土壤中分解尿素细菌分离与计数上课用

土壤中分解尿素细菌分离与计数上课用第一页，共43页。一、课题背景1、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+CO22NH3+H2O第二页，共43页。3、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌。4、课题目的①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌(计数)一.研究思路㈠.筛选菌株㈡.统计菌落数目㈢.设置对照第三页，共43页。

1、实例：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。㈠.筛选菌株第四页，共43页。总之：要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基方法：⑴抑制大多数微生物生长⑵造成有利于该菌生长的环境，结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。2、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。第五页，共43页。15.0g琼脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：①从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属于哪类培养基？固体培养基②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素选择培养基第六页，共43页。尿素是培养基中的唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源，才能生长。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。5、该培养基选择分解尿素的微生物的原理选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。第七页，共43页。6、怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为唯一氮源的培养基牛肉膏蛋白胨培养基

是分离能分解尿素的细菌判断该培养基有无选择性实验组对照组培养基类型是否接种

目的

结果只生长能分解尿素的细菌生长多种微生物是第八页，共43页。栏目链接用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是()A．未接种的选择培养基B．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基C．接种了的牛肉膏蛋白胨培养基D．接种了的选择培养基C第九页，共43页。1、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。㈡.统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点第十页，共43页。2.间接计数法（活菌计数法）⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。⑵常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。第十一页，共43页。如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算教材P22第十二页，共43页。实例分析P22

第一同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了三个平板，但是其中1个平板的计数结果与2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。第十三页，共43页。注意事项①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。(即设置重复组求平均数)③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。第十四页，共43页。微生物的计数法显微镜直接计数、间接计数法（活菌计数法）、比浊法、滤膜法第十五页，共43页。设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。㈢.设置对照：设置对照的方法：①空白对照：不给对照组任何处理因素。②条件对照（标准对照）：指給予对照组一种被证明有效因素的处理③自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。④相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。第十六页，共43页。课P23实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。原因:(1)培养基被杂菌污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质)

(2)土壤不同第十七页，共43页。小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案二：由其他同学用与A同学相同土样进行实验方案一：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。第十八页，共43页。将细菌放在固体培养基上培养，它会繁殖并形成菌落(如下图)。某实验小组想检验两种抗生素的杀菌作用，下列哪个实验方案最合适(

)C第十九页，共43页。④菌落计数②系列稀释③涂布平板与培养①配制土壤溶液根据图示2－7填写以下实验流程：实验设计：第二十页，共43页。（一）土壤取样（二）制备培养基（三）土壤样品的稀释（四）取样涂布（五）微生物的培养与观察（八）鉴定（七）细菌的计数二.实验的操作流程

选择培养基（尿素培养基）牛肉膏蛋白胨培养基(作对照)第二十一页，共43页。二.实验的具体操作

㈠.土壤取样

从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。（二）制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。牛肉膏蛋白胨培养基（作对照）第二十二页，共43页。◆应在火焰旁称取土壤10g。◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行◆分离不同的微生物采用不同的稀释度[三]土壤样品的稀释第二十三页，共43页。◆分离不同的微生物采用不同的稀释度稀释倍数目的细菌104、105、106保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板放线菌103、104、105真菌102、103、104原因：不同微生物在土壤中含量不同由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。第二十四页，共43页。

由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。第二十五页，共43页。

为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。第二十六页，共43页。（四）取样涂布◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30—300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。每个稀释度下需要3个选择培养基（作重复组），1个牛肉膏蛋白胨培养基（作对照）第二十七页，共43页。㈤.微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：30～37℃培养1～2d放线菌：25～28℃培养5～7d霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。第二十八页，共43页。微生物的培养与观察同种微生物有稳定的菌落特征：形状，大小，隆起程度，颜色第二十九页，共43页。（六）鉴定：筛选后必鉴定鉴别培养基：加入某种指示剂或化学药品，不影响微生物的生存1、酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌。原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→酚红变红→脲酶阳性2、伊红—美蓝培养基：鉴定大肠杆菌原理：代谢产物与伊红—美蓝结合→菌落呈黑色并带有金属光泽。CO(NH2)脲酶+CO2NH3+H2O属鉴别培养基，它并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长第三十页，共43页。

伊红—美蓝培养基是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为的代谢产物与伊红—美蓝结合，使菌落呈深紫色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。例如：鉴别大肠杆菌培养基第三十一页，共43页。大肠杆菌呈黑色中心,有或无金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征

第三十二页，共43页。三、操作提示

无菌操作

做好标记

规划时间

第三十三页，共43页。（一）①培养物(即培养的目的菌种)中是否有杂菌污染?②以及选择培养基是否筛选出菌落?

①对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。②牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。四.结果分析与评价第三十四页，共43页。如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，需要进一步分析产生差异的原因。（二）样品的稀释操作是否成功

如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。

（三）重复组的结果是否一致第三十五页，共43页。操作实验组对照组判断培养基中是否有杂菌污染判断选择培养基是否具有筛选作用选择培养基接种选择培养基不接种选择培养基接种牛肉膏蛋白胨培养基接种需将未接种的选择培养基同时进行培养需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目、进行对比得出结实验设计原则(1)设立重复组：统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布三个平板作重复组，增强实验结果的说服力与准确性。(2)设立两种对照组：第三十六页，共43页。栏目链接四.结果分析与评价22第三十七页，共43页。本课题知识小结:第三十八页，共43页。课后练习2.提示：反刍动物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。

由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基外，还应参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。第三十九页，共43页。11．某化工厂的污水池中，含有一种有害的、难以降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到了能高效降解化合物A的细菌(“目的菌”)。请分析回答下列问题。(1)培养基中加入化合物A的目的是筛选__________，这种培养基属于__________培养基。(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的__________，实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的代谢类型是__________。(3)培养若干天后，应选择培养瓶中化合物A含量____________的培养液，接入新的培养液中连续培养，使“目的菌”的数量__________。(4)可采用__________的方法将“目的菌”接种到固体培养基上，通过__________法对“目的菌”的数量进行统计，通常需要对菌落数为________