羊肚菌菌种标准

11范围本文件规定了羊肚菌菌种的技术要求,描述了相应的检验方法,同时对检验规则及标签、标志、包装、贮运等要求进行了规定。本文件适用于羊肚菌[梯棱羊肚菌(Morchellaimportuna)、六妹羊肚菌(M.sextelata)、七妹羊肚菌(M.eximia)等]菌种的生产、流通和使用。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T191包装储运图示标志GB/T12728食用菌术语NY/T528—2010食用菌菌种生产技术规程NY/T1284食用菌菌种中杂菌及害虫的检验3术语和定义GB/T12728界定的以及下列术语和定义适用于本文件。菌核sclerotium由营养菌丝聚集而成的颗粒物。[来源:GB/T12728—2006,2.2.32,有修改]3.2固体原种solidmotherspawn由母种移植到固体培养料上扩大培养而成的菌丝体纯培养物。3.3液体原种liquidmotherspawn由母种移植到液体培养基中扩大培养而成的菌丝体纯培养物。3.4交配型基因matingtypegene控制羊肚菌有性繁殖和子实体形成的基因位点。4技术要求4.1母种4.1.1感官要求应符合表1的规定。2表1母种感官要求项目要求菌丝生长量长满斜面菌丝体表面特征菌丝体初期稀疏、灰白色,后期菌丝浓密颜色变深,呈灰白色略带黄色菌核有,颗粒状表面分泌物无菌落边缘整齐杂菌无斜面背面外观培养基不干缩,边缘较整齐,颜色均匀、无暗斑气味有羊肚菌菌种特有的香味,无酸、臭、霉等其他异味4.1.2菌丝生长速度在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(以下简称PDA培养基,见附录A)上,16℃~20℃避光培养,菌丝长满斜面的时间为4d~5d,待长满斜面后再培养3d~5d,菌核产生后使用。4.1.3交配型基因具有MAT1-1-1和MAT1-2-1两种交配型基因。4.1.4母种栽培性状母种应经出菇试验,在农艺性状和商品性状正常的条件下,鲜菇产量应不低于0.2kg/m2。4.2原种4.2.1固体原种4.2.1.1感官要求应符合表2的规定。表2固体原种感官要求项目要求菌丝生长量长满容器菌丝体特征菌丝体初期稀疏、灰白色,后期菌丝浓密颜色变深,呈黄褐色菌核有,粒状培养基及菌丝体紧贴瓶(袋)壁,无干缩表面分泌物无拮抗现象无杂菌无气味有羊肚菌菌种特有的香味,无酸、臭、霉等其他异味34.2.1.2菌丝生长速度在适宜培养基上,16℃~20℃避光培养,14d~20d菌丝长满容器(750mL菌种瓶)且有淡黄色或黄褐色菌核。4.2.2液体原种4.2.2.1感官要求应符合表3的规定。表3液体原种感官要求项目要求培养液清澈透明菌丝体特征浅白色,色泽均匀;菌丝球较小且均匀气味有羊肚菌菌种特有的香味,无酸、臭、霉等异味4.2.2.2菌丝生长速度4.2.2.2.1三角瓶置于转速为150r/min~180r/min的摇床上,16℃~20℃避光培养3d~5d。4.2.2.2.2发酵罐无菌空气通气量保持在0.5m3/min~1.2m3/min,罐压保持在0.02MPa~0.04MPa,温度16℃~20℃,培养3d~5d。4.2.2.3质量要求检测菌丝球密度达70%~80%,菌丝球直径小于0.2cm,菌丝体生物量大于8g/L,无杂菌。4.3栽培种4.3.1感官要求应符合表4的规定。表4栽培种感官要求项目要求菌丝生长量长满菌瓶(袋)菌丝体特征菌丝体初期稀疏、灰白色,后期菌丝浓密颜色变深,呈黄褐色,菌丝空间分布均匀,色泽一致菌核有,粒状培养基及菌丝体紧贴瓶(袋)壁,无干缩表面分泌物无拮抗现象无杂菌无气味有羊肚菌菌种特有的香味,无酸、臭、霉等异味4.3.2菌丝生长速度在适宜培养基上,16℃~20℃避光恒温培养,菌丝长满容器(栽培袋17cm×35cm×0.005cm)时4间为20d~25d。5检验方法5.1感官检验抗现象,鼻嗅判断气味。5.1.2生物学特征检验:从被检菌种中挑取菌丝少许,置于洁净的载玻片上做成水封片,用不低于10×40的光学显微镜观察菌丝体透明度、分枝情况,每一检样应观察不少于50个视野。菌丝球测定:随机取1mL菌液于培养皿中,计算菌球数量,随机取10个菌丝球测量直径,3次计算平均值。5.1.3杂菌:按NY/T1284规定的方法检验。5.2菌丝生长速度5.2.1母种:见附录A中配方,接种(3~5)mm×(3~5)mm的接种块1块~2块,在16℃~20℃条件下培养,计算长满所需天数。5.2.2固体原种:见附录B中配方,每支母种接原种6瓶(袋)~8瓶(袋),接种块大于或等于12mm×15mm,在16℃~20℃条件下培养,计算长满所需天数。5.2.3液体原种:见附录C中配方,三角瓶每瓶接种(3~5)mm×(3~5)mm的接种块4块~6块,发酵罐接种量为培养基投料量的1%,在16℃~20℃条件下培养,计算培养天数。5.2.4栽培种:见附录B中配方,每瓶固体原种接栽培种50瓶(袋)~60瓶(袋),在16℃~20℃条件下培养,计算长满所需天数。5.3交配型基因检测提取羊肚菌菌丝总DNA,通过PCR检测两种交配型基因MAT1-1-1和MAT1-2-1的符合性。检测方法见附录D。5.4母种栽培性状将被检母种制作成原种,附录B中任选一个配方,制成菌瓶(袋)。按照常规方法发菌、出菇,根据表5所列项目,做好栽培记录。表5母种栽培农艺性状和商品性状检验记录检验项目检验结果检验项目检验结果母种长满所需时间d总产kg原种长满所需时间d平均单产kg/m2栽培种长满菌瓶(袋)所需时间d出第一潮菇所需时间d菌柄直径、长度第一潮菇产量kg55.5留样固体菌种各级菌种应留样备查,留样的数量应每个批号3支(瓶、袋),于4℃~6℃贮存,贮存至使用者在正常生产条件下该批菌种出第一潮菇。6检验规则6.1抽样母种按品种、培养条件、接种时间分批编号,原种、栽培种按菌种来源、制种方法和接种时间分批编号。按批随机抽取被检样品。母种、原种、栽培种的抽样量分别为该批菌种量的10%、5%、1%,但每批抽样数量不应少于10支(瓶、袋),超过100支(瓶、袋)的,可进行两级抽样。6.2判定规则按第4章要求进行判定,检验项目全部符合要求时,为合格菌种,其中任何一项不符合要求,均为不合格菌种。7.1.1产品标签每支(瓶、袋、罐)菌种应贴有清晰注明以下要素的标签:a)产品名称(品种名称、菌种名称、菌株代号、类别);b)生产单位;c)接种日期;d)执行文件编号。7.1.2包装标签菌种包装应贴有清晰注明以下要素的包装标签:a)产品名称(品种名称、菌种名称、菌株代号、类别);c)出厂日期;d)保质期、贮存条件;e)数量;f)执行文件编号;g)菌种生产经营许可证编号。7.1.3包装储运图示标志按GB/T191的规定,应注明以下图示标志:a)小心轻放标志;c)防晒、防高温标志;d)防止倒置标志;6e)防止重压标志。7.2包装7.2.2母种外包装采用木盒或有足够强度的纸箱,内填缓冲物。7.2.3原种、栽培种外包装采用洁净、干燥的塑料箱、编织袋或有足够强度的纸箱,箱内附产品合格证书和使用说明(包括菌种种性、培养基配方及适用范围等)。7.3运输7.3.1不应与有毒、有害、有异味的物品混装混运。7.3.2运输工具应清洁、卫生、无污染物。7.3.3宜用冷藏车运输。7.4贮存7.4.1母种在4℃~6℃条件下贮存,贮存期不超过90d。7.4.2原种应尽快使用。固体原种若短期不用,在4℃~6℃条件下,清洁、通风、干燥(相对湿度50%~70%)、避光的室内存放,贮存期一般不超过45d;液体原种应及时使用,不贮存。7.4.3栽培种应尽快使用,若短期不用,在4℃~6℃条件下,清洁、通风、干燥(相对湿度50%~70%)、避光的室内存放,贮存期以不超过20d为宜。7附录A(资料性)羊肚菌母种培养基配方PDA培养基:马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g,水1000mL,pH自然。附录B8(资料性)羊肚菌固体原种及栽培种培养基配方B.1麦粒30%,木屑67%,生石灰1%,石膏1%,过磷酸钙1%,含水量60%,pH6.0~8.0。B.2麦粒50%,木屑47%,生石灰1%,石膏1%,过磷酸钙1%,含水量60%,pH6.0~8.0。B.3麦粒50%,玉米芯47%,生石灰1%,石膏1%,过磷酸钙1%,含水量60%,pH6.0~8.0。B.4麦粒30%,木屑37%,谷壳30%,生石灰1%,石膏1%,过磷酸钙1%,含水量60%,pH6.0~8.0。附录C(资料性)羊肚菌液体菌种培养基配方C.1马铃薯100g(取用浸出液),麦麸30g[粒径以过50目筛(筛网孔径280μm)为宜],红糖15g,葡萄糖10g,蛋白胨1.5g,磷酸二氢钾1.5g,硫酸镁0.75g,维生素B10.1mg,水1000mL,pH自然。C.2马铃薯200g(取用浸出液),葡萄糖20g,蛋白胨2g,磷酸二氢钾1.5g,硫酸镁0.5g,氯化钠0.1g,水1000mL,pH自然。C.3马铃薯200g(取用浸出液),麦麸5g(粒径以过50目筛为宜),葡萄糖10g,蛋白胨2g,磷酸二氢钾0.5g,硫酸镁0.5g,氯化钠0.1g,水1000mL,pH自然。910(资料性)交配型基因检测方法D.1菌丝DNA提取D.1.1用接种针刮取约0.5g母种菌丝(尽量不要取到培养基)置于1.5mL离心管中。D.1.2向上述加入样品的离心管中加入少许石英砂,再加入250μL的2×CTAB裂解液,用研磨棒进行充分研磨,直至呈匀浆状,再加入600μL的2×CTAB裂解液,混匀。D.1.3将装有研磨充分样品液的离心管置于65℃水浴1h(期间每10min翻转离心管1次)。D.1.4加入苯酚和三氯甲烷各300μL,翻转离心管数次,13000r/min离心10min。D.1.5收集上层水相,转至新的1.5mL离心管中。D.1.6重复操作D.1.3、D.1.4,2次~3次,直至两相界面上无沉淀为止。D.1.7加入等体积的三氯甲烷抽提1次,收集上层水相。D.1.8加入0.5倍~1.0倍体积预冷的异丙醇(或2倍体积的无水乙醇),4℃下13000r/min离心10min。D.1.9小心倒去上清液,将离心管扣压在干净的面巾纸上,吸干残留的上清液。D.1.10加入1mL预冷的75%(体积分数)乙醇,翻转离心管数次,13000r/min离心10min,弃除上清液,重复2次。D.1.11置于室温或真空系统中干燥。D.1.12加入50μL无菌水室温溶解,于-20℃保存备用。D.1.13电泳检测基因组DNA的提取情况:将提取的DNA样品与10×上样缓冲液(已加溴酚蓝)按10∶1混合上样于1%的琼脂糖凝胶,于150V电压下电泳10min,并于紫外灯下检测。D.2PCR扩增D.2.1检测交配型基因的引物详情见表D.1。表D.1羊肚菌属黑色羊肚菌支系和黄色羊肚菌支系交配型基因的扩增引物支系MAT1-1-1扩增引物MAT1-2-1扩增引物片段长度bp黑色羊肚菌支系MAT1-1L:5'-TTACCTTACTGGACTGGTTC-3'MAT1-2L:5'-TCCTATGAATGCGTAAGTTC-3'729~736MAT1-1R:5'-AATGCAAGTAGGTGTCATTC-3'MAT1-2R:5'-GTATTATCACCAACCGTAGC-3'398~408黄色羊肚菌支系MAT1-1L:5'-TAGGTAGGTCCCAAGAACACC-3'MAT1-2L:5'-CTTGCCACTACGCGGTCTAT-3'869~880MAT1-1R:5'-GATACCATGGCGAACATTCTG-