DB44T 1866-2016 香蕉种苗枯萎病菌分子检测与鉴定技术规程

DB44DB44/T1866—2016香蕉种苗枯萎病菌分子检测与鉴定技术规程2016-09-08发布2017-01-01实施广东省质量技术监督局发布Ⅰ1下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本同种病原物在形态上没有什么差别，而在生理生化特性、培养性状、致病性等方面存在差异的不对于香蕉组培苗，若地上部分表现附录A所述症状，剖开其根部和假茎基部，观察维颜色变化情况；若地上部无明显症状，则随机抽取部分植株，观察其根部及假茎部位维管束组织的颜将现场调查结果记入《香蕉种苗产地/销售地枯萎病调查2病原菌进行单孢分离，得到单孢菌株，为下一步进行分子检测准备材料；如样品组织块上没有长出菌选取发病香蕉种苗组织，切成小块（3×3mm将小块组织先放于70％乙醇（酒精）溶液中浸℃)培养3d~5d，如组织块周围长出白色絮状菌落，菌落背面呈淡紫色或淡紫红色，则采用本文件按照附录D所列要求对疑似病原菌DNA和植物样品DNA进行PCR检测。检测结果呈阳性，扩增片段大小为729bp，且阴性对照没有扩增片段，且通用引物PCR扩增到大小为729bp的DNA片段，同时阴性对照没有3基上培养产生孢子，并制成孢子悬浮液保存于30%~40%甘油中，置于-20º4(资料性附录)香蕉枯萎病是一种典型的维管束病害，香蕉种苗感病早期无明显外部症状，染病一段时间后，病严重时部分根变褐腐烂(图1A)。发病初期，剖开香蕉种苗球茎基部，可见红褐色至褐色的坏死斑点，沿着褐色病斑纵剖香蕉种苗的球茎，可见红褐色至褐色成线条状病变的维管束，近茎基部颜色深，病变一直延伸到假茎部。发病严重时，褐色病斑扩大至整个球茎部，根系变褐腐烂(图1B)。发现有3个生理小种，1号生理小种(FOC1)可感染粉蕉(ABB,PisangAwak),香蕉的栽培种“大蜜啥”(AAA,GrosMichel)和龙牙蕉(AAB,Silk);2号生理小种(FOC2)为 (AAB,Bluggoe),但不侵染“大蜜啥”,该生理小种呈区域性分布；4号生理小种(FOC4)是1967年首先在我国台湾报道的一个生理小种，除了可感染粉蕉外，还能侵染“大蜜啥”、矮香蕉(AAA,DrawfCanvendish)、野生蕉(BB,Mu种有抗性的香牙蕉(AAA,Cavendish),因此其危险性和毁灭性最大，该生理小种在我国大部分的香蕉产区已有发生和报道；此外，原来的3号生理小种因只为害野生观赏性羯尾蕉属(Heliconiaspp.)有明显的足细胞，镰刀形，具3个～5个隔膜，壁薄，(22~36)μm×(4~5)μm;小孢子圆形或椭圆形至肾形，具0个~1个隔膜，壁薄，(5~7)μm×(2.5~3)μm,在人工培养基上很容易产生和观察到。厚垣孢子圆形，壁厚，间生或顶生于菌丝上，多单生，9μm×7μm(图2)。5678DNA均用紫外分光光度计检测其纯度及浓度，以OD260/OD280的比值为1.8~2.0时最佳，如95℃预变性2min；94℃变性40sec,54℃退火40sec，72℃延伸1min，反应309M123M1234567891C图3香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种特异性引物和尖镰孢通用引物PCR产物电泳图注：A,香蕉枯萎病菌4号生理小种特异性引物PCR产物电泳图；B,香蕉枯萎病菌1号生理小种特异性引物PCR产物电泳图；C,尖镰孢通用引物PCR产物电泳图。1-7为香蕉枯萎病菌4号生理小种菌株；8-13为香蕉