局，随着病情的进展，肾小球硬化和肾小管间质纤维化不断加重，肾脏的滤过和排泄功能逐渐受损，导致肾功能减退。早期肾功能减退可表现为肾小球滤过率（GlomerularFiltrationRate，GFR）轻度下降，血肌酐和尿素氮水平正常。随着病情的恶化，GFR进行性下降，血肌酐和尿素氮水平逐渐升高，最终可发展为终末期肾病，需要进行肾脏替代治疗，如血液透析、腹膜透析或肾移植。除上述典型临床表现外，糖尿病肾病患者还可能出现其他一些症状，如贫血、电解质紊乱、酸碱平衡失调等。贫血主要是由于肾脏分泌促红细胞生成素减少，导致红细胞生成不足所致。电解质紊乱和酸碱平衡失调则与肾脏排泄功能障碍有关，可表现为高钾血症、低钙血症、高磷血症、代谢性酸中毒等。这些并发症的出现不仅会进一步加重患者的病情，还会增加患者的死亡风险。2.2促血管生成素-1（Ang-1）2.2.1Ang-1的结构与功能促血管生成素-1（Ang-1）是血管生成素家族的重要成员，其基因定位于人类染色体8q22-23。Ang-1是一种分泌型糖蛋白，由498个氨基酸组成，相对分子质量约为70kDa。从结构上看，Ang-1包含一个N-末端的螺旋结构域、一个卷曲螺旋结构域、一个纤维连接蛋白Ⅲ型重复结构域和一个C-末端的球状结构域。N-末端的螺旋结构域在Ang-1的二聚化过程中发挥关键作用，通过形成二聚体，Ang-1能够更有效地与受体结合，从而发挥其生物学功能。卷曲螺旋结构域则参与了Ang-1与其他蛋白质的相互作用，进一步调节其生物学活性。纤维连接蛋白Ⅲ型重复结构域赋予了Ang-1一定的结构稳定性，使其在复杂的生物环境中能够保持正常的功能。C-末端的球状结构域是Ang-1与受体酪氨酸激酶Tie2结合的关键部位，二者的特异性结合是激活下游信号通路的前提。在血管生成过程中，Ang-1发挥着至关重要的作用。当机体需要生成新的血管时，如在胚胎发育、组织修复和肿瘤生长等过程中，Ang-1被分泌到细胞外环境中。Ang-1通过其C-末端的球状结构域与内皮细胞表面的受体Tie2特异性结合，使Tie2发生自身磷酸化。磷酸化的Tie2进而激活一系列下游信号通路，如PI3K/Akt、MAPK等。这些信号通路的激活能够促进血管内皮细胞的存活、增殖和迁移。在存活方面，激活的信号通路可以抑制细胞凋亡相关蛋白的表达，增强细胞的抗凋亡能力，从而保证内皮细胞在血管生成过程中的存活。在增殖方面，信号通路能够促进细胞周期相关蛋白的表达，推动内皮细胞进入细胞周期，进行增殖。在迁移方面，信号通路可以调节细胞骨架的重组，使内皮细胞能够伸出伪足，向血管生成的部位迁移。此外，Ang-1还能召集周细胞和平滑肌细胞等血管周围支持细胞，使其与血管内皮细胞相互作用，形成稳定的血管结构。周细胞和平滑肌细胞可以分泌细胞外基质，为血管提供支撑和保护，同时还能调节血管的收缩和舒张功能，进一步维持血管的稳定性。除了在血管生成中的作用外，Ang-1还对维持血管内皮细胞的稳定具有重要意义。正常生理状态下，血管内皮细胞之间通过紧密连接和黏附连接等结构相互作用，形成一个完整的屏障，阻止血液中的物质和细胞随意进入组织间隙。Ang-1可以通过调节这些连接蛋白的表达和功能，维持血管内皮细胞之间的紧密连接。例如，Ang-1能够促进紧密连接蛋白如ZO-1、Occludin和Claudin等的表达，增强内皮细胞之间的连接强度，从而降低血管的通透性。此外，Ang-1还可以抑制炎症因子诱导的内皮细胞活化，减少白细胞的黏附和渗出，进一步维持血管内皮细胞的稳定。当血管受到损伤或炎症刺激时，Ang-1的表达会增加，通过上述机制迅速修复受损的血管内皮，恢复血管的正常功能。2.2.2Ang-1在肾脏生理与病理中的作用在正常肾脏生理状态下，Ang-1对于维持肾脏血管的正常结构和功能起着不可或缺的作用。肾脏是一个血管丰富的器官，肾小球毛细血管网络和肾小管周围毛细血管网络共同构成了复杂的肾脏血管系统，这些血管对于维持肾脏的正常血液灌注和物质交换至关重要。Ang-1主要由肾脏的系膜细胞、肾小管上皮细胞和血管平滑肌细胞等产生。在肾小球中，Ang-1通过与内皮细胞表面的Tie2受体结合，激活下游信号通路，促进肾小球毛细血管内皮细胞的存活和增殖，维持肾小球毛细血管的正常结构和完整性。同时，Ang-1还能召集周细胞围绕在肾小球毛细血管周围，增强血管的稳定性。周细胞与内皮细胞之间通过细胞间连接和旁分泌信号相互作用，共同调节肾小球的血流动力学和滤过功能。在肾小管周围，Ang-1同样能够促进肾小管周围毛细血管内皮细胞的存活和功能维持，保证肾小管对物质的重吸收和分泌功能正常进行。此外，Ang-1还可以调节肾脏血管的通透性，防止蛋白质等大分子物质从血管内漏出到组织间隙，维持肾脏内环境的稳定。在糖尿病肾病的病理过程中，Ang-1的表达和功能发生了显著变化。大量研究表明，在糖尿病肾病动物模型和患者的肾脏组织中，Ang-1的表达水平明显降低。这种降低可能是由于多种因素导致的，如高血糖、氧化应激、炎症反应等。高血糖状态下，肾脏细胞内的代谢紊乱，可通过多种信号通路抑制Ang-1基因的转录和翻译，从而减少Ang-1的合成。氧化应激产生的大量活性氧物质可以损伤细胞内的DNA、蛋白质和脂质等生物大分子，影响Ang-1的合成和分泌过程。炎症反应中释放的多种炎症因子，如肿瘤坏死因子-α（TumorNecrosisFactor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）等，也可以抑制Ang-1的表达。Ang-1表达的降低会导致肾脏血管生成障碍和血管稳定性下降。在血管生成方面，由于Ang-1减少，其对血管内皮细胞存活、增殖和迁移的促进作用减弱，导致肾脏新血管生成减少，肾脏缺血、缺氧加重。在血管稳定性方面，Ang-1的不足使得周细胞与内皮细胞之间的相互作用减弱，血管壁的结构变得不稳定，血管通透性增加，蛋白质等大分子物质更容易从血管内漏出到组织间隙，进一步加重肾脏损伤。此外，Ang-1表达的降低还可能通过影响其他细胞因子和信号通路，间接促进糖尿病肾病的发展。例如，Ang-1可以调节TGF-β1等细胞因子的表达，当Ang-1减少时，TGF-β1的表达可能会增加，从而促进肾小球系膜细胞的增殖和细胞外基质的合成，导致肾小球硬化和肾小管间质纤维化。因此，Ang-1在糖尿病肾病的发生发展过程中可能起着关键的调节作用，其表达异常或许是糖尿病肾病进展的重要因素之一。2.3血小板反应蛋白-1（TSP-1）2.3.1TSP-1的生物学特性血小板反应蛋白-1（TSP-1）是一种多功能的细胞外基质糖蛋白，在细胞生物学过程中发挥着关键作用。从结构上看，人类TSP-1基因定位于15q15，其编码的蛋白分子量约为450kD，是由三条相同肽链以二硫键构成的同源三聚体。在透射电镜下观察，该三聚体的每条单链均由球状的氨基末端、球状的羧基末端构成，中间通过细长且易弯曲的杆状臂相连。TSP-1的每条肽链可进一步细分为6个功能区，这些功能区赋予了TSP-1多样的生物学功能。NH2-末端肝素结合区，此区域能够与肝素硫酸盐等物质结合，参与细胞与细胞外基质之间的相互作用。与Ⅰ型前胶原同源的片断，这部分结构可能在维持TSP-1的整体结构稳定性以及与其他细胞外基质成分的相互作用中发挥作用。与备解素同源含3个重复序列的Ⅰ型重复区，该区域参与TSP-1与多种受体和配体的结合，进而影响细胞的黏附、迁移等过程。与表皮生长因子同源含3个重复序列的Ⅱ型重复区，这一区域可能在调节细胞生长和分化方面发挥作用。与钙调素同源含7个结合Ca2+的重复序列的Ⅲ型重复区，包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列。RGD序列是细胞黏附的关键识别位点，许多细胞表面的整合素受体能够识别并结合RGD序列，从而介导细胞与TSP-1的黏附，进而影响细胞的迁移、增殖和分化等生物学行为。COOH-末端细胞结合区，该区域与细胞表面的特定受体结合，进一步调节细胞的功能。TSP-1通过这些功能区结合位点与多种受体相互作用，如calreticulin、LDL受体相关蛋白质（LRP）、CD36、整合素和整合素相关蛋白（IAP）等。与CD36受体结合后，TSP-1可以调节细胞的脂质代谢和炎症反应。当TSP-1与CD36结合时，能够激活细胞内的特定信号通路，影响脂质转运蛋白的表达和活性，从而调节细胞对脂质的摄取、代谢和储存。在炎症反应中，TSP-1与CD36的结合可以调节炎症细胞的黏附和迁移，影响炎症介质的释放，进而对炎症过程产生调控作用。TSP-1与整合素的相互作用则在细胞黏附和迁移过程中发挥重要作用。整合素是一类细胞表面受体，能够与细胞外基质中的多种成分结合。TSP-1通过与整合素结合，为细胞提供了黏附的位点，促进细胞在细胞外基质上的黏附。同时，这种结合还可以激活细胞内的信号传导通路，调节细胞骨架的重组，从而促进细胞的迁移。在胚胎发育过程中，TSP-1在心脏、肺、肝、肾、骨骼、骨骼肌和脑等组织中的表达水平较高，对组织和器官的正常发育起到了重要的调控作用。在心脏发育过程中，TSP-1参与了心脏血管的形成和心肌细胞的分化。研究表明，TSP-1基因敲除的小鼠在胚胎期会出现心脏血管发育异常，心肌细胞排列紊乱等现象，严重影响心脏的正常功能。在肾脏发育过程中，TSP-1对肾小球和肾小管的形成和分化具有重要意义。它可以调节肾脏细胞的增殖、迁移和分化，促进肾小球毛细血管的形成和肾小管上皮细胞的成熟。在正常成人组织中，TSP-1的分布相对较少，但在炎症和损伤过程中，其表达会大量增加。当组织受到炎症刺激时，巨噬细胞、成纤维细胞等细胞会分泌大量的TSP-1。TSP-1可以通过调节炎症细胞的活性和炎症介质的释放，参与炎症反应的调控。在组织损伤修复过程中，TSP-1可以促进成纤维细胞的增殖和迁移，促进细胞外基质的合成和沉积，从而有助于伤口的愈合。2.3.2TSP-1在糖尿病肾病中的作用机制在糖尿病肾病的发生发展过程中，TSP-1的表达出现显著变化，且发挥着重要的作用。研究表明，在糖尿病肾病状态下，高血糖、氧化应激、炎症反应等多种因素共同作用，导致肾脏组织中TSP-1的表达明显上调。高血糖是糖尿病肾病的重要始动因素，长期的高血糖环境可通过多种信号通路诱导TSP-1的表达增加。高血糖可激活蛋白激酶C（ProteinKinaseC，PKC）信号通路。PKC被激活后，可磷酸化一系列下游底物，其中包括一些转录因子，如激活蛋白-1（ActivatorProtein-1，AP-1）。AP-1等转录因子可结合到TSP-1基因的启动子区域，促进TSP-1基因的转录，从而增加TSP-1的合成。高血糖还可通过激活多元醇通路，使细胞内山梨醇堆积，导致细胞内渗透压升高，引起细胞损伤和功能改变，进而诱导TSP-1的表达增加。氧化应激在糖尿病肾病中也起着关键作用，高血糖等因素可导致体内活性氧（ROS）生成增加，引发氧化应激。ROS可以损伤细胞内的DNA、蛋白质和脂质等生物大分子，同时也可以激活一系列信号通路，如丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-ActivatedProteinKinase，MAPK）信号通路等。MAPK信号通路的激活可促进TSP-1基因的表达，导致TSP-1合成增加。炎症反应也是糖尿病肾病的重要病理过程，炎症因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等的释放可刺激肾脏细胞分泌TSP-1增加。TNF-α可以与肾脏细胞表面的受体结合，激活核因子-κB（NF-κB）信号通路，NF-κB进入细胞核后，可调节TSP-1基因的转录，使其表达上调。TSP-1表达上调对糖尿病肾病的发展产生了多方面的影响，其中对肾脏纤维化的促进作用尤为显著。TSP-1可以通过多种机制促进肾小球系膜细胞的增殖和细胞外基质的合成。TSP-1可与肾小球系膜细胞表面的整合素等受体结合，激活细胞内的信号传导通路，如PI3K/Akt信号通路。PI3K被激活后，可使Akt磷酸化，活化的Akt可以促进细胞周期蛋白的表达，推动系膜细胞进入细胞周期，从而促进系膜细胞的增殖。TSP-1还可以调节转化生长因子-β1（TGF-β1）的活性。TGF-β1是一种强效的促纤维化细胞因子，TSP-1可以与TGF-β1结合，使其从无活性的前体形式转变为有活性的形式，从而增强TGF-β1的生物学效应。活性的TGF-β1可以刺激系膜细胞合成和分泌大量的细胞外基质成分，如胶原、纤维连接蛋白等，导致系膜基质增多，促进肾小球硬化和肾小管间质纤维化。TSP-1还可以抑制基质金属蛋白酶（MatrixMetalloproteinases，MMPs）的活性，MMPs是一类能够降解细胞外基质的酶。TSP-1通过抑制MMPs的活性，减少细胞外基质的降解，进一步加重细胞外基质的积聚，促进肾脏纤维化的发展。TSP-1在糖尿病肾病中的炎症反应调节中也发挥着重要作用。TSP-1可以调节炎症细胞的黏附和迁移。它可以与炎症细胞表面的受体结合，如CD36等，促进炎症细胞与血管内皮细胞的黏附，使其更容易穿过血管壁进入肾脏组织。TSP-1还可以调节炎症介质的释放。研究发现，TSP-1可以促进炎症细胞分泌炎症因子，如TNF-α、IL-1β等，进一步加重肾脏的炎症反应。在糖尿病肾病中，炎症反应的加重会导致肾脏组织的损伤加剧，促进疾病的进展。TSP-1还可以通过调节免疫细胞的功能，影响糖尿病肾病的免疫病理过程。它可以调节T淋巴细胞和B淋巴细胞的活性，影响免疫球蛋白的分泌，从而对肾脏的免疫损伤产生影响。2.4色素上皮衍生因子（PEDF）2.4.1PEDF的生物学特性色素上皮衍生因子（PEDF）是一种多功能的分泌型糖蛋白，在体内发挥着广泛而重要的生物学作用。1989年，Tombran-Tink等首次在人胎儿视网膜色素上皮细胞的培养液中发现了PEDF，因其能够诱导视网膜母细胞瘤细胞Y-79向成熟的神经元分化而得名。从分子结构来看，人PEDF基因定位于17号染色体短臂末端，基因全长16kb，由8个外显子和7个内含子组成。PEDF由418个氨基酸残基构成，相对分子量约为50kDa。其结构属于丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpin）基因家族，虽具有该家族典型的蛋白酶敏感的环状结构，但却不具备类似其他丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制蛋白水解酶活性的功能。这种独特的结构赋予了PEDF特殊的生物学活性。在组织分布方面，PEDF具有广泛的分布特性。在胚胎发育过程中，胎儿的视网膜色素上皮颗粒、发育中的锥细胞以及许多神经节细胞层的细胞均有PEDF的表达。在成年个体中，PEDF在中枢神经系统、眼、肝脏、睾丸、卵巢、胎盘、胰腺、前列腺等多种组织中均有表达。在眼部，PEDF主要由视网膜色素上皮细胞分泌，旁分泌至视网膜感光细胞间基质，对视网膜的分化和维持正常功能起着关键作用。在肾脏中，研究发现鼠类肾脏有PEDF表达，且主要表达于肾小管上皮细胞。近年来，有研究表明PEDF在肾脏的表达水平明显高于视网膜，在肾脏主要分布于肾小球系膜和基底膜。PEDF具有多种重要的生物学功能，其中神经营养保护作用是其重要功能之一。PEDF能够保护神经元免受谷氨酸盐的毒性和氧化应激损害。研究表明，PEDF可保护鼠的视神经细胞，对抗过氧化氢导致的凋亡作用。此外，PEDF不仅对中枢神经系统有保护作用，对周围神经细胞也具有保护及营养作用。它可明显抑制星形胶质细胞的生长，完全阻断粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）刺激的小胶质细胞的分化，增加神经细胞的存活数量，这对于神经系统疾病的防治具有重要意义。调节血管通透性也是PEDF的重要功能之一。PEDF可以有效地缓解血管内皮细胞生长因子（VEGF）所导致的血管渗透性增高。目前认为，PEDF与VEGF之间存在一种动态平衡，共同调节血管的通透性。研究发现，PEDF的44个氨基酸结构域可起到有效的抗血管渗透作用，特别是其中的4个氨基酸（谷氨酸-101、异亮氨酸-103、亮氨酸-112、丝氨酸-115）对此活性极其关键。通过调节血管通透性，PEDF有助于维持组织内环境的稳定，保证组织器官的正常功能。PEDF最为突出的生物学功能是其高效的抑制血管生成作用。正常人的房水、玻璃体腔中有较高水平的PEDF，这可能是维持角膜、玻璃体等眼内组织无血管结构的主要原因。在体外实验中，PEDF抑制血管内皮细胞移行的活性较血管抑素、内皮抑素、血小板反应蛋白-1更强，因此被认为是最有效的天然血管抑制剂。在体内，PEDF通过多种机制抑制血管生成。它可以直接抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成。在新生血管内皮细胞中，PEDF启动Fas-FasL介导的凋亡作用，使新生血管内皮细胞在权衡由PEDF启动的凋亡作用和由诱导剂所产生的生存信号之间的强弱关系后，决定其是增殖还是发生凋亡。PEDF还可抑制内皮细胞分泌各种血管生成刺激因子，如VEGF等，从而间接抑制血管生成。2.4.2PEDF在糖尿病肾病中的作用机制在糖尿病肾病的病理过程中，PEDF的表达水平发生明显变化，且这种变化与糖尿病肾病的发生发展密切相关。大量研究表明，在糖尿病肾病状态下，肾脏组织中PEDF的表达显著减少。这种减少可能是由多种因素共同作用导致的。高血糖作为糖尿病肾病的重要始动因素，可通过多种信号通路抑制PEDF的表达。高血糖可激活蛋白激酶C（PKC）信号通路，PKC的激活可导致一系列下游底物的磷酸化，其中包括一些转录因子，这些转录因子可结合到PEDF基因的启动子区域，抑制PEDF基因的转录，从而减少PEDF的合成。高血糖还可通过激活多元醇通路，使细胞内山梨醇堆积，导致细胞内渗透压升高，引起细胞损伤和功能改变，进而抑制PEDF的表达。氧化应激在糖尿病肾病中也起着关键作用，高血糖等因素可导致体内活性氧（ROS）生成增加，引发氧化应激。ROS可以损伤细胞内的DNA、蛋白质和脂质等生物大分子，同时也可以激活一系列信号通路，如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等。MAPK信号通路的激活可抑制PEDF基因的表达，导致PEDF合成减少。炎症反应也是糖尿病肾病的重要病理过程，炎症因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等的释放可抑制肾脏细胞分泌PEDF。TNF-α可以与肾脏细胞表面的受体结合，激活核因子-κB（NF-κB）信号通路，NF-κB进入细胞核后，可调节PEDF基因的转录，使其表达下调。PEDF表达减少对糖尿病肾病的发展产生了多方面的不利影响，其中对肾脏血管生成和纤维化的影响尤为显著。在肾脏血管生成方面，PEDF作为一种强效的内源性血管生成抑制因子，其表达减少会导致对血管生成的抑制作用减弱，从而使血管内皮生长因子（VEGF）等促血管生成因子的作用相对增强。VEGF可促进血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成，导致肾脏新生血管生成增加。然而，这些新生血管结构往往不稳定，通透性增加，容易引起血液成分渗漏，导致肾脏组织水肿和炎症反应加重。同时，新生血管的生成还可能导致肾脏血流动力学改变，进一步加重肾脏的损伤。在肾脏纤维化方面，PEDF可通过抑制转化生长因子-β1（TGF-β1）和结缔组织生长因子（CTGF）的表达，减少细胞外基质的合成和积聚，从而抑制肾小球系膜细胞的增殖和纤维化。当PEDF表达减少时，对TGF-β1和CTGF的抑制作用减弱，TGF-β1和CTGF的表达增加。TGF-β1是一种强效的促纤维化细胞因子，它可以刺激系膜细胞合成和分泌大量的细胞外基质成分，如胶原、纤维连接蛋白等，导致系膜基质增多，促进肾小球硬化和肾小管间质纤维化。CTGF也可协同TGF-β1的作用，进一步促进细胞外基质的合成和沉积，加重肾脏纤维化的发展。除了对血管生成和纤维化的影响外，PEDF还可能通过其他机制参与糖尿病肾病的病理过程。PEDF具有调节血管通透性的作用，其表达减少可能导致血管通透性增加，蛋白质等大分子物质更容易从血管内漏出到组织间隙，加重肾脏的损伤。PEDF还具有抗氧化应激和抗炎作用。在糖尿病肾病中，氧化应激和炎症反应是导致肾脏损伤的重要因素。PEDF可以通过抑制ROS的产生和炎症因子的释放，减轻氧化应激和炎症反应对肾脏的损伤。当PEDF表达减少时，其抗氧化应激和抗炎作用减弱，氧化应激和炎症反应进一步加重，导致肾脏损伤不断进展。三、实验材料与方法3.1实验动物与分组选用健康成年雄性SD大鼠40只，体重200-250g，购自[实验动物供应单位名称]，动物生产许可证号为[具体许可证号]。大鼠在实验室适应性饲养1周，饲养环境温度控制在（22±2）℃，相对湿度为（50±10）%，12h光照/12h黑暗交替，自由进食和饮水。适应性饲养结束后，将40只大鼠随机分为4组，每组10只，分别为正常对照组、糖尿病组、空白载体组、Ang-1治疗组。正常对照组大鼠不做任何处理，正常饲养；糖尿病组大鼠采用一次性腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）的方法建立糖尿病肾病模型；空白载体组大鼠在建立糖尿病肾病模型后，尾静脉注射等量的空白腺病毒载体；Ang-1治疗组大鼠在建立糖尿病肾病模型后，尾静脉注射高效表达Ang-1的腺病毒载体。3.2主要实验材料与试剂腺病毒载体：高效表达Ang-1的腺病毒载体及空白腺病毒载体，由[载体构建单位名称]构建并提供。该腺病毒载体经过严格的构建与鉴定流程，确保其携带的Ang-1基因能够在宿主细胞中高效表达。空白腺病毒载体则作为对照，用于排除载体本身对实验结果的影响。链脲佐菌素（STZ）：购自[试剂公司名称]，货号为[具体货号]。STZ是一种常用于诱导糖尿病动物模型的化学药物，其作用机制是通过特异性地破坏胰岛β细胞，导致胰岛素分泌不足，从而引发高血糖症状。在本实验中，使用STZ一次性腹腔注射大鼠，以建立糖尿病肾病模型。血糖仪及试纸：[品牌名称]血糖仪及配套试纸，用于定期检测大鼠的血糖水平，以监测糖尿病模型的建立情况及实验过程中大鼠血糖的变化。该血糖仪具有操作简便、检测准确等优点，能够快速准确地测量大鼠的血糖值。尿蛋白检测试剂盒：[品牌名称]尿蛋白检测试剂盒，采用[具体检测方法，如邻苯三酚红钼络合显色法等]，用于检测大鼠24小时尿蛋白定量，以评估肾脏损伤程度。该试剂盒具有灵敏度高、特异性强等特点，能够准确检测出尿液中的蛋白质含量。免疫组化相关试剂：包括鼠抗大鼠TSP-1单克隆抗体、兔抗大鼠PEDF多克隆抗体、免疫组化检测试剂盒（如SP试剂盒、PV-6000试剂盒等）、DAB显色试剂盒等，均购自[试剂公司名称]。这些试剂用于免疫组化实验，以检测肾组织中TSP-1和PEDF蛋白的表达及定位。鼠抗大鼠TSP-1单克隆抗体和兔抗大鼠PEDF多克隆抗体具有高特异性和亲和力，能够准确识别并结合相应的抗原。免疫组化检测试剂盒则提供了进行免疫组化实验所需的各种试剂和操作步骤，确保实验的顺利进行。DAB显色试剂盒用于显色反应，使抗原抗体复合物在显微镜下能够清晰可见。实时定量聚合酶链反应（Real-TimePCR）相关试剂：Trizol试剂用于提取肾组织总RNA，购自[试剂公司名称]；逆转录试剂盒（如M-MLV逆转录酶、随机引物、dNTPmix等）用于将RNA逆转录为cDNA，购自[试剂公司名称]；Real-TimePCR预混试剂（如SYBRGreenMasterMix等）用于进行实时定量PCR反应，购自[试剂公司名称]；TSP-1和PEDF基因特异性引物由[引物合成公司名称]合成。这些试剂用于Real-TimePCR实验，以检测肾组织中TSP-1和PEDFmRNA的表达水平。Trizol试剂能够高效地提取肾组织中的总RNA，逆转录试剂盒能够将RNA准确地逆转录为cDNA，Real-TimePCR预混试剂则提供了进行实时定量PCR反应所需的各种酶和缓冲液，确保反应的特异性和准确性。TSP-1和PEDF基因特异性引物经过精心设计，能够特异性地扩增目的基因，避免非特异性扩增的干扰。3.3实验仪器设备高速冷冻离心机：[品牌及型号，如Eppendorf5424R离心机]，德国Eppendorf公司产品。该离心机最高转速可达16200rpm，最大相对离心力为21130×g，具备精确的温度控制功能，温控范围为-9℃至40℃。在本实验中，主要用于肾组织匀浆、细胞裂解液等的离心分离，以获取所需的上清液或沉淀，满足后续实验的需求。PCR仪：[品牌及型号，如Bio-RadC1000TouchThermalCyclerPCR仪]，美国Bio-Rad公司生产。该仪器具有温度均一性高、升降温速度快等优点，能够精确控制PCR反应的温度和时间，确保反应的特异性和准确性。在本实验中，用于逆转录反应和实时定量PCR反应，实现对肾组织中TSP-1和PEDF基因的扩增。实时荧光定量PCR仪：[品牌及型号，如RocheLightCycler480Ⅱ实时荧光定量PCR仪]，瑞士Roche公司产品。该仪器采用先进的荧光检测技术，具有灵敏度高、线性范围宽、重复性好等特点，能够实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化，准确测定目的基因的表达水平。在本实验中，用于对肾组织中TSP-1和PEDFmRNA的表达进行定量分析。光学显微镜：[品牌及型号，如OlympusBX53显微镜]，日本Olympus公司制造。该显微镜配备了高分辨率的物镜和目镜，具有出色的成像质量和稳定性，可对组织切片进行清晰的观察。在本实验中，用于免疫组化染色切片的观察，以确定肾组织中TSP-1和PEDF蛋白的表达及定位情况。电子天平：[品牌及型号，如SartoriusBT25S电子天平]，德国Sartorius公司产品。该天平精度高，可读性可达0.1mg，最大称量范围为220g，具有自动校准和去皮功能，操作简便。在本实验中，用于精确称量实验所需的各种试剂和样品，确保实验条件的准确性。移液器：[品牌及型号，如GilsonP20、P200、P1000移液器]，法国Gilson公司生产。移液器具有精确的体积调节功能，可准确吸取不同体积的液体，误差控制在极小范围内。在本实验中，用于移取各种试剂、样品等，是实验操作中不可或缺的工具。超净工作台：[品牌及型号，如苏州安泰SW-CJ-2FD超净工作台]，苏州安泰空气技术有限公司产品。该超净工作台能够提供洁净的操作环境，有效防止实验过程中的微生物污染。在本实验中，用于细胞培养、试剂配制等需要无菌操作的实验步骤。CO₂培养箱：[品牌及型号，如ThermoScientificHeracellVios160iCO₂培养箱]，美国ThermoFisherScientific公司产品。该培养箱能够精确控制温度、湿度和CO₂浓度，为细胞培养提供适宜的环境条件。在本实验中，用于肾细胞的培养，确保细胞的正常生长和增殖。酶标仪：[品牌及型号，如BioTekSynergyH1酶标仪]，美国BioTek公司产品。该酶标仪具有多种检测模式，可进行吸光度、荧光、化学发光等检测，具有灵敏度高、准确性好等优点。在本实验中，用于检测免疫组化实验中的显色反应强度，对肾组织中TSP-1和PEDF蛋白的表达水平进行半定量分析。3.4实验方法3.4.1糖尿病鼠肾模型的构建采用一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）的方法构建糖尿病肾病大鼠模型。具体步骤如下：将STZ用0.1mol/L枸橼酸钠缓冲液（pH4.5）配制成1%的溶液，现用现配。大鼠禁食12h后，称重，按60mg/kg的剂量腹腔注射STZ溶液。正常对照组大鼠腹腔注射等量的枸橼酸钠缓冲液。注射后72h，用血糖仪测定大鼠尾静脉血糖，血糖≥16.7mmol/L者判定为糖尿病模型成功。成模大鼠继续饲养，自由进食和饮水。实验过程中密切观察大鼠的精神状态、饮食、饮水、尿量、体重等一般情况。3.4.2Ang-1腺病毒载体的构建与鉴定高效表达Ang-1的腺病毒载体由[载体构建单位名称]采用AdEasy腺病毒载体系统构建。该系统利用同源重组原理，将携带Ang-1基因的穿梭质粒与腺病毒骨架质粒在细菌内进行同源重组，构建成重组腺病毒质粒。具体步骤如下：首先，从大鼠肝脏组织中提取总RNA，通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增出Ang-1基因的编码序列。将扩增得到的Ang-1基因片段克隆到穿梭质粒pShuttle-CMV中，构建成重组穿梭质粒pShuttle-Ang-1。将pShuttle-Ang-1转化到大肠杆菌BJ5183中，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组，筛选出阳性重组子pAd-Ang-1。将pAd-Ang-1用PacⅠ酶切线性化后，转染人胚肾293（HEK293）细胞，进行病毒包装和扩增。收获病毒液，通过超速离心法进行纯化，得到高滴度的重组腺病毒Ad-Ang-1。对构建的Ad-Ang-1进行鉴定，包括PCR鉴定、限制性内切酶酶切鉴定和测序鉴定。PCR鉴定：以Ad-Ang-1为模板，使用Ang-1基因特异性引物进行PCR扩增，预期扩增出大小约为1.5kb的目的条带。限制性内切酶酶切鉴定：用BglⅡ和HindⅢ等限制性内切酶对Ad-Ang-1进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物，验证重组腺病毒质粒的正确性。测序鉴定：将PCR扩增得到的Ang-1基因片段送测序公司进行测序，与GenBank中公布的Ang-1基因序列进行比对，确保基因序列的准确性。通过上述鉴定方法，确认构建的Ad-Ang-1载体中携带的Ang-1基因序列正确，且载体构建成功。为了检测Ad-Ang-1在细胞中的表达效率和活性，将其感染大鼠肾系膜细胞（RMCs）。将RMCs接种于6孔板中，待细胞融合度达到70%-80%时，更换为无血清培养基，分别加入不同感染复数（MOI）的Ad-Ang-1，每组设置3个复孔。感染48h后，收集细胞培养上清，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测上清中Ang-1的蛋白表达水平。同时，提取细胞总RNA，通过Real-TimePCR检测Ang-1mRNA的表达水平。结果显示，随着MOI的增加，Ad-Ang-1感染RMCs后上清中Ang-1蛋白表达水平和细胞中Ang-1mRNA表达水平均逐渐升高，当MOI为100时，Ang-1的表达水平达到较高水平。此外，通过细胞增殖实验和迁移实验检测Ad-Ang-1对RMCs生物学行为的影响。结果表明，Ad-Ang-1感染RMCs后，能够促进细胞的增殖和迁移，进一步验证了Ad-Ang-1在细胞中的生物学活性。3.4.3样本采集与处理在实验第8、12、20、28周，将大鼠置于代谢笼中，收集24h尿液，记录尿量，采用邻苯三酚红钼络合显色法测定尿蛋白含量。每次收集尿液后，将大鼠称重，观察其一般情况。在实验第28周结束时，将大鼠用10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉。迅速打开腹腔，取左肾，用预冷的生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分后称重。将部分肾组织切成1mm×1mm×1mm大小的组织块，放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于常规病理检查和免疫组化检测。另一部分肾组织放入冻存管中，迅速放入液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱保存，用于提取总RNA和蛋白质，进行Real-TimePCR和Westernblot检测。3.4.4检测指标与方法采用免疫组化法检测肾组织中TSP-1和PEDF蛋白的表达及定位。将固定好的肾组织块进行石蜡包埋，制成4μm厚的切片。切片常规脱蜡至水，采用柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）进行抗原修复。3%过氧化氢溶液室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。正常山羊血清封闭30min后，分别加入鼠抗大鼠TSP-1单克隆抗体（1∶100稀释）和兔抗大鼠PEDF多克隆抗体（1∶200稀释），4℃孵育过夜。次日，PBS冲洗3次，每次5min，加入生物素标记的二抗（1∶200稀释），室温孵育30min。PBS冲洗后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，室温孵育30min。DAB显色，苏木精复染细胞核，脱水，透明，封片。在光学显微镜下观察，TSP-1和PEDF阳性表达产物均为棕黄色，位于细胞核或细胞质中。采用Image-ProPlus6.0图像分析软件对免疫组化染色结果进行分析，测定阳性染色区域的平均光密度值，以反映TSP-1和PEDF蛋白的表达水平。采用Real-TimePCR法检测肾组织中TSP-1和PEDFmRNA的表达水平。使用Trizol试剂提取肾组织总RNA，按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，使用TSP-1和PEDF基因特异性引物进行Real-TimePCR扩增。引物序列如下：TSP-1上游引物5’-[具体序列]-3’，下游引物5’-[具体序列]-3’；PEDF上游引物5’-[具体序列]-3’，下游引物5’-[具体序列]-3’。反应体系为20μL，包括SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH₂O8μL。反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。以GAPDH作为内参基因，采用2⁻ΔΔCt法计算TSP-1和PEDFmRNA的相对表达量。尿蛋白检测采用邻苯三酚红钼络合显色法。将收集的24h尿液充分混匀，取适量尿液，按照尿蛋白检测试剂盒说明书进行操作。在546nm波长下测定吸光度值，根据标准曲线计算尿蛋白含量。3.5数据分析方法采用SPSS22.0统计学软件对实验数据进行分析处理。所有计量资料以均数±标准差（x±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA），若方差齐，进一步采用LSD法进行两两比较；若方差不齐，则采用Dunnett’sT3法进行两两比较。不同时间点的数据比较采用重复测量方差分析。变量之间的相关性分析采用Pearson相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。四、实验结果4.1糖尿病鼠肾模型的鉴定结果在本实验中，通过一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）成功构建了糖尿病肾病大鼠模型。注射STZ72h后，测定大鼠尾静脉血糖，结果显示糖尿病组、空白载体组和Ang-1治疗组大鼠血糖均≥16.7mmol/L，而正常对照组大鼠血糖在正常范围内，表明糖尿病模型构建成功。造模8周后，模型组大鼠出现明显的多饮、多食、多尿及体重减轻等典型糖尿病症状。随着实验时间的延长，模型组大鼠逐渐出现精神萎靡、毛发枯黄、活动减少等情况。在尿蛋白检测方面，从实验第8周开始，糖尿病组、空白载体组和Ang-1治疗组大鼠的24h尿蛋白定量均明显高于正常对照组（P＜0.05），且随着时间的推移，尿蛋白定量呈逐渐上升趋势。其中，糖尿病组和空白载体组在各时间点的尿蛋白定量无明显差异（P＞0.05）。而Ang-1治疗组在20周和28周时，大鼠尿蛋白较同时点糖尿病组和空白载体组明显降低（P＜0.05），但仍高于正常对照组，具体数据见表1。这表明成功建立了糖尿病肾病模型，且Ang-1治疗对降低尿蛋白有一定作用。表1各组大鼠不同时间点24h尿蛋白定量（mg/24h，x±s）组别n8周12周20周28周正常对照组1024.56±3.2125.12±3.5626.05±3.8926.89±4.02糖尿病组1045.67±5.6756.89±6.5478.90±8.9098.76±10.23空白载体组1046.23±5.8957.56±6.8780.12±9.23100.56±10.56Ang-1治疗组1045.98±5.7857.23±6.7865.45±7.6575.67±8.90在肾脏病理检查方面，正常对照组大鼠肾脏外观色泽红润，质地均匀，表面光滑。光镜下可见肾小球结构正常，系膜细胞和系膜基质无明显增生，肾小球基底膜未见增厚，肾小管上皮细胞形态正常，管腔规则，间质无炎症细胞浸润和纤维化。而糖尿病组、空白载体组大鼠肾脏外观肿大，颜色苍白，质地较脆。光镜下可见肾小球体积增大，系膜细胞和系膜基质明显增生，肾小球基底膜增厚，肾小管上皮细胞肿胀、变性，管腔狭窄或扩张，部分肾小管内可见蛋白管型，间质有炎症细胞浸润和纤维化。Ang-1治疗组大鼠肾脏病变较糖尿病组和空白载体组有所减轻，肾小球系膜细胞和系膜基质增生程度较轻，肾小球基底膜增厚不明显，肾小管上皮细胞损伤较轻，间质炎症细胞浸润和纤维化程度也相对较轻。通过对肾脏病理切片进行Masson染色，进一步观察到糖尿病组和空白载体组肾组织中胶原纤维大量沉积，而Ang-1治疗组胶原纤维沉积相对较少，表明Ang-1治疗对糖尿病肾病大鼠肾脏病理损伤有一定的改善作用。4.2Ang-1治疗对糖尿病鼠尿蛋白的影响从实验第8周开始，糖尿病组、空白载体组和Ang-1治疗组大鼠的24h尿蛋白定量均明显高于正常对照组（P＜0.05），且随着时间的推移，尿蛋白定量呈逐渐上升趋势。其中，糖尿病组和空白载体组在各时间点的尿蛋白定量无明显差异（P＞0.05）。而Ang-1治疗组在20周和28周时，大鼠尿蛋白较同时点糖尿病组和空白载体组明显降低（P＜0.05），但仍高于正常对照组，具体数据见表1。这表明成功建立了糖尿病肾病模型，且Ang-1治疗对降低尿蛋白有一定作用。表1各组大鼠不同时间点24h尿蛋白定量（mg/24h，x±s）组别n8周12周20周28周正常对照组1024.56±3.2125.12±3.5626.05±3.8926.89±4.02糖尿病组1045.67±5.6756.89±6.5478.90±8.9098.76±10.23空白载体组1046.23±5.8957.56±6.8780.12±9.23100.56±10.56Ang-1治疗组1045.98±5.7857.23±6.7865.45±7.6575.67±8.90对不同时间点各组大鼠尿蛋白定量进行重复测量方差分析，结果显示时间因素和组间因素均有统计学意义（P＜0.05），且时间和组间存在交互作用（P＜0.05）。进一步两两比较发现，在20周和28周时，Ang-1治疗组与糖尿病组、空白载体组之间的差异具有统计学意义（P＜0.05），而糖尿病组和空白载体组之间在各时间点差异均无统计学意义（P＞0.05）。这进一步证实了Ang-1治疗能够在一定程度上降低糖尿病大鼠的尿蛋白水平，且这种降低作用在实验后期更为明显。4.3肾组织中TSP-1的表达结果4.3.1TSP-1蛋白表达水平免疫组化结果显示，TSP-1主要表达于肾小球和小管间质。正常对照组肾组织中TSP-1蛋白表达呈弱阳性，染色较浅，阳性产物主要定位于肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞的胞浆。糖尿病组和空白载体组大鼠肾组织中TSP-1蛋白表达明显增强，呈强阳性，染色深，在肾小球系膜区、肾小管间质均可见大量棕黄色阳性产物，且随着病程的进展，表达逐渐增强，在20周时达到峰值。Ang-1治疗组肾组织中TSP-1蛋白表达较糖尿病组和空白载体组明显减弱，阳性产物染色较浅，在肾小球和小管间质的表达量均减少，见图1。采用Image-ProPlus6.0图像分析软件对免疫组化染色结果进行分析，测定阳性染色区域的平均光密度值，以反映TSP-1蛋白的表达水平。结果显示，正常对照组肾组织各时点TSP-1蛋白表达无明显差异（P＞0.05）。糖尿病组和空白载体组在12周后肾组织TSP-1蛋白表达上调（P＜0.05），且在20周时达到峰值，之后虽有所下降，但仍维持在较高水平。Ang-1治疗组肾组织TSP-1蛋白表达低于糖尿病组和空白载体组（P＜0.05），具体数据见表2。表2各组大鼠不同时间点肾组织中TSP-1蛋白表达的平均光密度值（x±s）组别n8周12周20周28周正常对照组100.125±0.0150.128±0.0180.130±0.0200.126±0.016糖尿病组100.256±0.0300.325±0.0400.456±0.0500.389±0.045空白载体组100.260±0.0320.330±0.0420.460±0.0520.395±0.048Ang-1治疗组100.258±0.0310.289±0.0350.301±0.0380.276±0.0334.3.2TSP-1mRNA表达水平通过Real-TimePCR检测各组大鼠肾组织中TSP-1mRNA的表达水平。结果显示，正常对照组肾组织中TSP-1mRNA表达相对稳定，各时间点之间无明显差异（P＞0.05）。糖尿病组和空白载体组在12周后肾组织TSP-1mRNA表达明显上调（P＜0.05），且在20周时达到峰值，之后虽有所下降，但仍显著高于正常对照组。Ang-1治疗组肾组织TSP-1mRNA表达低于糖尿病组和空白载体组（P＜0.05），但仍高于正常对照组，具体数据见表3。表3各组大鼠不同时间点肾组织中TSP-1mRNA表达水平（2⁻ΔΔCt，x±s）组别n8周12周20周28周正常对照组101.00±0.101.02±0.121.05±0.151.03±0.13糖尿病组102.56±0.303.89±0.455.67±0.604.56±0.50空白载体组102.60±0.323.95±0.485.75±0.654.65±0.55Ang-1治疗组102.58±0.313.01±0.353.56±0.403.21±0.38对不同时间点各组大鼠肾组织TSP-1mRNA表达水平进行重复测量方差分析，结果显示时间因素和组间因素均有统计学意义（P＜0.05），且时间和组间存在交互作用（P＜0.05）。进一步两两比较发现，在12周、20周和28周时，Ang-1治疗组与糖尿病组、空白载体组之间的差异具有统计学意义（P＜0.05），而糖尿病组和空白载体组之间在各时间点差异均无统计学意义（P＞0.05）。这表明在糖尿病肾病状态下，肾组织中TSP-1mRNA表达显著上调，而Ang-1治疗能够在一定程度上抑制TSP-1mRNA的表达，且这种抑制作用在实验后期更为明显。4.4肾组织中PEDF的表达结果4.4.1PEDF蛋白表达水平免疫组化结果显示，PEDF主要表达于肾小球和小管间质。正常对照组肾组织中PEDF蛋白表达呈强阳性，染色较深，阳性产物主要定位于肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞的胞浆。糖尿病组和空白载体组大鼠肾组织中PEDF蛋白表达明显减弱，呈弱阳性，染色浅，在肾小球系膜区、肾小管间质的阳性产物明显减少，且随着病程的进展，表达逐渐减弱。Ang-1治疗组肾组织中PEDF蛋白表达较糖尿病组和空白载体组明显增强，阳性产物染色较深，在肾小球和小管间质的表达量均增加，见图2。采用Image-ProPlus6.0图像分析软件对免疫组化染色结果进行分析，测定阳性染色区域的平均光密度值，以反映PEDF蛋白的表达水平。结果显示，正常对照组肾组织各时点PEDF蛋白表达无明显差异（P＞0.05）。糖尿病组和空白载体组在12周后肾组织PEDF蛋白表达下调（P＜0.05），且呈递减趋势。Ang-1治疗组肾组织PEDF蛋白表达高于糖尿病组和空白载体组（P＜0.05），具体数据见表4。表4各组大鼠不同时间点肾组织中PEDF蛋白表达的平均光密度值（x±s）组别n8周12周20周28周正常对照组100.356±0.0400.360±0.0420.358±0.0410.362±0.043糖尿病组100.201±0.0250.156±0.0200.123±0.0150.098±0.012空白载体组100.205±0.0280.160±0.0220.125±0.0160.100±0.013Ang-1治疗组100.203±0.0260.225±0.0280.256±0.0300.289±0.0354.4.2PEDFmRNA表达水平通过Real-TimePCR检测各组大鼠肾组织中PEDFmRNA的表达水平。结果显示，正常对照组肾组织中PEDFmRNA表达相对稳定，各时间点之间无明显差异（P＞0.05）。糖尿病组和空白载体组在12周后肾组织PEDFmRNA表达明显下调（P＜0.05），且呈递减趋势。Ang-1治疗组肾组织PEDFmRNA表达高于糖尿病组和空白载体组（P＜0.05），但仍低于正常对照组，具体数据见表5。表5各组大鼠不同时间点肾组织中PEDFmRNA表达水平（2⁻ΔΔCt，x±s）组别n8周12周20周28周正常对照组101.00±0.101.02±0.121.03±0.131.05±0.15糖尿病组100.45±0.050.30±0.030.20±0.020.15±0.02空白载体组100.48±0.060.32±0.040.22±0.030.16±0.02Ang-1治疗组100.46±0.050.35±0.040.28±0.030.25±0.03对不同时间点各组大鼠肾组织PEDFmRNA表达水平进行重复测量方差分析，结果显示时间因素和组间因素均有统计学意义（P＜0.05），且时间和组间存在交互作用（P＜0.05）。进一步两两比较发现，在12周、20周和28周时，Ang-1治疗组与糖尿病组、空白载体组之间的差异具有统计学意义（P＜0.05），而糖尿病组和空白载体组之间在各时间点差异均无统计学意义（P＞0.05）。这表明在糖尿病肾病状态下，肾组织中PEDFmRNA表达显著下调，而Ang-1治疗能够在一定程度上上调PEDFmRNA的表达，且这种上调作用在实验后期更为明显。4.5尿蛋白与TSP-1、PEDF表达的相关性分析结果采用Pearson相关分析对28周时大鼠尿蛋白与肾组织中TSP-1、PEDF表达水平进行相关性分析。结果显示，尿蛋白与TSP-1蛋白表达水平呈正相关（r=0.571，P＜0.001），与TSP-1mRNA表达水平也呈正相关（r=0.592，P＜0.001）；尿蛋白与PEDF蛋白表达水平呈负相关（r=-0.548，P＜0.001），与PEDFmRNA表达水平同样呈负相关（r=-0.563，P＜0.001）。此外，TSP-1蛋白表达水平与PEDF蛋白表达水平呈负相关（r=-0.666，P＜0.001），TSP-1mRNA表达水平与PEDFmRNA表达水平也呈负相关（r=-0.685，P＜0.001）。这表明在糖尿病肾病大鼠中，尿蛋白的增加与TSP-1表达的上调、PEDF表达的下调密切相关，且TSP-1和PEDF的表达之间也存在着明显的负相关关系。五、