临检基础实训项目血涂片制备与染色白细胞分类计数

试验二、血涂片制备与染色试验内容一、原理二、器材三、试剂与标本四、操作五、注意事项课堂目的1.学会制备一张良好的血涂片2.能染色一张良好的血涂片3.通过试验掌握血涂片制备的影响原因、瑞氏染色的原理及注意事项试验难点试验重点试验重点一、原理瑞氏染液是由酸性染料伊红和碱性染料美蓝构成的复合染料溶于甲醇而成，细胞的受色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，多种细胞成分化学性质不一样，对多种染料的亲和力也不一样样，因此，染色后，在同一张血片上，可以看到多种不一样的色彩。

例如血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；嗜碱性颗粒和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝结合，染蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色，称为中性物质。二、器材三、试剂与标本1．载玻片2．推片3．显微镜4.染色架1.瑞氏染液：瑞氏染料、甲醇2.磷酸盐缓冲液（pH6.4～6.8）磷酸二氢钾（KH2PO4）磷酸氢二钠（Na2HPO4）3.EDTA－K2抗凝静脉血四、操作1.制备血涂片（1）取血滴：取血液一滴置于载玻片的一端。（2）散开血滴：左手平执载玻片，右手持推片在血滴前沿，后拉接触血滴，使血液沿推片边缘散开。（3）推片：将推片与载玻片呈30～35°角，用均匀速度向前将血液推成厚薄合适的血涂片。（4）干燥涂片：空气干燥血涂片应呈舌状，头、体、尾三部分，且清晰可见。所有血液必须在推片抵达末端前用完。血涂片制备示意图血膜分布不均匀的原因血膜分布不均匀的原因四、操作2．瑞氏染色（1）标识涂片：在载玻片的一端用记号笔编号，用蜡笔在两端画线，以防染色时染液外溢，然后将玻片平置于染色架上。（2）加染液：滴加染液数滴，使其迅速盖满血涂片，固定约0.5～1min。（3）加缓冲液：滴加等量或稍多的缓冲液，轻轻摇动玻片或用吸球将染液充足混合。染色5～10min。（4）冲洗：用靠近中性的流水冲去染液，待干后镜检。3．观测成果：在低倍镜下观测血涂片制作与染色，在油镜下观测细胞的染色与形态。五、注意事项1.玻片必须清洁、干燥、无尘。①使用玻片时，只能手持玻片边缘，切勿触及玻片表面，以保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。②新玻片：应用1mol/LHCL浸泡24小时，用清水彻底冲洗，烘干备用。③用过的玻片：应在清洁液中加热20min，然后用水冲洗，最终用蒸馏水冲洗。④边缘破碎、表面有划痕的玻片不能再用。2．血涂片质量不佳的影响原因:血滴大小、角度大小、推片速度、血细胞比容、载玻片的清洁、推片的宽度等。五、注意事项3．染色时注意事项（1）干燥涂片：血涂片干透后方可固定染色，否则细胞尚未牢固地吸附在玻片上，在染色过程中轻易脱落。（2）染色时间的长短：与染液浓度、室温高下及有核细胞多少有关。染液淡、室温低、细胞多则染色时间要长；反之，可减少染色时间。必要时可增长染液量或延长时间。每批染色液和缓冲液，均需试染，以便掌握最佳染色时间和加缓冲液的比例。（3）染液不能过少，以防蒸发沉淀。（4）冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲洗。（5）染色过深脱色时，加甲醇；染色过浅时复染。（6）染色偏酸或偏碱时，应更换缓冲液再染。（7）瑞氏染液新鲜配制的染液偏碱，染色效果较差，经在室温下贮存一定期间，美蓝逐渐转变为天青B后方可使用，这一过程称染料成熟。放置时间愈久，天青B愈多，染色效果愈好，但必须盖严瓶口，以免甲醇挥发或氧化成甲酸。甲醇必须用AR（无丙酮）。染液中也可加中性甘油3ml，防止甲醇挥发，使细胞染色较清晰。【小结】

推片：载玻片→取血滴→散开血滴→推片

→干燥染色：

0.5－1min

5－10min

加染液加缓冲液流水冲洗干后镜检试验六白细胞形态观测【目的】掌握外周血中五种白细胞正常形态。【原理】用一般光学显微镜，直接观测经瑞氏染色后血涂片上的白细胞。从细胞大小、细胞核、细胞质等多方面观测细胞。【器材】1.显微镜2.香柏油、擦镜纸、乙醚【标本】制备染色良好的血涂片。1.制作血片并染色，干燥后待用2.低倍镜观测白细胞的数量、分布和染色状况3.选择血涂片体尾交界处染色良好的部位，用油镜观测多种白细胞的形态4.用彩笔绘制五种白细胞并描述其形态特性【操作】1.中性粒细胞

胞体圆形，直径10-15um，为红细胞的两倍。胞质丰富，粉红色，含大量细小均匀的淡紫红色中性颗粒。细胞核染色质粗糙不匀，排列紧密，为深紫红色。（1）中性杆状核粒细胞：核径最窄处不小于最宽处1/3为中性杆状核粒细胞

1.中性粒细胞（2）中性分叶核粒细胞：核径最窄处不不小于最宽处1/3为中性分叶核粒细胞1.中性粒细胞胞体圆形，直径13-15um，略不小于中性粒细胞。胞浆内充斥粗大、均匀、整洁、排列紧密的桔红色嗜酸性颗粒，核常分2叶，似眼镜形。嗜酸性粒细轻易破碎，颗粒可分散于细胞周围。2.嗜酸性粒细胞细胞圆形，直径10-12um，略不不小于中性粒细胞。胞浆少，常呈淡红或淡紫红色，含少许粗大、不均匀、排列不规则的紫黑色嗜碱性颗粒，常盖于核上。

3.嗜碱性粒细胞胞体不规则形圆形或椭圆形，为外周血中最大的细胞，直径15-25um，胞浆丰富，染淡蓝或灰蓝色，呈毛玻璃样半透明，具有大量细小、灰尘样紫红色嗜天青颗粒。细胞核大，呈不规则圆形、肾形、马蹄形或折叠扭曲。染色质细致、疏松如网状。4.单核细胞（1）大淋巴细胞（2）小淋巴细胞5.淋巴细胞（1）大淋巴细胞：体积较大，直径10-15um，胞浆丰富，呈透明蓝色，常有少许粗大、大小不均的紫红色嗜天青颗粒。细胞核呈圆形或肾形，核染色质比小淋巴疏松。5.淋巴细胞

（2）小淋巴细胞：细胞圆形，直径6-10um，胞浆很少，有的仅在核的一侧出现一线蓝色胞浆，甚至完全没有。细胞核圆形，偶见凹陷，染色质粗糙致密，可有块状。

5.淋巴细胞

小结：外周血多种正常白细胞形态比较白细胞分类计数【目的】掌握显微镜外周血白细胞分类计数（differentialleukocytecount，DLC）的措施及多种白细胞的正常形态。

【原理】将血液制成细胞分布均匀的血涂片，用瑞氏染液染色，根据各类细胞的形态特点和颜色差异将白细胞区别并进行计数。一般分类100个白细胞，计算得出多种白细胞所占的百分率。

【器材】1．显微镜2．香柏油、拭镜纸、清洁液【操作】1.制备血涂片2.瑞特染色3.低倍镜观测低倍镜下观测全片，包括白细胞的分布和染色状况。4.油镜下分类选择血涂片体、尾交界处细胞分布均匀、着色良好的区域，滴加香柏油1滴，按一定的方向次序对所见到的每个白细胞进行分类，并作好记录，合计数100个白细胞。5.计算求出各类白细胞所占的百分率。6.汇报成果百分率（%）。【参照值】【注意事项】1．计数区域由于多种白细胞体积大小不等，体积较小的淋巴细胞在血涂片的头、体部分较多，而尾部和两侧以中性粒细胞和单核细胞较多，因此分类最佳区域为体、尾交界处。2．分类措施（1）分类时要有秩序地、循一定方向次序地持续进行，既不反复亦不遗漏，防止主观选择视野（2）分类计数成果的记录可采用手工划“正”或“＋＋＋＋”的措施。3．分类计数的细胞数白细胞总数在（3.0～15.0）×109/L之间者，分类计数100个细胞。总数在15.0×109/L以上时，应计数200个白细胞，而总数低于3.0×109/L时，则应选用2张血涂片计数50～100个白细胞。4．计数成果各类白细胞所占百分率，乘以白细胞总数，即可求得每升血液中各类白细胞数量的绝对值。5．影响原因（1）分类中如见血涂片上有幼红细胞，应逐一计数但不计入100个白细胞