CN110128518B 利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法

(19)国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号CN110128518B(65)同一申请的已公布的文献号(73)专利权人中国农业科学院作物科学研究所地址100081北京市海淀区中关村南大街12号(74)专利代理机构北京惠科金知识产权代理有专利代理师瞿晓晶CO7K14/415(2006.01)A01H5/00(2018.01)A01H6/46(WO2018035354A1,2018.02.22001150627.2,Zeamaysgibberelloxidase3(LOC100276001150627.2,Zeamaysgibberelloxidase3(LOC100276001321686.1,Zeamaysgibberellin20oxidase4(LOC107521001321686.1,Zeamaysgibberellin20oxidase4(LOC107521权利要求书1页说明书7页(54)发明名称法本发明提供一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法，包括针对玉米中的目标基因sgRNA,将含有编码所述sgRNA的DNA片段连接到携带Cas的载体中，用构建的载体转化玉米，实现获得相应基因功能缺失的转基因玉米植株。本发生物学功能，通过CRISPR/Cas9技术对玉米ZmGA20ox3/ZmGA20ox5基因进行基因编辑，并进一步筛选获得不含转基因插入片段的突变体材料，这些玉米矮化材料具有重要的育种价值。21.利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法，其特征在于，针对玉米中的目标基因基因ZmGA20ox5编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；5'-AGATCCCCGCGCCATTCCTG-3所述携带Cas的载体为pBUE411;所述转化是通过农杆菌介导法转化玉米；所述玉米为自交系综31。2.一种创制玉米矮化材料的方法，其特征在于，按照权利要求1所述方法制备转基因玉3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所创制的玉米矮化材料中不含外源插入片段。3利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法技术领域[0001]本发明涉及生物技术和遗传育种领域，具体地说，涉及一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法。背景技术[0002]二十世纪玉米产量的提高主要依赖提高单位面积内玉米的种植密度(Duvicketal.,2010),但是密度过高随之而来的就是倒伏的风险，可能会降低产量，因此在一定程度上降低玉米株高有助于提高玉米产量。上世纪60年代末，闻名于世的“绿色革命”掀起了半矮化植株可以提高产量的狂潮。在“绿色革命”期间成功创制了半矮化水稻和小麦的高产品种。在过去的几十年中许多玉米矮化突变体被鉴定，但没有完全应用到玉米育种中。[0003]赤霉素(GAs)是一种天然的四环二萜羧酸，在植物种子萌发、茎的伸长以及花的形成等生长发育过程中起着重要的作用。目前发现的赤霉素种类已经有130多种，其中有活性存在形式，一种以游离态形式存在，参与植物生长代谢途径，另一种以结合态的形式存在，是不具有活性的，植物体内GA正常的含量由结合态GA与游离态GA的动态平衡来维持(Kawaide.,2006)。GA的生物合成包括以下几个步骤：1)在原生质体中栊牛儿基栊牛儿基二磷酸合成内根-贝壳杉烯；2)在内质网上内根-贝壳杉烯氧化生成GA12,GA12进一步转化成GA53;3)GA12和GA53进入到细胞质中，在一系列赤霉素氧化酶的作用下生成有活性的GA分[0004]CRISPR/Cas9技术可以精准的对基因组中的特定部位进行编辑，既可以实现基因的敲除也可以产生特定片段的插入，成功应用于不同植物的基因组编辑，加快基因功能研究和作物分子遗传改良。通过CRISPR/Cas9技术获得玉米矮化突变体材料，有望应用到玉米育种工作中。发明内容[0005]本发明的目的是提供一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法。[0006]为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供控制植物株高的基因，包括玉米基因：[0007](a)由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；[0008](b)SEQIDNO:1所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能[0009]玉米ZmGA20ox5基因为编码如下蛋白[0010](a')由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；[0011](b')SEQIDNO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a')衍生的蛋白质。4[0012]第二方面，本发明提供玉米ZmGA20ox3和/或ZmGA20ox5基因在玉米矮化材料育种高)。[0013]第三方面，本发明提供利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法，针对玉米中述sgRNA序列的DNA片段连接到携带Cas的载体中，用构建的载体转化玉米(如农杆菌介导法),实现对基因ZmGA20ox3和/或ZmGA20ox5的定点突变，进而获得ZmGA20ox3和/或GGAGCCATTCCTGTGGCCGC-3'和5'-CTAGATCCCCGCGCCATTCCTG-3'和5'-CTGTCGTTCGGC[0016]更优选地，将两个sgRNA作用位点通过不同表达盒串联到同一基因编辑载体上。[0017]本发明中，所述携带Cas9的载体为pBUE411。所建玉米转化载体为pBUE411-2gR-[0019]第四方面，本发明提供一种创制玉米矮化材料的方法，按照上述方法制备转基因[0020]优选地，所创制的玉米矮化材料中不含外源插入片段。[0021]玉米中NOD基因编码的蛋白具有调控细胞数量的功能，nod突变体在生长发育和细胞分化等方面均有缺陷，表现出叶片狭窄并且株高极度矮化(Rosaetal.,2017)。玉米blh12/blh14双突变体节间长度严重缩短引起矮化的表型，且该突变体雄穗发育畸形导致完全不育(Tsudaetal.,2017)。玉米gif1突变体叶片变窄、节间不规则地弯曲且植株变矮，雌花序长分枝增加，雄花序分枝减少(Zhangetal.,2018)。本发明创制的玉米矮化材料属于半矮化材料，节间发育正常且可正常结实，与矮化严重、矮化后不育及矮化后节间发育不规则的玉米材料相比，更适合应用于杂交玉米生产。[0022]借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：[0023]本发明首次揭示了玉米ZmGA20ox3和/或ZmGA20ox5基因的生物学功能，通过不含转基因插入片段的突变体材料，这些玉米矮化材料具有重要的育种价值。附图说明[0024]图1为本发明实施例5中纯合突变体靶位点突变序列的分析结果。的杂合突变体及纯合突变体材料与野生型玉米植株的高矮比较；B:植株高矮的柱形图。[0026]图3为本发明实施例6中无转基因片段突变体植株筛选结果。5均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,目的基因ZmGA20ox3、ZmGA20ox5及相关信息从数据库MaizeGDB(https://的第一个外显子上，两个靶位点(位于不同表达盒)串联到同一个基因编辑载体上。[0033]基因名称引物名称引物序列(5’→3’)TGGCGGCCACAGGAATGGCTCCGTTTTAGAGCTAGAACTCGTGGAAGCCGAAGGACAGCGCTTCTTGGTAATAATGGTCTCTGGCGGCGGCCACAGGAATGGCTCCATTATTGGTCTCTAAACTCGTGGAAGCCGAAGGACTGCAGGAATGGCGCGGGGATCTGTTTTAGAGCTAGAACTCGTGGTAGCCGAACGACAGCGCTTCTTGGTTGCAGGAATGGCGCGGGGATCTGTTTTAGAGCTAGATTATTGGTCTCTAAACTCGTGGTAGCCGAACGAC第一轮反应体系为：2×PCRbufferforKODFX总体系50μL第二轮反应体系为：6第一轮扩增产物总体系50μI[0040]两轮PCR扩增反应程序为：94℃2min;98℃10s,58℃30s,68℃1min,35个循环；68℃[0041]然后，用限制性内切酶BsaI-HF单酶切纯化的目的片段和pBUE411载体，酶切后的线性载体用0.2μL去磷酸化酶CPI37℃处理30min,防止酶切后载体自连。[0042]单酶切体系：酶切Buffer(10×)总体系450L[0046]目的片段与表达载体通过T4连接酶总体系10μI[0049]室温连接1h或者16℃过夜连接。分别构建得到基因ZmGA20ox3、ZmGA20ox5编辑载[0050]实施例3基因编辑载体转入农杆菌LBA4404[0051]将实施例2构建的基因ZmGA20ox3、ZmGA20ox5编辑载体分别转入农杆菌LBA4404,具体步骤如下：[0053](2)冰浴30min;[0054](3)从冰上取出，迅速置于液氮中速冻5min;[0055](4)从液氮中取出，在37℃水浴中温育5min;[0056](5)取出后再放置冰上5min;[0057](6)加入800μL空白YEB培养基，在28℃摇床200rpm恢复4-5h;[0058](7)4000rpm常温离心5min;7[0060](9)挑取平板上长出的单菌落，接种于含相应抗性的YEB液体培养液中，28℃200rpm振荡培养过夜；以菌液为模板进行PCR扩增鉴定。[0061]实施例4农杆菌转化玉米培养8h;再以1:100的比例将震荡培养后的菌液接种到新鲜的含相应抗生素的YEB液体培养基中，于200rpm、28℃振荡过夜。次日，将震荡培养过夜的菌液分装到2mL离心管中，于[0063]将受体材料玉米自交系综31幼胚放到含1mL侵染培养基溶液的1.5mL离心管中，1h后用移液器吸去侵染培养基并加入1mL新的侵染培养基，颠倒混匀1min,充分清洗玉米幼胚表面的胚乳，再用移液器吸去侵染培养基溶液，加入0.2mL新的侵染培养基溶液。将装有玉米幼胚的离心管放置在加热器(杭州博日科技有限公司，型号CHB-100)上用45℃热激5min;用移液器吸去侵染培养基溶液，加入1mL含40mg/L乙酰丁香酮的农杆菌菌液，并放置5min;取出用灭菌滤纸吸干，放到添加300mg/L半胱氨酸的共培养培养基上，在23℃黑暗条件下共培养3天。共培养完后的幼胚转移到恢复培养基中，黑暗条件下培养7天。[0064]筛选两轮后，获得抗性愈伤，将此愈伤转移到再生培养基，强光照下使植株再生。培养条件为28℃,光照16h,很快就会有再生小苗出现。再生的幼苗长到3片叶时，可将幼苗移植到生根培养基中，并在室内培养。待幼苗长出新叶及根后，将幼苗从罐头瓶中取出，自来水冲净培养基，移栽于混有营养土和蛭石(1:3,体积比)的小花盆中。当幼苗又长出2-3片新叶时，可将其移入大田或大花盆中。[0065]本实施例中使用的侵染培养基、共培养培养基、再生培养基、生根培养基，具体参[0066]实施例5发生编辑的转基因玉米植株的鉴定基因特异性引物进行PCR鉴定，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。所用引物序列见表2:表2扩增引物基因名称引物名称引物序列(5’→3’)反应体系为：8DNA模板引物F引物R总体系50μL℃∞。产物大小约为1.1Kb,扩增产物条带大小正确的PCR产物送去测序。筛选到两个ZmGA20ox3基因编辑的突变体株系(图1,A)和4个ZmGA20ox5基因编辑的突变体株系(图1,B)。发生编辑的杂合突变体及纯合突变体材料明显比野生型玉米植株矮(图2,A和B)。[0074]根据插入玉米基因组的T-DNA序列设计3对特异性引物，以纯合突变体叶片基因组DNA为模板进行PCR扩增。3对引物的序列见表3:[0075]表3扩增引物引物名称引物序列(5’→3')扩增产物大小反应体系为：引物F引物R总体系20μI[0080]以ga20ox3纯合突变体mut1的叶片基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，发现2号、3号、7号、8号共4株转基因玉米的基因组中无T-3)。这些玉米矮化材料具有重要的育种价值。[0081]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因9此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。[0082]参考文献revealedbythegenes.TrendsinPlabiosynthesisinfungi.JournaloftheAgriculturalChemicalSocietyofJapan,QTL,qPH3.1,forplantheightinmaize.ThePlantJournal,201[0087][5]RosaM.,AbrahamJ.,MaríaACTIVITYhomologCELLNUMBgrowthandtissuepatterning.ThePlantCell,2017,29(maize.ThePlantCell,2017,29(5):1105-1118.[0089][7]ZhangD.,SunW.,SinghCell,201830(2):360-374.CN110128518B序列表1/4页[0010]<213>玉米(Zeamays)11[0043][0065]<213>玉米(Zeamays)[0075]ValPheAsp[0098][0102][0105]GlyGluTr