DB36∕T 1904-2023 实验动物 支原体荧光定量PCR检测方法

ICS65.020.30

CCSB44

DB36

江西省地方标准

DB36/T1904—2023

实验动物支原体荧光定量PCR检测方法

Laboratoryanimal—real-timequantitativePCRmethodforexaminationof

mycoplasma

2023-12-11发布2024-06–01实施

江西省市场监督管理局发布

DB36/T1904—2023

目次

前言.............................................................................II

1范围..............................................................................1

2规范性引用文件....................................................................1

3术语和定义........................................................................1

4缩略语............................................................................2

5设备和材料........................................................................2

6试剂..............................................................................2

7检测流程..........................................................................2

8结果判定..........................................................................4

附录A（规范性附录）溶液配制方法....................................................5

附录B（规范性附录）荧光定量PCR的引物与探针........................................7

附录C（规范性附录）荧光定量PCR检测方法............................................8

参考文献..........................................................................9

I

DB36/T1904—2023

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起

草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由江西省卫生健康委员会提出并归口。

本文件起草单位：江西省职业病防治研究院。

本文件主要起草人：肖芳平、张陆兵、周银平、熊莉娟、万筱荣、贾菠、刘欢、罗勇兵、谢金明、

周剑、李银才。

II

DB36/T1904—2023

实验动物支原体荧光定量PCR检测方法

1范围

本文件规定了实验动物支原体荧光定量PCR检测的术语和定义、缩略语、设备和材料、试剂、检测

流程和结果判定等内容。

本文件适用于小鼠、大鼠中支原体的检测，饲养环境中支原体的检测参照执行。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。凡是注日期的引用文件，

仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于

本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB14922实验动物微生物、寄生虫学等级及监测

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求

GB/T39760实验动物安乐死指南

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

支原体mycoplasma

支原体属于柔膜体纲，支原体目，支原体科，大小介于病毒和细菌之间，约0.1μm~0.6μm，没有细

胞壁，仅有三层结构且富含胆固醇的细胞膜。大多数的支原体都具有种属特异性。

3.2

荧光定量聚合酶链式反应real-timequantitativepolymerasechainreaction;real-timePCR

在常规PCR的基础上，在反应体系中加入一对特异性引物和一条特异性探针，探针两端分别标记一

个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR

扩增时，Taq酶的5'→3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，淬灭作用消

失，荧光信号产生并被检测仪器接受。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈对应关

系，通过检测荧光信号对核酸模板进行检测。

3.3

Ct值cyclethresholdvalue

1

DB36/T1904—2023

荧光定量PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)；

PBS：磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline)；

Taq酶：TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)；

5设备和材料

5.1设备

设备包括但不限于：高压灭菌锅、荧光定量PCR仪、高速冷冻离心机、普通离心机、恒温孵育器、

漩涡振荡器、组织匀浆器、生物安全柜、超净工作台、冰箱（4℃、-20℃、-80℃）、微量移液器（0.2

μL~2μL、2μL~20μL、20μL~200μL、100μL~1000μL）。

5.2材料

灭菌离心管（0.2mL、1.5mL、5mL、15mL）、灭菌吸头、灭菌PCR扩增反应管、剪刀、镊子和

灭菌棉拭子等。

6试剂

6.1本文件所用试剂均为分析纯或生化试剂，试验用水符合GB/T6682的要求。

6.2灭菌PBS（配制方法见附录A中A.1）。

6.3裂解液（配制方法见附录A中A.5）。

6.4蛋白酶K（配制方法见附录A中A.6）。

6.5乙酸钾溶液（配制方法见附录A中A.7）。

6.6Tris-饱和酚：pH＞7.8。

6.7氯仿/异戊醇(24∶1)：将氯仿和异戊醇按照体积比24∶1的比例配制。

6.8无水乙醇：-20℃预冷。

6.970%乙醇（配制方法见附录A中A.8）。

6.10TE缓冲液（配制方法见附录A中A.9）。

6.11DNA抽提试剂盒:商品化试剂盒。

6.12荧光定量PCR试剂盒：商品化试剂盒。

6.13引物与探针（见附录B中B.1）。

6.14阳性对照：支原体DNA。

6.15阴性对照：不含支原体DNA。

7检测流程

7.1生物安全要求

2

DB36/T1904—2023

实验操作及处理按照GB19489的规定执行。检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2中的

要求执行。采样参照GB14922中的要求执行。

7.2样本采集

7.2.1脏器组织

按照GB/T39760的规定，动物安乐处死，剖检，无菌采集动物的鼻咽部组织、气管组织或肺脏，剪

取待检样本2.0g于无菌15mL离心管中，密封、编号，待检。

7.2.2实验动物垫料

取1.0g实验动物垫料置于15mL离心管中，密封、编号，待检。

7.2.3实验动物设施设备

用灭菌棉拭子拭取实验动物设施设备出风口初效滤膜表面沉积物，将拭子置入灭菌15mL离心管

中，密封、编号，待检。

7.3样本处理

7.3.1脏器组织

在生物安全柜内用灭菌剪刀将脏器组织剪碎后，加入4mL灭菌PBS，使用电动匀浆器充分匀浆2

min，编号备用。

7.3.2实验动物垫料和实验动物设施设备

向装有样品的离心管中加入4mL灭菌PBS（垫料或棉拭子需全部浸泡于液体中）。密封后浸泡10

min，充分混匀，静置30min，取上清液转入另一无菌5mL离心管中，编号备用。

7.4样本存放

采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置于-80℃冰箱保

存，避免反复冻融。

7.5样本DNA提取

7.5.1样本DNA提取步骤如下：

a)取350μL已处理好的样品加入350μL裂解液，然后加入30μL的蛋白酶K溶液，混匀，56℃

水浴2h或37℃消化过夜；

b)向消化后的裂解液中加入70μL乙酸钾溶液，混匀冰浴10min，4℃，12000g离心10min，取

上清液转移至新的1.5mL离心管；

c)加入等体积的Tris-饱和酚，缓慢颠倒混匀10min，4℃，12000g离心10min；

d)取上清液至新的离心管中，加入0.5倍体积的Tris-饱和酚和0.5倍体积的氯仿/异戊醇（24∶1），

12000g离心10min；

e)取上清液至新的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），12000g离心10min；

f)取上清液至新的离心管中，加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，轻轻摇晃至絮状沉淀析出，

12000g离心10min，弃上清；

g)加入500μL70%乙醇冲洗沉淀表面及管壁，12000g离心3min，吸去上清液；

3

DB36/T1904—2023

h)室温下放置2min使残余乙醇完全挥发，加入100μLTE缓冲液溶解DNA沉淀，即可用于检

测或-20℃保存备用。

7.5.2样本DNA也可采用同等效果的商品化试剂盒提取，提取按照试剂盒的使用说明书操作。

7.6荧光定量PCR检测

荧光定量PCR检测应符合附录C。

8结果判定

8.1质控标准

阳性对照Ct值≤35，且出现对数扩增曲线。

阴性对照及空白对照无Ct值，且无对数扩增曲线。

二者均成立才可判定试验成立。

8.2检测结果判定

符合8.1条件下，被检样本Ct值≤35，且出现对数扩增曲线，判定为阳性；被检样本无Ct值且无

对数扩增曲线，判定为阴性。被检样本35＜Ct值≤40时，重复一次，如果Ct值仍然≤40，并且曲线

有明显的对数增长期，则判定阳性；否则判定阴性。

4

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AA

附录A

（规范性附录）

溶液配制方法

A.1灭菌PBS溶液

准确称取氯化钠（NaCl）8.00g，氯化钾（KCl）0.20g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.24g，磷酸氢二

钠（Na2HPO4·12H20）3.65g，先加入800mL去离子水溶解，调节溶液pH至7.2~7.4，定容至1000mL。

在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min，冷却备用。

A.20.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）

称取18.6g乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2），加入80mL水中，充分搅拌，用氢氧化钠（NaOH）

颗粒调pH至8.0，加水定容至100mL。在103.4kPa（121℃)条件下灭菌20min。

A.31mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH8.0）

称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris)溶解于800mL水中，用盐酸（HCl）调pH至8.0，加水定容至1

000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。

A.45mol/L氯化钠溶液

称取29.22g氯化钠（NaCl）溶于80mL水中，加水定容至100mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭

菌20min。

A.5裂解液

在约700mL水中，依次加入10mL0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液、20mL1mol/L三羟甲基氨基

甲烷-盐酸溶液、80mL5mol/L氯化钠溶液。另称取10g十二烷基硫酸钠（C12H25O4SNa，SDS），混合

后加热至完全溶解后冷却至室温，用水定容至1000mL，室温保存备用。

A.6蛋白酶K溶液

将20mg蛋白酶K（＞20U/mg）溶于9.5mL水中，轻摇至完全溶解后，加水定容至10mL。于-20℃

保存备用。

A.7乙酸钾溶液（pH4.8）

称取29.43g乙酸钾（KAc）溶于60mL水，用冰乙酸（HAc）调pH至4.8，加水定容至100mL。在103.4kPa

（121℃）条件下灭菌20min。

5

DB36/T1904—2023

A.870%乙醇

取70mL无水乙醇，加入蒸馏水30mL，充分混匀后备用。

A.9TE缓冲液（pH8.0）

在约800mL水中，依次加入10mL1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液和2mL0.5mol/L乙二铵四乙

酸二钠溶液，用盐酸（HCl）调pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。

6

DB36/T1904—2023

BB

附录B

（规范性附录）

荧光定量PCR的引物与探针

B.1引物与探针序列

正向引物5’-ATGGAGTGACACAGCGTGCA-3’

反向引物5’-GGATAACGCTTGCRACCTATGTAT-3’

探针FAM-CCGCGGCTGCTGGCACATAGTT-BHQ-1

注：探针可选用具有与FAM和BHQ-1荧光基团相同效果的其他荧光报告基团和荧光淬灭基团。

7

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CC

附录C

（规范性附录）

荧光定量PCR检测方法

C.1荧光定量PCR反应体系

反应液的配制应在冰上操作，每次反应同时设计阳性对照、阴性对照和空白对照。以支原体DNA

作阳性对照、不含支原体的DNA作阴性对照、以灭菌去离子水作空白对照。

表C.1每个荧光定量PCR反应体系

反应组分用量终浓度

2×mix10μL1×

正向引物（10μmol/L）0.8μL400nmol/L

反向引物（10μmol/L）0.8μL400nmol/L

探针（10μmol/L）0.4μL200nmol/L

DNA模板2μL-

灭菌去离子水6μL-

总体积20μL-

注：反应体系可根据荧光定量PCR检测试剂盒进行相应调整。

C.2荧光定量PCR反应条件

表C.2荧光定量PCR反应条件

步骤温度时间采集荧光信号循环数

预变性95℃2min-1

变性95℃10s-

退火60℃