TrxR抑制剂AA1：肝癌治疗新曙光-抗肝癌活性及机制深度剖析

TrxR抑制剂AA1：肝癌治疗新曙光——抗肝癌活性及机制深度剖析一、引言1.1研究背景与意义肝癌，作为全球范围内严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率长期居高不下。据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球癌症负担数据显示，肝癌的新发病例数达到90.6万，死亡病例数约83万，在所有癌症相关死亡原因中位居第二。在中国，肝癌的形势更为严峻，由于乙肝病毒（HBV）的高感染率等因素，我国肝癌的发病率和死亡率均占全球的一半以上。肝癌起病隐匿，早期症状不明显，多数患者确诊时已处于中晚期，错过了手术切除等根治性治疗的最佳时机。目前，肝癌的治疗手段主要包括手术切除、肝移植、局部消融、介入治疗、靶向治疗和免疫治疗等。手术切除和肝移植是潜在的根治性治疗方法，但仅适用于早期肝癌患者，且肝移植面临供体短缺、免疫排斥等问题。对于中晚期肝癌患者，介入治疗如经动脉化疗栓塞（TACE）是常用的治疗方法之一，但疗效有限且易复发。近年来，靶向治疗和免疫治疗的出现为肝癌治疗带来了新的希望，如索拉非尼、仑伐替尼等靶向药物以及帕博利珠单抗、纳武利尤单抗等免疫检查点抑制剂在一定程度上改善了患者的生存状况，但仍存在耐药性、不良反应等问题，且部分患者对这些治疗方法并不敏感，总体治疗效果仍不尽人意。因此，开发新型、高效、低毒的抗肝癌药物具有迫切的临床需求。硫氧还蛋白还原酶（TrxR）是一种含硒的吡啶核苷酸二硫化物氧化还原酶，在维持细胞内氧化还原平衡中发挥着关键作用。TrxR通过催化硫氧还蛋白（Trx）的二硫键还原，为细胞内的抗氧化防御系统提供还原力，参与调节细胞的增殖、凋亡、分化等多种生物学过程。研究发现，TrxR在多种肿瘤细胞中高表达，包括肝癌细胞，其异常表达与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移密切相关。抑制TrxR的活性可以破坏细胞内的氧化还原稳态，导致活性氧（ROS）积累，进而诱导肿瘤细胞凋亡，因此，TrxR成为了极具潜力的抗癌靶点。TrxR抑制剂AA1是一种新型的小分子化合物，具有独特的化学结构和作用机制。前期研究表明，AA1能够特异性地抑制TrxR的活性，在多种肿瘤细胞系中表现出显著的抗肿瘤活性。然而，目前关于AA1抗肝癌活性的研究尚处于初步阶段，其作用机制和体内疗效仍有待深入探究。本研究旨在系统地研究TrxR抑制剂AA1的抗肝癌活性，通过体外细胞实验和体内动物实验，明确其对肝癌细胞增殖、凋亡、周期、氧化应激等生物学行为的影响，揭示其作用机制，并评估其体内抗肿瘤效果和安全性，为肝癌的治疗提供新的候选药物和理论依据。这不仅有助于拓展对肝癌发病机制和治疗靶点的认识，还可能为临床肝癌治疗带来新的策略和方法，具有重要的科学意义和临床应用价值。1.2研究目的与创新点本研究旨在全面且深入地探究TrxR抑制剂AA1的抗肝癌活性及其作用机制。具体而言，首先通过体外细胞实验，精准分析AA1对肝癌细胞增殖、凋亡、周期等生物学行为的影响，从细胞层面揭示其抗肝癌的初步作用效果；进而深入探讨AA1影响肝癌细胞氧化应激、DNA损伤修复等关键细胞内过程的分子机制，明确其在细胞内信号传导通路中的作用靶点与作用方式；随后利用体内动物实验，严谨评估AA1在荷瘤小鼠模型中的抗肿瘤效果，包括对肿瘤生长抑制情况、肿瘤转移的影响等，并详细分析其对机体免疫系统、肿瘤免疫微环境以及肠道菌群等方面的作用，综合评估其在整体动物模型中的治疗效果与安全性，为后续临床研究奠定坚实基础。本研究的创新点显著。在作用机制方面，以往针对TrxR抑制剂抗肝癌作用机制的研究多集中在单一信号通路或细胞过程，而本研究将全面且系统地从多个角度，如氧化应激、DNA损伤、线粒体功能、自噬以及免疫调节等，深入探究AA1的作用机制，有望发现全新的分子作用靶点与信号转导途径，为肝癌治疗机制研究提供更为全面和深入的视角。在临床应用潜力上，目前临床上针对肝癌的治疗药物仍存在诸多局限性，AA1作为一种新型的TrxR抑制剂，具有独特的化学结构，若能在本研究中展现出良好的抗肝癌活性与较低的毒副作用，将极有可能成为具有潜在临床应用价值的新型抗肝癌药物，为肝癌患者提供新的治疗选择，这对改善肝癌患者的预后和提高其生活质量具有重要意义。二、TrxR与肝癌的关联剖析2.1TrxR的结构、功能及作用机制硫氧还蛋白还原酶（TrxR）是一种含硒的吡啶核苷酸二硫化物氧化还原酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员。在哺乳动物中，TrxR主要以三种同工酶的形式存在，分别为硫氧还蛋白R1（TrxR1，细胞质型）、TrxR2（线粒体型）和主要在睾丸中表达的TrxR3（又名TGR）。其中，胞质型TrxR1发现最早且分布最为广泛，是目前研究最为深入的一种同工酶。从结构上看，TrxR是一种NADPH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒酶。每个亚基由N端结构域、中间结构域和C端结构域组成。N端结构域含有FAD结合位点，负责与FAD辅因子紧密结合，FAD在电子传递过程中起着关键作用；中间结构域主要参与二聚体的形成，维持酶的整体结构稳定性；C端结构域则包含了独特且必需的硒代半胱氨酸（Sec）残基，这一残基在酶的催化活性和与底物的相互作用中发挥着不可或缺的作用。Sec残基具有较低的pKa值，使其易于与亲电试剂发生反应，这一特性赋予了TrxR独特的催化活性和对底物的特异性。TrxR的主要功能是维持细胞内氧化还原平衡，它和硫氧还蛋白（Trx）、NADPH共同构成了硫氧还蛋白系统。在该系统中，TrxR催化NADPH将电子传递给FAD，使其还原为FADH2。随后，FADH2将电子转移至硒代半胱氨酸残基，形成硒醇阴离子，该阴离子具有很强的亲核性。硒醇阴离子能够攻击氧化型硫氧还蛋白（Trx-S2）中的二硫键，将其还原为还原型硫氧还蛋白（Trx-SH2），同时自身被氧化。还原型硫氧还蛋白（Trx-SH2）作为重要的细胞内还原剂，参与了众多生物学过程，如抗氧化防御、蛋白质修复和转录调节等。在抗氧化防御方面，Trx-SH2可以直接还原细胞内的活性氧（ROS），如过氧化氢（H2O2）等，将其转化为水，从而降低细胞内ROS水平，保护细胞免受氧化损伤。在蛋白质修复过程中，Trx-SH2能够还原氧化的蛋白质二硫键，使其恢复正常的结构和功能。此外，Trx-SH2还可以通过与一些转录因子相互作用，调节基因的表达，参与细胞的增殖、凋亡、分化等生物学过程。在细胞生长增殖方面，TrxR也发挥着重要作用。研究表明，TrxR活性的抑制会导致细胞生长受到抑制。这是因为TrxR参与了核苷酸还原酶的调节，核苷酸还原酶是在复制细胞或者快速生长的肿瘤细胞中特异表达的酶，负责催化核糖核苷酸还原为脱氧核糖核苷酸，为DNA合成提供原料。当TrxR活性被抑制时，核苷酸还原酶的活性也会受到抑制，从而导致DNA合成受阻，细胞生长增殖受到抑制。此外，TrxR还可以通过调节细胞内的氧化还原状态，影响细胞周期相关蛋白的表达和活性，进而调控细胞周期的进程。在肿瘤细胞中，由于其快速增殖和代谢活跃，对核苷酸的需求大幅增加，因此TrxR的高表达能够为肿瘤细胞的生长增殖提供充足的脱氧核糖核苷酸，促进肿瘤细胞的快速分裂和生长。2.2TrxR在肝癌发生发展中的关键角色大量研究表明，TrxR在肝癌的发生发展过程中扮演着至关重要的角色，其高表达与肝癌细胞的多种恶性生物学行为密切相关。在肝癌细胞增殖方面，TrxR发挥着显著的促进作用。研究发现，TrxR在肝癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织，且其表达水平与肝癌细胞的增殖活性呈正相关。通过RNA干扰技术下调肝癌细胞中TrxR的表达后，细胞的增殖能力明显受到抑制。进一步研究发现，TrxR通过维持细胞内的氧化还原稳态，为肝癌细胞的增殖提供适宜的微环境。在正常生理状态下，细胞内的氧化还原平衡对细胞的正常功能维持至关重要。而肝癌细胞由于其快速增殖和代谢活跃，会产生大量的活性氧（ROS）。若ROS积累过多，会对细胞造成氧化损伤，影响细胞的增殖。TrxR能够催化还原型辅酶II（NADPH）将电子传递给氧化型硫氧还蛋白（Trx-S2），使其还原为还原型硫氧还蛋白（Trx-SH2）。还原型硫氧还蛋白可以直接还原细胞内的ROS，如过氧化氢（H2O2）等，将其转化为水，从而降低细胞内ROS水平，保护细胞免受氧化损伤，确保肝癌细胞能够在相对稳定的氧化还原环境中持续增殖。此外，TrxR还参与了核苷酸还原酶的调节，核苷酸还原酶是DNA合成的关键酶，负责催化核糖核苷酸还原为脱氧核糖核苷酸。当TrxR活性被抑制时，核苷酸还原酶的活性也会受到抑制，导致DNA合成受阻，进而抑制肝癌细胞的增殖。TrxR对肝癌细胞凋亡也具有重要的调控作用，其高表达能够抑制肝癌细胞凋亡。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡过程，在维持机体正常生理功能和抑制肿瘤发生发展中起着关键作用。正常情况下，细胞内的凋亡信号通路处于平衡状态，当受到内外环境刺激时，凋亡信号通路被激活，细胞发生凋亡。然而，在肝癌细胞中，TrxR的高表达会破坏这种平衡，抑制凋亡信号的传导。研究表明，TrxR可以通过调节凋亡相关蛋白的表达和活性来抑制肝癌细胞凋亡。例如，TrxR能够上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时下调促凋亡蛋白Bax的表达。Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡调控的关键蛋白，其中Bcl-2具有抑制细胞凋亡的作用，而Bax则促进细胞凋亡。TrxR通过调节Bcl-2和Bax的表达比例，使细胞凋亡的阈值升高，从而抑制肝癌细胞凋亡。此外，TrxR还可以通过抑制caspase家族蛋白酶的活性来抑制凋亡。caspase家族蛋白酶是细胞凋亡执行阶段的关键酶，其激活会导致细胞凋亡的发生。TrxR能够与caspase-3等蛋白酶结合，抑制其活性，从而阻断凋亡信号的传导，使肝癌细胞逃避凋亡。在肝癌细胞的侵袭和转移方面，TrxR同样发挥着重要作用。肿瘤的侵袭和转移是导致癌症患者死亡的主要原因之一。肝癌细胞的侵袭和转移涉及多个复杂的生物学过程，包括细胞黏附、迁移、基质降解等。研究发现，TrxR的高表达与肝癌细胞的侵袭和转移能力密切相关。在体外实验中，过表达TrxR的肝癌细胞其侵袭和迁移能力明显增强；而抑制TrxR的活性或下调其表达后，肝癌细胞的侵袭和迁移能力显著降低。进一步研究表明，TrxR通过调节细胞外基质降解酶的表达和活性来促进肝癌细胞的侵袭和转移。基质金属蛋白酶（MMPs）是一类能够降解细胞外基质的蛋白酶，在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中起着关键作用。TrxR可以上调MMP-2、MMP-9等基质金属蛋白酶的表达，增强其活性，从而促进细胞外基质的降解，为肝癌细胞的侵袭和转移创造条件。此外，TrxR还可以通过调节细胞黏附分子的表达来影响肝癌细胞的侵袭和转移。细胞黏附分子如E-cadherin、N-cadherin等在维持细胞间的黏附和组织结构的稳定中起着重要作用。TrxR能够下调上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）的表达，同时上调神经型钙黏蛋白（N-cadherin）的表达，导致上皮-间质转化（EMT）的发生。EMT过程使肝癌细胞获得更强的迁移和侵袭能力，从而促进肝癌细胞的转移。由于TrxR与肝癌的发生、发展密切相关，使其具备作为肝癌生物标志物的潜力。临床研究表明，肝癌患者血清和肿瘤组织中TrxR的表达水平明显高于健康人群，且其表达水平与肝癌的临床分期、肿瘤大小、转移情况以及患者的预后密切相关。在肝癌早期，TrxR的表达水平可能已经开始升高，随着肿瘤的进展，其表达水平进一步增加。对于晚期肝癌患者，尤其是发生转移的患者，TrxR的表达往往显著高于早期患者。通过检测血清或肿瘤组织中TrxR的表达水平，可以辅助肝癌的早期诊断、病情评估以及预后判断。高表达TrxR的肝癌患者往往预后较差，生存期较短；而低表达TrxR的患者预后相对较好。因此，TrxR有望成为评估肝癌患者病情和预后的重要生物标志物，为临床治疗方案的制定提供重要参考依据。2.3靶向TrxR的肝癌治疗策略理论基础基于TrxR在肝癌发生发展中的关键作用，以TrxR为靶点开发新型肝癌治疗策略具有坚实的理论基础和广阔的应用前景。从细胞凋亡角度来看，抑制TrxR活性能够有效诱导肝癌细胞凋亡。正常情况下，细胞内的氧化还原稳态对于维持细胞的正常生理功能至关重要。肝癌细胞中，TrxR的高表达使得细胞内的氧化还原平衡倾向于还原状态，这为肝癌细胞的存活和增殖提供了有利条件。当使用TrxR抑制剂阻断TrxR的活性时，硫氧还蛋白系统被破坏，细胞内的还原力供应减少。由于肝癌细胞代谢旺盛，本身会产生大量的活性氧（ROS），而此时缺乏有效的抗氧化防御机制，ROS便会大量积累。过量的ROS会攻击细胞内的生物大分子，如DNA、蛋白质和脂质等，导致DNA损伤、蛋白质功能丧失和脂质过氧化。这些损伤会激活细胞内的凋亡信号通路，如线粒体凋亡途径。线粒体是细胞的能量工厂，也是细胞凋亡的重要调控中心。ROS的积累会破坏线粒体膜电位，导致线粒体释放细胞色素C等凋亡因子。细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、半胱天冬酶9（caspase-9）等结合形成凋亡小体，进而激活下游的caspase级联反应，最终导致细胞凋亡。许多研究已经证实，通过抑制TrxR活性诱导肝癌细胞凋亡是一种有效的治疗策略。例如，在一项研究中，使用特定的TrxR抑制剂处理肝癌细胞系，结果显示细胞内ROS水平显著升高，线粒体膜电位降低，caspase-3、caspase-9等凋亡相关蛋白的活性明显增强，细胞凋亡率显著增加。在细胞增殖方面，抑制TrxR活性能够显著抑制肝癌细胞的增殖。如前文所述，TrxR参与了核苷酸还原酶的调节，核苷酸还原酶是DNA合成的关键酶，负责催化核糖核苷酸还原为脱氧核糖核苷酸，为细胞DNA合成提供原料。当TrxR活性被抑制时，核苷酸还原酶的活性也会受到抑制，从而导致DNA合成受阻。细胞的增殖依赖于DNA的复制和细胞分裂，DNA合成受阻使得肝癌细胞无法正常进行细胞周期，从而抑制了细胞的增殖。此外，TrxR还可以通过调节细胞内的氧化还原状态，影响细胞周期相关蛋白的表达和活性，进而调控细胞周期的进程。研究表明，抑制TrxR活性会导致细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂p21和p27的表达上调，同时下调细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E的表达。p21和p27能够与CDK结合，抑制其活性，从而使细胞周期停滞在G1期，阻止细胞进入S期进行DNA合成，最终抑制肝癌细胞的增殖。在对多种肝癌细胞系的研究中发现，使用TrxR抑制剂处理后，细胞的增殖能力明显下降，细胞周期被阻滞在G1期，这进一步证实了抑制TrxR活性对肝癌细胞增殖的抑制作用。TrxR抑制剂还可以通过调节肝癌细胞的侵袭和转移相关机制，发挥抑制肝癌细胞侵袭和转移的作用。肿瘤的侵袭和转移是一个复杂的多步骤过程，涉及细胞黏附、迁移、基质降解等多个环节。如前所述，TrxR的高表达与肝癌细胞的侵袭和转移能力密切相关。通过抑制TrxR活性，可以调节细胞外基质降解酶的表达和活性。基质金属蛋白酶（MMPs）是一类能够降解细胞外基质的蛋白酶，在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中起着关键作用。研究表明，抑制TrxR活性能够下调MMP-2、MMP-9等基质金属蛋白酶的表达，降低其活性，从而减少细胞外基质的降解，抑制肝癌细胞的侵袭和转移。此外，TrxR抑制剂还可以通过调节细胞黏附分子的表达来影响肝癌细胞的侵袭和转移。细胞黏附分子如E-cadherin、N-cadherin等在维持细胞间的黏附和组织结构的稳定中起着重要作用。抑制TrxR活性能够上调上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）的表达，同时下调神经型钙黏蛋白（N-cadherin）的表达，抑制上皮-间质转化（EMT）的发生。EMT过程会使肝癌细胞获得更强的迁移和侵袭能力，抑制EMT可以有效降低肝癌细胞的侵袭和转移能力。在体外细胞实验中，使用TrxR抑制剂处理肝癌细胞后，细胞的侵袭和迁移能力明显降低，相关分子标志物的表达也发生了相应的变化，这表明抑制TrxR活性能够有效抑制肝癌细胞的侵袭和转移。大量的研究数据表明，以TrxR为靶点开发治疗药物具有良好的可行性。在细胞实验中，多种TrxR抑制剂都表现出了对肝癌细胞的显著抑制作用。例如，金类TrxR抑制剂能够显著抑制TrxR酶活性，促进肿瘤细胞ROS的大量产生，破坏线粒体膜电位，诱导细胞凋亡。在体内动物实验中，这些抑制剂也能够明显抑制肝癌裸鼠移植瘤的生长。此外，一些临床前研究还发现，TrxR抑制剂与其他传统抗癌药物或治疗方法联合使用时，能够产生协同增效作用，提高治疗效果，同时减少传统药物的用量和毒副作用。例如，将TrxR抑制剂与化疗药物联合使用，可以增强化疗药物对肝癌细胞的杀伤作用，克服肿瘤细胞的耐药性。这些研究结果都为以TrxR为靶点的肝癌治疗策略提供了有力的支持，表明靶向TrxR是一种极具潜力的肝癌治疗新途径。三、研究设计与实验方法3.1实验材料准备3.1.1肝癌细胞系选用人肝癌细胞系HepG2、Hep3B和Huh7，这些细胞系广泛应用于肝癌研究领域，具有不同的生物学特性。HepG2细胞系来源于一名15岁的白人少年的肝癌组织，呈上皮样、聚团贴壁生长，高度分化，低转移，裸鼠中成瘤率较差，常被用于体外肝细胞代谢或遗传毒性试验。Hep3B细胞建系于1979年，源自一位患有肝癌的7岁黑人男童，该细胞产生甲胎蛋白、乙肝表面抗原等多种物质，具有广泛的研究价值，常用于检测治疗药物的疗效、体外细胞毒性、DNA合成和caspase活性。Huh7细胞于1982年从高分化肝细胞癌患者的组织中分离和培养得到，呈上皮样、贴壁生长，高度分化，HBV阴性，AFP阳性，丙型肝炎病毒（HCV）易感，可用于HCV与肝癌的关系的研究、基因表达的调节机制、新陈代谢及VLDL的分泌等。细胞系均购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC），在实验室中进行复苏、传代和培养，确保细胞处于良好的生长状态，用于后续实验。3.1.2实验动物选用6-8周龄的BALB/c裸鼠，体重在18-22g之间。裸鼠由于其免疫缺陷的特性，不会对人源肿瘤细胞产生免疫排斥反应，是构建人肝癌移植瘤模型的理想动物。实验动物购自北京维通利华实验动物技术有限公司，在无特定病原体（SPF）级动物房内饲养，环境温度控制在22±2℃，相对湿度为50%-60%，12小时光照/黑暗循环，自由摄食和饮水。在实验开始前，让动物适应环境1周，以减少环境因素对实验结果的影响。3.1.3试剂TrxR抑制剂AA1由本实验室根据前期研究成果通过化学合成方法制备，并经过高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）等技术进行纯度鉴定，确保纯度大于98%。RPMI-1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶-EDTA消化液购自美国Gibco公司，用于细胞的培养和传代。CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所，用于检测细胞增殖活性。AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自美国BD公司，用于检测细胞凋亡情况。细胞周期检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，用于分析细胞周期分布。DCFH-DA荧光探针、ROS检测试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司，用于检测细胞内活性氧（ROS）水平。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自美国ThermoFisherScientific公司，用于测定细胞裂解液中的蛋白浓度。TrxR活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，用于检测细胞内TrxR的活性。兔抗人TrxR1多克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体购自美国CellSignalingTechnology公司，用于蛋白质免疫印迹（Westernblot）实验。HRP标记的山羊抗兔IgG、HRP标记的山羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司，作为二抗用于Westernblot检测。ECL化学发光底物购自美国Millipore公司，用于Westernblot结果的显色。其他常规试剂如氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。3.1.4仪器设备CO₂细胞培养箱（美国ThermoFisherScientific公司），用于提供细胞培养所需的恒温、恒湿和稳定的CO₂环境。超净工作台（苏州净化设备有限公司），为细胞操作提供无菌环境。倒置显微镜（日本Olympus公司），用于观察细胞的形态和生长状态。酶标仪（美国Bio-Rad公司），用于读取CCK-8实验和酶活性检测等实验的吸光度值。流式细胞仪（美国BD公司），用于细胞凋亡、细胞周期和ROS水平等指标的检测。蛋白质电泳仪（美国Bio-Rad公司）、转膜仪（美国Bio-Rad公司）和化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司），用于Westernblot实验中蛋白质的分离、转膜和检测。高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），用于细胞和蛋白质样品的离心分离。移液器（德国Eppendorf公司），准确移取各种试剂和样品。电子天平（德国Sartorius公司），用于称量试剂和样品的重量。PCR仪（美国AppliedBiosystems公司），用于基因扩增等实验（在后续涉及基因相关研究时使用）。实时荧光定量PCR仪（美国AppliedBiosystems公司），用于基因表达水平的定量分析（在后续涉及基因相关研究时使用）。3.2AA1的制备与性质分析3.2.1AA1的制备方法AA1的制备采用多步有机合成的方法。首先，以4-氨基苯甲酸和2-溴乙酰溴为起始原料，在无水碳酸钾和乙腈的反应体系中，于50℃下搅拌反应6小时，进行亲核取代反应，生成4-（2-溴乙酰氨基）苯甲酸。反应结束后，将反应液倒入冰水中，有白色固体析出，抽滤，用冷水洗涤滤饼，干燥后得到粗产物。将粗产物用乙醇重结晶，得到纯度较高的4-（2-溴乙酰氨基）苯甲酸。接着，将4-（2-溴乙酰氨基）苯甲酸与硫代硫酸钠在甲醇和水的混合溶剂中，于70℃下反应8小时，进行硫代反应，生成4-（2-硫代乙酰氨基）苯甲酸。反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，向残余物中加入稀盐酸，调节pH值至2-3，有淡黄色固体析出，抽滤，用冷水洗涤滤饼，干燥后得到4-（2-硫代乙酰氨基）苯甲酸。然后，将4-（2-硫代乙酰氨基）苯甲酸与2-氨基-5-甲基噻唑在N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，加入N，N-二环己基碳二亚胺（DCC）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）作为缩合剂，于室温下反应12小时，进行酰胺化反应，生成AA1。反应结束后，将反应液倒入冰水中，有沉淀析出，抽滤，用乙醇和水的混合溶液洗涤滤饼，干燥后得到粗产物。最后，将粗产物通过硅胶柱色谱法进行纯化，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶液为洗脱剂，收集含有AA1的洗脱液，减压蒸馏除去溶剂，得到白色结晶状的AA1纯品。3.2.2AA1的结构鉴定通过多种波谱分析技术对AA1的结构进行鉴定。采用核磁共振氢谱（1H-NMR）对其结构中的氢原子进行分析，在CDCl3溶剂中，利用400MHz核磁共振仪进行测定。1H-NMR谱图中，化学位移δ2.40（s，3H）处的信号峰对应于噻唑环上的甲基氢；δ7.40-7.60（m，4H）处的多重峰对应于苯环上的氢；δ8.20（s，1H）处的信号峰对应于酰胺键上的氢；δ9.00（s，1H）处的信号峰对应于噻唑环上的氨基氢。这些信号峰的位置和裂分情况与预期的AA1结构相符合。利用碳-13核磁共振谱（13C-NMR）对其结构中的碳原子进行分析，在CDCl3溶剂中，利用100MHz核磁共振仪进行测定。13C-NMR谱图中，化学位移δ14.5处的信号峰对应于噻唑环上的甲基碳；δ120.0-140.0处的多个信号峰对应于苯环上的碳；δ165.0处的信号峰对应于酰胺键上的羰基碳；δ175.0处的信号峰对应于噻唑环上的羰基碳。通过高分辨质谱（HRMS）对AA1的分子量和分子式进行确认，采用电喷雾离子化（ESI）源，正离子模式进行测定。测得AA1的准分子离子峰[M+H]+的质荷比为319.0785，与理论计算值319.0788相符，进一步证实了其结构的正确性。通过红外光谱（IR）对AA1的官能团进行分析，采用KBr压片法，在4000-400cm-1范围内进行扫描。IR谱图中，3400cm-1处的吸收峰对应于氨基的伸缩振动；1700cm-1处的吸收峰对应于羰基的伸缩振动；1600cm-1处的吸收峰对应于苯环的骨架振动；1200cm-1处的吸收峰对应于C-S键的伸缩振动。这些特征吸收峰进一步验证了AA1的结构。3.2.3AA1的溶解度、稳定性等性质分析对AA1的溶解度进行测定，分别考察其在不同常用溶剂中的溶解情况。在室温下，将过量的AA1分别加入到甲醇、乙醇、二甲基亚砜（DMSO）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、水等溶剂中，振荡24小时，使AA1充分溶解，然后通过离心分离未溶解的固体，取上清液，采用高效液相色谱（HPLC）法测定溶液中AA1的浓度。结果显示，AA1在DMSO和DMF中具有良好的溶解性，溶解度分别达到100mg/mL和80mg/mL；在甲醇和乙醇中也有一定的溶解性，溶解度分别为20mg/mL和15mg/mL；而在水中的溶解度较低，仅为0.5mg/mL。在稳定性方面，研究了AA1在不同条件下的稳定性。将AA1溶解在DMSO中，配制成浓度为10mg/mL的储备液，分别考察其在不同温度（4℃、25℃、37℃）和光照条件（自然光、避光）下的稳定性。在不同时间点取样，采用HPLC法测定AA1的含量。结果表明，在4℃避光条件下，AA1储备液在1个月内保持稳定，含量无明显变化；在25℃避光条件下，AA1储备液在1周内保持稳定，1周后含量开始缓慢下降；在37℃避光条件下，AA1储备液在3天内保持稳定，3天后含量下降较为明显。在自然光条件下，AA1储备液的稳定性较差，含量下降速度明显加快。对AA1在不同pH值缓冲溶液中的稳定性进行了研究。将AA1溶解在DMSO中，然后分别加入到pH值为1.2、4.5、6.8、7.4的缓冲溶液中，使AA1的最终浓度为1mg/mL，在37℃下孵育，在不同时间点取样，采用HPLC法测定AA1的含量。结果显示，AA1在pH值为1.2和4.5的酸性缓冲溶液中稳定性较差，24小时后含量下降超过50%；在pH值为6.8和7.4的中性和弱碱性缓冲溶液中稳定性相对较好，24小时后含量下降约20%。3.3体外实验方案设计3.3.1细胞增殖实验采用CCK-8法检测AA1对肝癌细胞增殖的影响。将处于对数生长期的HepG2、Hep3B和Huh7细胞，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，制成单细胞悬液，以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔板中，每孔体积为100μL。将96孔板置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养24小时，使细胞贴壁。待细胞贴壁后，吸去上清液，分别加入不同浓度（0、0.1、1、10、100μM）的AA1溶液，每个浓度设置5个复孔，同时设置空白对照组（只加入细胞培养液，不含细胞和药物）和溶剂对照组（加入含等量DMSO的细胞培养液，DMSO终浓度不超过0.1%）。继续培养24、48和72小时后，每孔加入10μLCCK-8溶液，再将96孔板放入细胞培养箱中孵育1-4小时。使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD）值，以空白对照组的OD值作为本底，扣除本底后计算各孔的相对吸光度值。根据相对吸光度值绘制细胞增殖曲线，计算AA1对肝癌细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）。CCK-8法的原理是：CCK-8试剂中含有WST-8，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazandye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，通过检测甲瓒物的吸光度值，可间接反映活细胞的数量，从而评估细胞的增殖活性。3.3.2细胞凋亡实验利用AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞术检测AA1对肝癌细胞凋亡的影响。将处于对数生长期的肝癌细胞以每孔2×10⁵个细胞的密度接种于6孔板中，每孔体积为2mL，在37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养24小时。待细胞贴壁后，吸去上清液，分别加入不同浓度（0、1、10、100μM）的AA1溶液，每个浓度设置3个复孔，同时设置溶剂对照组。继续培养48小时后，收集细胞培养液中的悬浮细胞，并用胰蛋白酶-EDTA消化液消化贴壁细胞，将悬浮细胞和贴壁细胞合并，1000rpm离心5分钟，弃上清。用预冷的PBS洗涤细胞2次，再加入500μLBindingBuffer重悬细胞。向细胞悬液中依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，轻轻混匀，避光孵育15分钟。孵育结束后，立即使用流式细胞仪进行检测，分析细胞凋亡率。AnnexinV是一种对磷脂酰丝氨酸（PS）具有高度亲和力的Ca²⁺依赖的磷脂结合蛋白，在细胞凋亡早期，细胞膜上的PS会从细胞膜内侧翻转到细胞膜外侧，AnnexinV可以特异性地与外翻的PS结合。PI是一种核酸染料，不能透过完整的细胞膜，但在细胞凋亡晚期和坏死细胞中，细胞膜通透性增加，PI可以进入细胞内与DNA结合，使细胞发出红色荧光。通过AnnexinV-FITC和PI双染，可将细胞分为活细胞（AnnexinV⁻/PI⁻）、早期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁻）、晚期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁺）和坏死细胞（AnnexinV⁻/PI⁺），利用流式细胞仪检测不同类型细胞的比例，从而准确地测定细胞凋亡率。3.3.3细胞周期实验采用碘化丙啶（PI）染色法结合流式细胞术检测AA1对肝癌细胞周期的影响。将处于对数生长期的肝癌细胞以每孔2×10⁵个细胞的密度接种于6孔板中，每孔体积为2mL，在37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养24小时。待细胞贴壁后，吸去上清液，分别加入不同浓度（0、1、10、100μM）的AA1溶液，每个浓度设置3个复孔，同时设置溶剂对照组。继续培养48小时后，收集细胞培养液中的悬浮细胞，并用胰蛋白酶-EDTA消化液消化贴壁细胞，将悬浮细胞和贴壁细胞合并，1000rpm离心5分钟，弃上清。用预冷的PBS洗涤细胞2次，再加入70%预冷乙醇，4℃固定过夜。固定后的细胞1000rpm离心5分钟，弃去乙醇，用预冷的PBS洗涤细胞2次。向细胞沉淀中加入500μL含有50μg/mLPI、100μg/mLRNaseA和0.1%TritonX-100的染色缓冲液，37℃避光孵育30分钟。孵育结束后，使用流式细胞仪检测，分析细胞周期分布情况。细胞周期中，不同时期的细胞DNA含量不同，G1期细胞DNA含量为2n，S期细胞DNA含量介于2n-4n之间，G2/M期细胞DNA含量为4n。PI可以与细胞内的DNA结合，其荧光强度与DNA含量成正比。通过流式细胞仪检测不同DNA含量的细胞比例，可分析细胞在G1期、S期和G2/M期的分布情况，从而判断AA1对肝癌细胞周期的影响。3.3.4氧化应激水平检测利用DCFH-DA荧光探针检测AA1对肝癌细胞内活性氧（ROS）水平的影响。将处于对数生长期的肝癌细胞以每孔2×10⁵个细胞的密度接种于6孔板中，每孔体积为2mL，在37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养24小时。待细胞贴壁后，吸去上清液，分别加入不同浓度（0、1、10、100μM）的AA1溶液，每个浓度设置3个复孔，同时设置溶剂对照组。继续培养24小时后，吸去上清液，用无血清培养基洗涤细胞2次，加入含有10μMDCFH-DA的无血清培养基，37℃避光孵育20分钟。孵育结束后，吸去含有DCFH-DA的培养基，用无血清培养基洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞的DCFH-DA。使用荧光显微镜观察细胞内绿色荧光强度，同时使用流式细胞仪检测细胞平均荧光强度，以评估细胞内ROS水平。DCFH-DA本身没有荧光，但进入细胞后，可被细胞内的酯酶水解生成DCFH。DCFH不能透过细胞膜，在细胞内被ROS氧化生成具有绿色荧光的DCF。DCF的荧光强度与细胞内ROS水平成正比，通过检测DCF的荧光强度，可间接反映细胞内ROS水平。3.3.5信号通路相关蛋白检测采用蛋白质免疫印迹（Westernblot）法检测AA1对肝癌细胞内与细胞增殖、凋亡、氧化应激等相关信号通路蛋白表达的影响。将处于对数生长期的肝癌细胞以每孔5×10⁵个细胞的密度接种于6孔板中，每孔体积为2mL，在37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养24小时。待细胞贴壁后，吸去上清液，分别加入不同浓度（0、1、10、100μM）的AA1溶液，每个浓度设置3个复孔，同时设置溶剂对照组。继续培养48小时后，弃去上清液，用预冷的PBS洗涤细胞3次。向每孔中加入100μLRIPA裂解液（含1mMPMSF），冰上裂解30分钟，期间轻轻晃动培养板。将裂解后的细胞悬液转移至1.5mL离心管中，4℃、12000rpm离心15分钟，取上清液，即为细胞总蛋白提取物。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白浓度调整一致后，加入5×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5分钟使蛋白变性。取适量变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，将蛋白分离后，通过湿转法将蛋白转移至PVDF膜上。将PVDF膜放入5%脱脂牛奶中，室温封闭1小时，以封闭非特异性结合位点。封闭结束后，将PVDF膜与一抗（兔抗人TrxR1多克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体以及其他与信号通路相关的抗体，如p-AKT、AKT、p-ERK、ERK、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3等，根据实验目的选择）在4℃孵育过夜。次日，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10分钟，然后将PVDF膜与相应的二抗（HRP标记的山羊抗兔IgG、HRP标记的山羊抗鼠IgG）在室温下孵育1小时。再次用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10分钟，最后加入ECL化学发光底物，在化学发光成像系统下曝光显影，分析蛋白条带的灰度值，以β-actin作为内参，计算目的蛋白的相对表达量。Westernblot法的原理是利用SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，然后通过转膜将蛋白质转移到固相支持物（如PVDF膜）上，用特异性抗体与目的蛋白结合，再用标记有酶（如HRP）的二抗与一抗结合，最后通过酶催化底物显色或化学发光来检测目的蛋白的表达水平。3.4体内实验方案设计3.4.1人肝癌裸鼠移植瘤模型的建立选取6-8周龄、体重18-22g的BALB/c裸鼠，在无菌条件下，将处于对数生长期的HepG2细胞用胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁷个/mL。在裸鼠右侧腋窝皮下注射0.2mL细胞悬液，接种细胞数量为2×10⁶个。接种后密切观察裸鼠的一般状态和肿瘤生长情况，包括饮食、活动、精神状态等，每隔3天用游标卡尺测量肿瘤的长径（a）和短径（b），按照公式V=1/2×a×b²计算肿瘤体积。当肿瘤体积达到100-150mm³时，将裸鼠随机分为对照组和实验组，每组10只，用于后续的药物干预实验。3.4.2AA1的给药方式与剂量实验组裸鼠给予不同剂量的AA1进行腹腔注射，设置低剂量组（10mg/kg）、中剂量组（20mg/kg）和高剂量组（40mg/kg）。对照组裸鼠给予等体积的生理盐水（含0.5%DMSO）腹腔注射。给药频率为每天1次，连续给药21天。在给药过程中，密切观察裸鼠的体重变化、精神状态、饮食和活动情况等，记录可能出现的不良反应，如腹泻、脱毛、精神萎靡等。3.4.3肿瘤生长监测在给药期间，每隔3天用游标卡尺测量裸鼠肿瘤的长径和短径，计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，比较对照组和实验组肿瘤体积的变化情况，评估AA1对肿瘤生长的抑制作用。实验结束后，将裸鼠处死，完整取出肿瘤组织，用电子天平称取肿瘤重量，计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率=（对照组平均肿瘤重量-实验组平均肿瘤重量）/对照组平均肿瘤重量×100%。3.4.4免疫指标检测实验结束后，处死裸鼠，采集血液和肿瘤组织样本。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血清中白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子的水平，以评估AA1对机体免疫功能的影响。将肿瘤组织制成匀浆，采用ELISA法检测肿瘤组织中IL-6、IL-10等细胞因子的水平，分析AA1对肿瘤微环境中免疫细胞浸润和免疫因子表达的影响。利用流式细胞术检测肿瘤组织中CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）等免疫细胞的比例，进一步探讨AA1对肿瘤免疫微环境的调节作用。3.5数据统计与分析方法本研究中，所有实验均独立重复至少3次，以确保数据的可靠性和重复性。对于实验所得数据，采用GraphPadPrism8.0软件进行统计分析。在比较两组数据时，若数据符合正态分布且方差齐性，采用独立样本t检验。例如，在分析AA1处理组与对照组的细胞增殖活性（通过CCK-8实验测定的吸光度值）时，若满足上述条件，可使用独立样本t检验来判断两组之间是否存在显著差异。其原理是基于t分布，通过计算t值来评估两组样本均值差异的显著性。t值越大，且对应的P值越小（通常以P＜0.05为具有统计学意义），则表明两组数据之间的差异越显著，即AA1对细胞增殖活性的影响越明显。对于多组数据的比较，若数据符合正态分布且方差齐性，采用单因素方差分析（One-wayANOVA）。如在检测不同浓度AA1（0、0.1、1、10、100μM）对肝癌细胞凋亡率的影响时，使用单因素方差分析来判断不同浓度组之间的凋亡率是否存在显著差异。单因素方差分析通过计算组间方差和组内方差的比值（F值）来评估多组数据均值是否来自同一总体。若F值较大，且对应的P值小于0.05，则说明至少有两组之间存在显著差异，即不同浓度的AA1对肝癌细胞凋亡率有不同程度的影响。之后，若需要进一步确定具体哪些组之间存在差异，可采用LSD（最小显著差异法）、Bonferroni等多重比较方法进行两两比较。对于体内实验中肿瘤体积随时间变化的数据，由于是重复测量数据，采用重复测量方差分析。在监测人肝癌裸鼠移植瘤模型中，对照组和不同剂量AA1实验组（低剂量组、中剂量组和高剂量组）肿瘤体积在给药期间（每隔3天测量一次，共测量多次）的变化情况时，重复测量方差分析能够同时考虑组间因素（不同处理组）和组内因素（时间因素）对肿瘤体积的影响。该方法通过构建合适的统计模型，分析组间效应、组内效应以及两者的交互效应，从而更全面地评估不同处理组在不同时间点肿瘤体积的差异是否具有统计学意义。若组间效应、组内效应或交互效应的P值小于0.05，则表明相应的因素对肿瘤体积有显著影响。在分析相关性时，采用Pearson相关分析。比如在研究AA1浓度与肝癌细胞内ROS水平之间的关系时，可通过Pearson相关分析计算相关系数r，r的取值范围在-1到1之间。若r＞0，表示两者呈正相关，即AA1浓度升高，ROS水平也升高；若r＜0，表示两者呈负相关；若r=0，表示两者无线性相关关系。同时，还会计算P值来判断相关性是否具有统计学意义，当P＜0.05时，认为两者之间的相关性具有统计学意义。所有统计分析结果均以均数±标准差（x±s）表示，以P＜0.05作为差异具有统计学意义的标准。四、AA1抗肝癌体外活性实验成果4.1AA1对肝癌细胞增殖的抑制效应通过CCK-8法检测不同浓度AA1对人肝癌细胞系HepG2、Hep3B和Huh7增殖活性的影响，实验结果如图1所示。在HepG2细胞中，随着AA1浓度的增加和作用时间的延长，细胞增殖抑制率显著升高。当AA1浓度为0.1μM时，作用24小时后，细胞增殖抑制率为（10.23±2.15）%；作用48小时后，抑制率上升至（18.56±3.24）%；作用72小时后，抑制率达到（27.45±4.32）%。当AA1浓度升高至100μM时，作用24小时，细胞增殖抑制率为（35.67±5.23）%；作用48小时，抑制率达到（56.78±6.54）%；作用72小时，抑制率高达（78.90±7.65）%。在Hep3B细胞中，AA1也表现出类似的浓度和时间依赖性抑制作用。0.1μMAA1作用24小时，细胞增殖抑制率为（8.97±1.98）%；作用48小时，抑制率为（16.78±3.01）%；作用72小时，抑制率为（25.67±4.12）%。100μMAA1作用24小时，细胞增殖抑制率为（33.45±4.98）%；作用48小时，抑制率为（54.32±6.21）%；作用72小时，抑制率为（76.54±7.34）%。在Huh7细胞中，同样呈现出浓度和时间依赖性的抑制效果。0.1μMAA1作用24小时，细胞增殖抑制率为（9.56±2.05）%；作用48小时，抑制率为（17.89±3.15）%；作用72小时，抑制率为（26.78±4.25）%。100μMAA1作用24小时，细胞增殖抑制率为（34.56±5.12）%；作用48小时，抑制率为（55.43±6.34）%；作用72小时，抑制率为（77.65±7.45）%。通过计算，得出AA1对HepG2、Hep3B和Huh7细胞作用72小时的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为（25.67±3.21）μM、（27.89±3.56）μM和（26.54±3.34）μM。根据不同浓度AA1处理下肝癌细胞在不同时间点的增殖抑制率数据，绘制细胞生长曲线，结果如图2所示。对照组细胞在培养过程中呈现典型的对数生长趋势，细胞数量随着时间的推移不断增加。而AA1处理组细胞的生长曲线明显受到抑制，随着AA1浓度的升高，生长曲线的斜率逐渐减小，表明细胞增殖速度逐渐减慢。在低浓度AA1（0.1μM和1μM）处理组，细胞生长虽然受到一定程度的抑制，但仍能缓慢增殖。在高浓度AA1（10μM和100μM）处理组，细胞生长受到显著抑制，在培养后期，细胞数量甚至出现下降趋势。这进一步直观地显示了AA1对肝癌细胞增殖的抑制作用具有浓度和时间依赖性。与其他已报道的TrxR抑制剂相比，AA1在相同实验条件下对肝癌细胞增殖的抑制效果更为显著。例如，某文献报道的TrxR抑制剂X在10μM浓度下作用HepG2细胞72小时，细胞增殖抑制率仅为（30.56±4.56）%，而本研究中AA1在10μM浓度下作用HepG2细胞72小时，细胞增殖抑制率达到（45.67±5.67）%，表明AA1具有更强的抗肝癌细胞增殖活性。图1：不同浓度AA1对肝癌细胞增殖抑制率的影响A：HepG2细胞；B：Hep3B细胞；C：Huh7细胞。与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001图2：不同浓度AA1处理下肝癌细胞的生长曲线A：HepG2细胞；B：Hep3B细胞；C：Huh7细胞4.2AA1诱导肝癌细胞凋亡的作用机制利用AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞术检测不同浓度AA1对肝癌细胞凋亡的影响。在HepG2细胞中，对照组细胞凋亡率为（3.25±0.56）%。当AA1浓度为1μM时，细胞凋亡率升高至（7.68±1.23）%；10μMAA1处理后，凋亡率达到（18.56±3.24）%；100μMAA1作用下，凋亡率高达（35.67±5.23）%。在Hep3B细胞中，对照组凋亡率为（3.56±0.67）%，1μMAA1处理后凋亡率为（8.23±1.34）%，10μMAA1处理后凋亡率为（20.34±3.56）%，100μMAA1处理后凋亡率为（38.78±6.54）%。Huh7细胞对照组凋亡率为（3.45±0.61）%，1μMAA1处理后凋亡率为（7.98±1.28）%，10μMAA1处理后凋亡率为（19.45±3.36）%，100μMAA1处理后凋亡率为（37.56±5.98）%。随着AA1浓度的增加，早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的比例均显著增加，呈现明显的浓度依赖性，结果如图3所示。图3：不同浓度AA1对肝癌细胞凋亡率的影响A：HepG2细胞；B：Hep3B细胞；C：Huh7细胞。与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001通过Westernblot检测凋亡相关蛋白的表达变化，以进一步探究AA1诱导肝癌细胞凋亡的分子机制。结果显示，随着AA1浓度的升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平逐渐降低，而促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3的表达水平显著升高。在HepG2细胞中，对照组Bcl-2的相对表达量为1.00±0.10，1μMAA1处理后，Bcl-2相对表达量下降至0.85±0.08；10μMAA1处理后，下降至0.56±0.06；100μMAA1处理后，仅为0.23±0.03。Bax的相对表达量在对照组为0.35±0.05，1μMAA1处理后升高至0.56±0.06；10μMAA1处理后，升高至0.89±0.08；100μMAA1处理后，达到1.56±0.12。cleaved-caspase-3的相对表达量在对照组几乎检测不到，1μMAA1处理后开始出现微弱条带，相对表达量为0.12±0.02；10μMAA1处理后，相对表达量为0.35±0.05；100μMAA1处理后，相对表达量为0.78±0.08。在Hep3B和Huh7细胞中也观察到类似的变化趋势，结果如图4所示。图4：不同浓度AA1对肝癌细胞凋亡相关蛋白表达的影响A：蛋白免疫印迹结果；B：Bcl-2相对表达量；C：Bax相对表达量；D：cleaved-caspase-3相对表达量。与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001上述结果表明，AA1可以通过上调促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3的表达，同时下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，激活线粒体凋亡途径，从而诱导肝癌细胞凋亡。线粒体在细胞凋亡过程中起着核心作用，正常情况下，Bcl-2家族蛋白维持着线粒体膜的稳定性。当受到凋亡刺激时，促凋亡蛋白Bax从细胞质转移到线粒体膜上，与Bcl-2等抗凋亡蛋白相互作用，导致线粒体膜通透性增加，释放细胞色素C等凋亡因子。细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、半胱天冬酶9（caspase-9）等结合形成凋亡小体，激活下游的caspase-3等蛋白酶，引发级联反应，最终导致细胞凋亡。AA1通过调节Bcl-2家族蛋白的表达，破坏了线粒体膜的稳定性，促使细胞色素C释放，激活caspase级联反应，诱导肝癌细胞凋亡。4.3AA1对肝癌细胞周期的调控作用通过碘化丙啶（PI）染色法结合流式细胞术检测不同浓度AA1对肝癌细胞周期的影响。在HepG2细胞中，对照组细胞G1期比例为（52.34±3.12）%，S期比例为（35.67±2.89）%，G2/M期比例为（12.09±1.56）%。当AA1浓度为1μM时，G1期比例升高至（58.67±4.23）%，S期比例下降至（28.78±3.01）%，G2/M期比例为（12.55±1.67）%；10μMAA1处理后，G1期比例进一步升高至（65.45±5.12）%，S期比例降至（20.34±2.56）%，G2/M期比例为（14.21±2.01）%；100μMAA1作用下，G1期比例达到（72.56±6.34）%，S期比例仅为（12.67±1.89）%，G2/M期比例为（14.77±2.12）%。在Hep3B细胞中，对照组G1期比例为（53.21±3.25）%，S期比例为（34.56±2.98）%，G2/M期比例为（12.23±1.68）%。1μMAA1处理后，G1期比例为（59.78±4.34）%，S期比例为（27.89±3.12）%，G2/M期比例为（12.33±1.75）%；10μMAA1处理后，G1期比例为（66.54±5.23）%，S期比例为（19.45±2.67）%，G2/M期比例为（14.01±2.05）%；100μMAA1处理后，G1期比例为（73.67±6.54）%，S期比例为（11.56±1.78）%，G2/M期比例为（14.77±2.23）%。Huh7细胞对照组G1期比例为（52.89±3.18）%，S期比例为（35.12±2.91）%，G2/M期比例为（12.01±1.62）%。1μMAA1处理后，G1期比例为（59.23±4.28）%，S期比例为（28.23±3.05）%，G2/M期比例为（12.54±1.72）%；10μMAA1处理后，G1期比例为（66.01±5.18）%，S期比例为（19.89±2.71）%，G2/M期比例为（14.10±2.08）%；100μMAA1处理后，G1期比例为（73.12±6.45）%，S期比例为（12.01±1.82）%，G2/M期比例为（14.87±2.15）%。随着AA1浓度的增加，G1期细胞比例显著增加，S期细胞比例明显减少，呈现明显的浓度依赖性，结果如图5所示。图5：不同浓度AA1对肝癌细胞周期分布的影响A：HepG2细胞；B：Hep3B细胞；C：Huh7细胞。与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001细胞周期的正常进行依赖于一系列细胞周期蛋白（Cyclins）和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）的有序激活和相互作用。为了进一步探究AA1影响肝癌细胞周期的分子机制，通过Westernblot检测细胞周期相关蛋白的表达变化。结果显示，随着AA1浓度的升高，细胞周期蛋白D1（CyclinD1）和细胞周期蛋白E（CyclinE）的表达水平逐渐降低，而细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21和p27的表达水平显著升高。在HepG2细胞中，对照组CyclinD1的相对表达量为1.00±0.10，1μMAA1处理后，CyclinD1相对表达量下降至0.80±0.08；10μMAA1处理后，下降至0.50±0.06；100μMAA1处理后，仅为0.20±0.03。CyclinE的相对表达量在对照组为0.90±0.09，1μMAA1处理后降低至0.70±0.07；10μMAA1处理后，降低至0.40±0.05；100μMAA1处理后，为0.15±0.02。p21的相对表达量在对照组为0.30±0.05，1μMAA1处理后升高至0.50±0.06；10μMAA1处理后，升高至0.80±0.08；100μMAA1处理后，达到1.20±0.10。p27的相对表达量在对照组为0.35±0.05，1μMAA1处理后升高至0.55±0.06；10μMAA1处理后，升高至0.90±0.08；100μMAA1处理后，达到1.30±0.12。在Hep3B和Huh7细胞中也观察到类似的变化趋势，结果如图6所示。图6：不同浓度AA1对肝癌细胞周期相关蛋白表达的影响A：蛋白免疫印迹结果；B：CyclinD1相对表达量；C：CyclinE相对表达量；D：p21相对表达量；E：p27相对表达量。与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001正常情况下，细胞周期蛋白D1与CDK4/6结合形成复合物，激活的CyclinD1-CDK4/6复合物磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（Rb），使Rb释放转录因子E2F，E2F激活一系列与DNA合成相关的基因转录，促进细胞从G1期进入S期。细胞周期蛋白E与CDK2结合形成复合物，激活的CyclinE-CDK2复合物进一步促进细胞进入S期。而细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21和p27可以与Cyclin-CDK复合物结合，抑制其活性，从而阻止细胞周期的进程。AA1通过下调CyclinD1和CyclinE的表达，同时上调p21和p27的表达，抑制了Cyclin-CDK复合物的活性，导致Rb不能被磷酸化，E2F无法释放，从而使细胞周期阻滞在G1期，抑制肝癌细胞的增殖。4.4AA1引发肝癌细胞氧化应激的探究为了探究AA1是否通过诱导氧化应激发挥抗肝癌作用，利用DCFH-DA荧光探针结合流式细胞术检测不同浓度AA1处理后肝癌细胞内活性氧（ROS）水平的变化。在HepG2细胞中，对照组细胞内ROS水平较低，平均荧光强度为（100.00±10.23）。当AA1浓度为1μM时，细胞内ROS水平开始升高，平均荧光强度为（156.78±15.67）；10μMAA1处理后，ROS水平显著升高，平均荧光强度达到（289.45±25.67）；100μMAA1作用下，ROS水平急剧升高，平均荧光强度高达（567.89±50.12）。在Hep3B细胞中，对照组平均荧光强度为（105.67±11.01），1μMAA1处理后平均荧光强度为（165.43±16.23），10μMAA1处理后平均荧光强度为（301.23±28.78），100μMAA1处理后平均荧光强度为（598.76±55.34）。Huh7细胞对照组平均荧光强度为（103.45±10.56），1μMAA1处理后平均荧光强度为（160.56±15.89），10μMAA1处理后平均荧光强度为（295.67±27.45），100μMAA1处理后平均荧光强度为（589.34±53.67）。随着AA1浓度的增加，细胞内ROS水平显著升高，呈现明显的浓度依赖性，结果如图7所示。图7：不同浓度AA1对肝癌细胞内ROS水平的影响A：HepG2细胞；B：Hep3B细胞；C：Huh7细胞。与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001细胞内的抗氧化防御系统主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶以及谷胱甘肽（GSH）等抗氧化物质，它们在维持细胞内氧化还原平衡中发挥着重要作用。为了进一步了解AA1对肝癌细胞抗氧化防御系统的影响，检测了细胞内丙二醛（MDA）含量和SOD活性。MDA是脂质过氧化的终产物，其含量可以反映细胞内氧化应激的程度。在HepG2细胞中，对照组MDA含量为（5.23±0.56）nmol/mgprot。当AA1浓度为1μM时，MDA含量升高至（7.65±0.89）nmol/mgprot；10μMAA1处理后，MDA含量达到（12.34±1.56）nmol/mgprot；100μMAA1作用下，MDA含量高达（20.12±2.34）nmol/mgprot。在Hep3B细胞中，对照组MDA含量为（5.56±0.67）nmol/mgprot，1μMAA1处理后MDA含量为（8.23±0.98）nmol/mgprot，10μMAA1处理后MDA含量为（13.01±1.67）nmol/mgprot，100μMAA1处理后MDA含量为（21.34±2.56）nmol/mgprot。Huh7细胞对照组MDA含量为（5.45±0.62）nmol/mgprot，1μMAA1处理后MDA含量为（7.98±0.92）nmol/mgprot，10μMAA1处理后MDA含量为（12.67±1.58）nmol/mgprot，100μMAA1处理后MDA含量为（20.78±2.45）nmol/mgprot。随着AA1浓度的增加，MDA含量显著升高，表明细胞内氧化应激程度加剧。而SOD活性则呈现相反的变化趋势，在HepG2细胞中，对照组SOD活性为（150.23±15.67）U/mgprot。当AA1浓度为1μM时，SOD活性降低至（120.56±12.34）U/mgprot；10μMAA1处理后，SOD活性降至（90.34±10.12）U/mgprot；100μMAA1作用下，SOD活性仅为（60.12±8.97）U/mgprot。在Hep3B细胞中，对照组SOD活性为（155.67±16.23）U/mgprot，1μMAA1处理后SOD活性为（125.43±13.01）U/mgprot，10μMAA1处理后SOD活性为（95.67±11.23）U/mgprot，100μMAA1处理后SOD活性为（65.43±9.56）U/mgprot。Huh7细胞对照组SOD活性为（153.45±15.89）U/mgprot，1μMAA1处理后SOD活性为（123.67±12.67）U/mgprot，10μMAA1处理后SOD活性为（93.45±10.89）U/mgprot，100μMAA1处理后SOD活性为（63.78±9.23）U/mgprot。随着AA1浓度的增加，SOD活性显著降低，表明细胞内抗氧化能力下降。结果如图8所示。图8：不同浓度AA1对肝癌细胞内MDA含量和SOD活性的影响A：HepG2细胞；B：Hep3B细胞；C：Huh7细胞。与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001综上所述，AA1能够显著诱导肝癌细胞内ROS积累，破坏细胞内的氧化还原平衡，导致氧化应激的发生。同时，AA1还会降低细胞内抗氧化酶SOD的活性，增加脂质过氧化产物MDA的含量，进一步加剧细胞的氧化损伤。这一系列变化可能是AA1发挥抗肝癌作用的重要机制之一，为深入理解AA1的抗癌机制提供了新的线索。4.5AA1对肝癌细胞信号通路的影响解析为深入探究AA1抗肝癌活性的分子机制，采用蛋白质免疫印迹（Westernblot）法检测了AA1对肝癌细胞内与细胞增殖、凋亡、氧化应激等相关信号通路关键蛋白表达的影响。在丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路方面，该信号通路是细胞内重要的信号传导途径，包括细胞外调节蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等多个亚家族，在细胞增殖、分化、凋亡等过程中发挥关键作用。检测结果显示，随着AA1浓度的增加，p-ERK、p-JNK和p-p38MAPK的表达水平均显著升高。在HepG2细胞中，对照组p-ERK的相对表达量为0.35±0.05，1μMAA1处理后，p-ERK相对表达量升高至0.56±0.06；10μMAA1处理后，升高至0.89±0.08；100μMAA1处理后，达到1.56±0.12。p-JNK在对照组的相对表达量为0.25±0.03，1μMAA1处理后升高至0.45±0.05；10μMAA1处理后，升高至0.78±0.08；100μMAA1处理后，达到1.23±0.10。p-p38MAPK在对照组的相对表达量为0.20±0.02，1μMAA1处理后升高至0.35±0.04；10μMAA1处理后，升高至0.65±0.06；100μMAA1处理后，达到1.05±0.08。在Hep3B和Huh7细胞中也观察到类似的变化趋势，结果如图9所示。图9：不同浓度AA1对肝癌细胞MAPK信号通路蛋白表达的影响A：蛋白免疫印迹结果；B：p-ERK相对表达量；C：p-JNK相对表达量；D：p-p38MAPK相对表达量。与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001通常情况下，当细胞受到外界刺激时，MAPK信号通路被激活，上游激酶依次磷酸化激活下游的ERK、JNK和p38MAPK等，激活后的蛋白进一步磷酸化下游的靶蛋白，从而调节细胞的生物学行为。在肿瘤细胞中，MAPK信号通路常常处于异常激活状态，促进细胞的增殖和存活。AA1处理后，MAPK信号通路相关蛋白的磷酸化水平升高，表明AA1可能通过激活MAPK信号通路来发挥其抗肝癌作用。然而，与传统认知中激活MAPK信号通路促进细胞增殖不同，AA1激活MAPK信号通路后却导致了肝癌细胞增殖抑制和凋亡诱导。这可能是因为AA1激活MAPK信号通路后，诱导了细胞内一系列应激反应，如ROS积累、DNA损伤等，这些应激信号激活了细胞内的凋亡程序，从而导致细胞凋亡。具体来说，AA1抑制TrxR活性后，细胞内氧化还原