（高清版）DB63∕T 2427-2025 《无浆体病防控技术规范》

DB63青海省市场监督管理局发布I请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件起草单位：青海省动物疫病预防控制中心，贵德县动物疫病预防控1无浆体病防控技术规范NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范无浆体（Anaplasma），隶属于立克次体目（Ri（Anaplasma），是通过蜱等吸血昆虫传播的一类专性细胞内寄生病原体，其主要4病原2色阴性，姬姆萨（Giemsa）染色呈紫红色，在宿主红细胞内寄生时呈单个或多个存在，常位于红细胞5.2传播途径主要是通过媒介昆虫叮咬动物皮肤感染。媒介昆虫主要是蜱，还包括牛虻、蝇和蚊等多种吸血昆虫。被污染且消毒不彻底的手术器械、注射器、针头等也可机械性传播潜伏期为20d～30d。病畜体温升高至40℃~42℃、衰弱无力、贫血、黄疸、萎顿、厌食、消瘦、根据流行病学、临床症状、病理剖检变化做出8.2.1.1采集可疑病畜静脉血制作血涂片，姬姆萨染色红细胞中发现单个或多个无浆体，对红细胞的8.2.1.2血液检查发现红细胞总数减少，血红蛋白和红细胞比容降无菌抗凝管采集疑似患病畜血液1ml，4℃保存，立即3将蜱浸泡于75%酒精，15min，1倍磷酸盐缓冲液或0.9%NaCl溶液洗3次，置于干净的滤纸上吸水缓冲液250μL研磨至匀浆状，4℃保存备用。血液(200μL)无需处理可缓冲液、1倍Tris-EDTA缓冲液配置方取上述样本的匀浆液或血液样本200μL加入200μLDNA提取液充分混匀，沸水浴8min(误差不超过1min)，1200r/min离心10min，取上清作为模板备用。或按照商品化微量DNA提取试剂盒说明书操作提取DNA，保存于-20℃备用。DNA提取9综合防控9.1.1饲养管理9.1.2消毒灭蜱在蜱活跃季节，对畜群体表、圈舍及圈舍周围环境定期进行消毒灭蜱，消毒灭蜱方法见附9.1.3调运管理调运动物时应对该病及其体表可能存在的传播媒介进行检查，排除4A.1.2向烧杯中加入约800ml的去离子水，用玻璃棒搅拌或使用磁力搅拌器搅拌，使药品完全溶解；A.1.3调节pH值至7.2-7.A.1.4将溶液定容至1000ml后，高温高压灭菌，室温保存，备用。A.2.1取1MTris-HClBufferPH=8.0，5ml和0.5MEDTA，PH=8.0，1ml；A.2.3将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌，室温保存，备用。A.3DNA提取液A.3.1配制提取液之前，先配制母液母液（灭菌）：1MTris-HCl(12.11gTris-HCl+ddH2O至10EDTA-Na2.2H2O(37.22g+ddH2O至200ml，用NaOHA.3.2提取液配方MNaCl28ml，PVP1g，β-巯基乙醇1ml，加双蒸水定容至100ml，备先配制50倍Tris-乙酸-EDTA缓冲液，用时稀释成1倍工作液。50倍Tris-乙酸-EDTA缓冲液的配制方法为：取Tris242g，EDTAmL的醋酸，充分搅拌，加去离子水将溶液定容至1L后，室温保存；1倍Tris-乙酸-EDTA缓冲液，取50倍Tris-乙酸-EDTA缓冲液20ml，加ddH2O定容至1L，备用。5PCR扩增rpoBgeneAna-rpoBR制备1%琼脂糖凝胶，将核酸扩增产物及DNAMaker加入胶孔，将凝胶放入电泳槽中，加入足量的16阴性对照、空白对照未出现条带，阳性对照在525bp有扩增条带，即试验成立。如待检样品PCR扩增产物电泳检测结果未出现预期大小的扩增条带，则判定该检测样本的PCR检测结果为阴性；如待检样品PCR扩增产物电泳检测出现525bp的扩增条带，则判定该检测样本的PCR检测结果为阳性，见图B.1。图B.1无浆体病靶基因rpoBPCR扩增图注：M—DNA分子质量标准Trans2000;1—阳性对照(牛边缘无浆体(临洮株));2—阳性样本(羊全血无浆体测序阳性);3—阴性对照(生理盐水);4—空白对照。7消毒灭蜱8//生素C注射液／内服氰碘柳胺钠和阿维菌和阿维菌素）1次。胺钠50mg，阿维菌素3mg。9[1]Dahmani,M.,Davoust,B.,Rousseau,F.,Raoult,D.,Fenollar,F.,Mediannikov,O.,2017.NaturinfectioninRhipicephalusbursatickscollectedfromsheepintheFrenchBas[2]He,Y.,Chen,W.,MLi,Y.(2021).MoleculardetectionofAnaplasmaspp.,Babesiaspp.andTheilerias