组织工程的研究与进展

组织工程的研究与进展

(ResearchandDevelopmentofTissueEngineering)

随着移植医学与替代医疗的发展，人体病损器官、器件和组织的替代物的临床需求量迅

速增加。

据美国国家健康统计中心（ＮＣＨＳ）调查，１９９３年不涉及齿科材料，植入一件以上植入物的患者，在美国已达１１００万人，占其总人口的４％，全球预计超出３０００万人。

齿科植入物，据日本齿科学会预计，廿一世纪初对牙种植体的需求量将达成其总人口的５０％。

１９９７年美国ＦＡＤ预测将来十年生物医学工程产业３９项新产品中涉及人体器官、器件和组织替代物的几乎占５０％。

由于源于人体的同种移植物来源有限，在美国仅局限性２０％的患者能得到及时治疗，耗资４００亿美元。

许多人工合成与制造的替代物，但在一定程度上能满足临床的规定，特别是在植入人体较长时间后，并发症较多。因此，研制开发植入人体后能形成与人体构造组织相似、参加人体代谢、能够修复和改善病损器官、器件和组织功效的植入物，是各国科学家孜孜以求的目的。

组织工程（TissueEngineering)就是在这样某些需求背景和人工器官技术、生物技术、生物材料技术等当代科学进展的基础上发展起来的一项综合性的高新技术，是跨世纪生物医学工程前沿领域之一。

１９８７年美国科学基金会在华盛顿举办的生物工程小组会上提出组织工程这个名词，１９８８年被定义为：“它应用工程科学与生命科学的原理与办法，在可控、可重复条件下，通过哺乳动物、人类（涉及患者自己）的特定细胞在网络构架的体外培养、体内植入增殖，形成含有特定功效组织和生物替代物。”

第一种组织工程产品——人工皮肤于１９８８年２月经ＦＤＡ同意其上市销售，进入临床实用阶段。正在研究开发的骨骼、软骨、血管以及神经组织等项目也已进入进行体内实验的阶段。

一、组织工程的基本原理

许多文献都将组织工程技术归纳为三个要素：种子细胞、基质材料与细胞生长因子。事实上除了上述三个要素以外，培养的生物环境也是重要的要素。

１．种子细胞

种子细胞指培养、存活、增殖最后形成组织的原始细胞。

种子细胞可分为三类：异种、同种异体和自体细胞。

性能稳定、可重复提供的种子细胞来源是组织工程产品商业化的首要前提。

动物细胞是存量充足的可靠细胞来源之一，但动物细胞在人体内会引发免疫排斥反映造成安全性的问题。

采用转基因等生物技术可使动物携有人类的基因以减少甚至避免免疫排斥反映。但更严峻的问题是动物体内的某些病毒会造成人类的某些新的疾患的产生。

有某些国家政府就明令严禁实施异种植入人体。事实上，对科学家来说重要的是要解决避免动物病毒传染人类的问题，一旦异种细胞植入的安全性问题获得解决，相信这些国家政府的禁令亦会逐步取消。但现在尚有较大的难度。

现在在组织工程研究中人类本身的细胞仍然是种子细胞的重要来源。人类本身的细胞也存在不少问题。培养的人体组织细胞增生能力普通有限，同时在体外培养条件下随着细胞的增殖会产生去分化现象，细胞丧失应有的功效。

人类本身的原代细胞作为种子细胞的商业前景暗淡。但是，应强调在体内的条件下，有许多个成体细胞含有较强的“再生”能力。

这同传统的组织工程的研究思路不同，反而同传统的人工器官的研究思路较靠近。这就是近年发展的再生医学发展的内容

１９９８年末，美国有两个研究机构先后成功地培养出人胚胎干细胞。与成体细胞不同，这类细胞含有持续生长，分化的能力，即从理论上讲这类细胞在一定的条件下能够分化成人体的任何成体细胞，并含有成体细胞的功效。

这类细胞是颇为抱负的种子细胞来源。近年人胚胎干细胞的研究发展迅猛。随着人胚胎干细胞研究的进一步进行，也碰到了相称多的实践问题，涉及法律的与道德的问题。就技术而言仍有某些困难问题需要克服。

人胚胎干细胞移植人体内后的致癌性问题、抗原性问题、如何调控人胚胎干细胞定向分化构建组织的目的细胞的问题等。

现在比较靠近于实际应用的种子细胞来源是从组织中分离出来的所谓“前驱细胞”，亦有称之为组织干细胞。

由于这类细胞在向特定分化方向转化上已得到了部分调控，但它们尚未完全分化，因而尚存有足够的灵活性以发育成几个不同的类型的细胞。

来源于中胚层细胞的间充质干细胞，它们存在于成人的骨髓中，在适宜的诱导条件下含有多向分化为肌腱、骨、软骨、脂肪、基质组织细胞的潜能，进而增殖哺育成对应的组织。现在研究较多的这类细胞涉及：造血干细胞系、神经干细胞系以及间充质干细胞系等。

２．基质材料

基质材料类似于人体细胞外基质、作为种子细胞以及细胞生长因子的载体，使种子细胞赖以定向分化增殖发育成对应的组织。基质材料亦有称为细胞支架。抱负的基质材料起码应含有下列某些性能：

a.生物相容性

除了含有普通生物材料的生物相容性规定，还规定它利于种子细胞的粘附、分化与增殖。

b.生物降解性

作为种子细胞的支架，一旦种细胞哺育成组织，规定基质材料降解并为人体所代谢，即基质材料的降解速率与细胞生长的速率相适应，降解速率应可根据组织的生长特性加以调控。

c.含有三维多孔立体网架构造

这种构造含有较高的比表面积和孔隙率，以利于种子细胞增殖、细胞外基质沉积进而形成组织。其中较高的空隙率，利于营养、氧气的进入和代谢废物的排出，有助于血管与神经的长入。

d.材料—细胞界面

基质材料应提供优秀的材料——细胞界面，利于细胞的粘附、生长，更重要的是应能激活细胞特异基因的体现和维持正常细胞的表型体现。

e.加工性能和机械强度

由于病损和缺失的组织、器件、器官，形状尺寸变化较大，有的基质材料甚至在手术植入时还需进一步加工，

有的基质材料植入体内需为新生组织维持一段时间的力学支撑，直至新生组织含有足够的力学特性为止。

f.灭菌性能

基质材料使用时均需灭菌。因此，规定灭菌过程对基质材料的基本性能不产生明显的影响

和不带来新的生物学危害作用。

现在在组织工程中应用的基质材料重要有三大类别：天然材料及其复合物；合成高分子可降解材料及其复合物；无机材料及其复合物。

a.天然材料

现在应用较多的有胶原（以Ｉ型胶原为主）、明胶、甲壳素、壳聚糖、海藻酸盐、透明

质酸钠等。

这类材料制成的细胞支架生物相容性普通较好。其界面利于种子细胞的粘附、分化、增殖。问题是这类材料湿态强度差，较易为体液的多个酶所降解，降解速率过快。

现在，大都采用交联的办法来提高强度与减缓降解速率。也有采用天然材料之间的复合，

b.合成可降解高分子材料

现在应用较多的品种是聚乙交酯（ＰＧＡ）、聚丙交酯即聚乳酸（ＰＬＡ）、聚己内酯（ＰＣＬ）以及它们之间的多个共聚物。通过材料的组份、构成比、分子量、分子量分布等因素的调控来制备体内降解速率（半降解期）能够从几周到几年、其它性能也不尽相似、各有特长的基质材料。

ＰＬＡ、ＰＧＡ及其共聚物在组织工程中采用的重要构造形式有纤维支架、多孔泡沫以及管状构造等。

纤维支架是由ＰＧＡ通过挤压制成１０～１５μｍ的纤维，再通过编织加工技术形成编织加工技术形成编织状或无纺状构造，孔隙率可高达９７％，面积体积比高达０.０５μｍ-1

１.这样形成的支架普通不能承当压力。

高度多孔的泡沫状支架是一种较好的构造形式。可用多个方式获得多孔泡沫构造，如：溶剂浇铸、微粒溶出、气体发泡、相分离等办法。其中气体发泡法效果最佳。

ＰＬＡ和ＰＧＡ及其共聚物还可制成管状构造用于尿道，小肠等管状器官的基质材料。

脂肪族聚酯类可降解高分子材料，作为基质材料尚有某些局限性的办法，有待改善：

（１）亲水性差，细胞粘附、生长增殖受阻。如：ＰＬＡ包埋的ＰＧＡ无纺纤维支架由于亲水性差，细胞吸附力弱，满足不了组织工程研究的规定。

（２）引发无菌性炎症。ＰＬＡ与ＰＧＡ在临床应用中发现约有８％左右患者出现非特异性无菌性炎症。平均分子量低于２万时发病率增加，使用高分子量的ＰＬＡ只能缓慢而不能消除此种并发症的发生。

（３）抗压强度差。大多数ＰＬＡ与ＰＧＡ无纺布支架都有抗压强度差的问题。除了上述介绍的脂肪族聚酯可降解高分子材料及其复合物外，文献中还报道采用聚偶磷氮（Polyphosphazenes）、聚原酸酯（Polyorthoesters,POE)、聚氨基酸（PolyaminoAcid)|bctisgxjrnpvsgxj(Polyesterurethane)等。

与天然材料相比，合成的材料最大缺点是缺少细胞识别信号，不利于细胞特异性粘附及特异基因的激活，许多学者致力于将某些识别信号片断，引入合成基质材料表面与整体，以增进种子细胞的粘附、生长、增殖。

c.生物陶瓷

生物陶瓷指由金属离子及非金属离子以离子键结合的晶体材料。根据其在生理环境中的化学活性可分为四类：惰性生物陶瓷，表面活性生物陶瓷，可吸取性生物陶瓷与复合生物陶瓷。

作为基质材料普通采用可生物降解的可吸取性生物陶恣。重要有下列某些品种：

（１）磷酸钙陶瓷支架：磷酸

钙陶瓷按其Ｃa/P比值分别为１.５、１.６７和２而分为磷酸三钙、羟基磷灰石和磷酸四钙，另外尚有Ｃa/P比介于它们之间的物质，如：氟代及氧代的羟基磷灰石。其中以羟基磷灰石（ＨＡ）与β磷酸三钙（β-ΤCΡ）研究最多。

７０年代的研究认为骨骼中的无机成分重要是ＨＡ，因此认为ＨＡ植入人体内有助于骨组织的再生。

近年的研究表明骨组织中的矿物质是Ｃa/P＜１．５的碳酸盐磷灰石，除钙、磷外尚含有镁、钠、钾及某些微量元素。

许多学者研究以β-ＴＣＰ为主的支架及其在组织工程中的应用获得一定的进展。由于磷酸钙陶瓷表面的ξ电位效应、湿润性及游离的磷酸根离子不利于细胞的粘附、增殖，这方面改善的研究尚待进一步。

（２）碳酸钙陶瓷支架：天然珊瑚（重要成分为碳酸钙）制成的细胞支架在９０年代初即被用于作为人类骨髓细胞、成纤维细胞、牙龈纤维细胞及胎鼠骨细胞的体外培养。实验发现尽管培养早期人类细胞的贴壁率较低，但２０天后细胞数量和培养板一致，细胞的生理活性正常，分泌的骨唾蛋白，Ｉ型、ＩＩＩ型胶原、骨桥素均显示阳性。细胞在支架上增殖持续时间长，碳酸钙又是在体内可降解的材料。

（３）生物活性玻璃细胞支架：含磷和钙的硅玻璃（SiO-ＣａＯ-ＨＰＯ４）能够部分降解，其中一类特殊构造的称为生物活性玻璃。其表面水解形成的水合层利于羟基磷灰石形成沉积，同时这类新生态的羟基磷灰石可选择性吸附胶原、纤维粘连蛋白，从而使玻璃表面与骨及软组织之间形成较好的生物相容界面，利于新骨形成。

３.细胞生长因子

生长因子（GrowthFactor,GF)是含有定向诱导和激活组织分化、增殖，维持细胞生物活性等生物效应的蛋白质类物质。它对于增进细胞增殖，以及组织的修复、再生含有重要的增进作用。

生长因子的生理功效含有特异性和专一性，即每种生长因子只对某些细胞或某些细胞的某个分化阶段发挥其生理功效。

细胞生长因子并不能调控细胞分化的全过程。特别是运用生长因子来调控加紧干细胞定向分化成目的细胞，运用一种生长因素，时常很难奏效。往往是若干种生长因子间协同作用方能调控向目的细胞的分化与增殖。

生长因子的作用往往与细胞表面对应受体的活跃程度有关。如运用ＩＧＦ-Ｉ对肌腱细胞生长增殖的增进作用，其必要条件是ＩＧＦ-１受体系统的活跃。

运用细胞因子来增进种子细胞的分化与增殖，虽是很有效的技术手段，但要成功地运用自如尚有相称多的问题需要研究加以解决。

４.培养的生物环境

现在许多研究者强调组织工程中细胞培养与扩增，应当是三维，因此推崇采用微重力效应下，细胞与组织三维培养技术。

我们应当看到人体的细胞的种类是非常多的，不同组织与器官所在的生理环境（涉及力学环境）千差万别。因此，在某些特定环境中应用的组织只有在特定的环境条件下培养才干符合临床应用的规定。

因此，研究组织工程中细胞培养与扩增条件时，应当重视在与人体生理环境类似条件下的培养。特别是人体的许多组织的再生能力很强：如人的膀胱，研究在人体环境下膀胱的再生无疑是非常有科学价值的研究方向。

二、组织工程某些活跃的研究领域

组织工程的目的旨在研制、开发能够修复损伤或缺失组织功效的体内植入物。因此，组织工程的某些活跃的研究多集中在能够较快地在临床应用、可形成商品化、应用前景较明确的某些领域。

１.骨组织工程

将基质材料与生长因子（重要是骨形成蛋白rhBMP-２和人转移生长因子βｒｈＴＧＦ-β。在体外组装后植入体内，通过生长因子分子诱导成骨细胞分化、增殖进而长成新骨。这对于社区域骨缺损的修复有较好的疗效。

另一种思路，运用体外细胞培养技术增殖获得足够数量的成骨细胞，然后与基质材料在体外组装后植入缺损部位。现在，正在运用后一种思路研究长骨的体内生物植入物。

ＢＭＰ在人体内发挥作用的时间受到限制，有的学者提出将控制ＢＭＰ合成的ＤＮＡ质粒复合于基质材料中植入人体，这样能够在骨组织形成过程中不停合成ＢＭＰ，增进成骨细胞生长。

２．皮肤组织工程

最早的皮肤生物替代物是源于患者本人的角质细胞在高钙条件下的复层模片，尔后将其用酶从培养瓶中消化下来，移植至断层或全层皮肤创面。

之后，较成功的实验是将新生儿包皮中成纤维细胞与牛Ｉ型胶原制成真皮替代物。表面由自体表皮细胞覆盖，成功地用于人体创面复盖。

近年，由胶原与硫酸软骨素复

合的模拟真皮；ＰＧＡ和ＰＬＡ作支架移植新生儿包皮成纤维细胞增殖后制成的人工真皮；去除包含有郎罕氏细胞的表皮成分，通过一段时间冷藏的无细胞异体真皮等产品均在烧伤创面应用获得成功。

人工皮肤是最早被ＦＤＡ同意上市的组织工程产品。

皮肤生物工程产品的设计已趋成熟，即此种皮肤替代物应用表皮、真皮两层，表皮中的细胞应含有分化、增殖的能力，表皮与真皮之间的紧密粘附，通过两层细胞间的互相作用实现人工组织植入物的功效。

３．肌腱、软骨组织工程

结缔组织的替代是重建外科的热点，其中尤以肌腱与软骨修复受到关注。

ＰＧＡ与间充质细胞构成的人工组织植入裸鼠皮下、兔子的关节缺损进行了广泛的研究，证明能够形成软骨，肌腱和新生骨。还能够进行血管化再生组织的培养。

软骨的体外培养已获成功，核心是要得到足够的厚度与对应的强度。体外培养中新生软骨超出一定的厚度，中心区域的软骨细胞由于距离边沿远而无法得到充足的营养和氧气，无法对多个生长因子的刺激作出响应，也不能排除代谢废物。国外采用一种旋转式生物反映器，在此反映器的细胞支架上进行培养，确保细胞营养与氧气充足供应与代谢废物的排除，同时对环境施以一定的应力场作用，造成组织工程化软骨，富含胶原及其它某些蛋白质。

肌腱组织工程的种子细胞现在大多采用胚胎肌腱组织分离、纯化获得的肌腱细胞。采用以胶原为主原料制成的天然细胞支架，也有采用ＰＬＡ与ＰＧＡ细胞支架的，后者亲水性较差而影响细胞粘附。

肌腱组织工程中尚有一种极其重要的研究方向就是运用支架植入诱导自体肌腱组织的再生。文献中已有成功的报道。

４．含有分泌功效器官的组织工程

实验中的研究目的现在集中在人工肝、人工胰及人工肾。以人工肝为例，事实上现在还没有达成形成肝组织的水平，只是分化增殖肝细胞的聚集体。另一片现在有二类研究方向。一类是体内型，重要是运用海藻酸／聚赖氨酸包埋肝细胞形成生物微胶囊用作组织细胞移植治疗的免疫隔离工具，组织在囊内分化、增殖，营养和氧份由组织液提供，细胞的分泌物与代谢由囊内向囊外输运再转运全身，起到肝组织的分泌代谢功效。

另一类是体外型。重要是运用空心纤维型生物反映器在体外大量培养肝细胞，该反映器附有供营养液、充气和排泄装置，使细胞维持在良好的微环境中生长。运用血液净化的原理经肝细胞作用后的血液回输体内。这类装置事实上只是肝脏的短期支持系统。

生物活性的人工胰，也是运用微胶囊技术包埋胰岛细胞制成。植入腹腔后胰岛细胞分泌的胰岛素通过微囊半透膜输运到腹腔，尔后通过血液循环转运到全身。

三、组织工程研究的若干问题

１．人体组织与器官的替代需要“综合”各学科的成就各个学科总是从本学科已有的技术优势出发来解决临床碰到的某些科学“难题”。从某种意义上讲，这种优势又是一种片面。

只有不受狭小学科的思维束缚，在多领域的技术成就的基础上，集成各方面的技术优势，才有可能解决人体器官的替代、修复、再生、复制与置换这样一种极其复杂的问题。

２．免疫问题

由于人的