HCMV感染下ATF5对SW480细胞的调控机制与影响研究

HCMV感染下ATF5对SW480细胞的调控机制与影响研究一、引言1.1研究背景人巨细胞病毒（HumanCytomegalovirus,HCMV）是一种在人群中广泛传播的β疱疹病毒亚科双链DNA病毒，人类是其唯一的天然宿主。大多数人感染HCMV后通常无明显临床症状，呈隐性感染状态。然而，对于免疫功能低下的个体，如艾滋病患者、接受器官移植或放化疗的患者，HCMV感染可能会引发严重的疾病，包括肺炎、视网膜炎、胃肠道疾病等，甚至危及生命。在孕妇群体中，HCMV的感染还可能导致胎儿先天性感染，引起一系列严重的出生缺陷，如智力障碍、听力丧失、小头畸形等。据统计，全球范围内约有0.2%-2.4%的新生儿存在先天性HCMV感染。激活转录因子5（ActivatingTranscriptionFactor5,ATF5）属于ATF/CREB转录因子家族成员，在细胞的生长、分化、应激反应和凋亡等多种生物学过程中发挥着关键的调控作用。ATF5能够响应多种细胞内外界刺激信号，通过与特定的DNA序列结合，调控下游靶基因的转录表达，从而参与细胞命运的决定。在正常生理状态下，ATF5维持着细胞内环境的稳定和正常生理功能的执行。然而，在肿瘤等病理条件下，ATF5的表达和功能常常发生异常改变。研究发现，在多种肿瘤组织中，ATF5的表达水平明显上调，并且与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移等过程密切相关。SW480细胞是一种人结肠癌细胞系，源自一位51岁白人男性患者的原位直肠腺癌。该细胞系具有上皮细胞样形态，呈贴壁生长特性。SW480细胞在结肠癌的研究中具有重要的应用价值，被广泛用于探究结肠癌的发病机制、肿瘤细胞的生物学特性以及筛选和评估潜在的抗癌药物等方面。由于其具有典型的结肠癌细胞特征，能够较好地模拟体内结肠癌细胞的行为，为深入研究结肠癌的分子机制和治疗策略提供了理想的实验模型。近年来，越来越多的研究开始关注病毒感染与肿瘤发生发展之间的关系，HCMV感染与结直肠癌之间的潜在联系逐渐成为研究热点。有研究表明，在结直肠癌组织中检测到HCMVDNA及相关蛋白的表达，且其感染率明显高于癌旁正常组织，提示HCMV感染可能在结直肠癌的发生发展过程中发挥着重要作用。同时，ATF5作为一种与肿瘤密切相关的转录因子，其在HCMV感染的结直肠癌细胞中的表达变化及作用机制尚不明确。因此，深入研究HCMV感染对SW480细胞中ATF5表达的影响，以及ATF5在这一过程中对SW480细胞生物学行为的调控作用，不仅有助于揭示HCMV感染与结直肠癌发生发展之间的内在联系，还可能为结直肠癌的诊断、治疗和预防提供新的靶点和理论依据。1.2研究目的与意义本研究旨在深入探讨HCMV感染对SW480细胞中ATF5表达的影响，以及ATF5在这一过程中对SW480细胞生物学行为的调控作用，具体研究目的如下：明确HCMV感染对SW480细胞中ATF5表达的影响：通过实验检测HCMV感染SW480细胞前后ATF5在mRNA和蛋白水平的表达变化，确定HCMV感染与ATF5表达之间的关联，为后续研究提供基础数据。揭示ATF5在HCMV感染的SW480细胞中的作用机制：运用基因编辑技术，如RNA干扰（RNAi）或过表达载体转染等方法，调控ATF5在SW480细胞中的表达水平，观察其对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为的影响。进一步探究ATF5调控这些生物学行为的分子信号通路，明确其在HCMV感染的SW480细胞中的作用机制。为结直肠癌的防治提供新的靶点和理论依据：基于上述研究结果，分析ATF5作为潜在治疗靶点的可能性。通过对其在HCMV感染与结直肠癌发生发展之间作用机制的深入理解，为开发针对结直肠癌的新型治疗策略提供理论支持，为临床治疗提供新的思路和方向。本研究具有重要的学术和实践意义：学术意义：在学术层面，目前对于HCMV感染与肿瘤发生发展之间的关系研究仍处于不断探索阶段，尤其是HCMV感染对结直肠癌细胞中关键转录因子ATF5的影响及作用机制尚不明确。本研究将填补这一领域在相关方面的研究空白，有助于深入理解病毒感染与肿瘤细胞生物学行为改变之间的内在联系，丰富和完善肿瘤发病机制的理论体系。通过揭示HCMV感染对SW480细胞中ATF5表达的调控以及ATF5在其中的作用机制，为后续开展更深入的研究提供理论基础和研究方向，推动病毒与肿瘤相关领域的学术发展。实践意义：在临床实践中，结直肠癌是严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势。目前，结直肠癌的治疗主要包括手术、化疗、放疗和靶向治疗等，但这些治疗方法仍存在诸多局限性，如化疗药物的耐药性和毒副作用、靶向治疗的靶点有限等，导致部分患者的治疗效果不佳，预后较差。本研究通过探究HCMV感染和ATF5对SW480细胞的调控作用，若能确定ATF5为结直肠癌治疗的新靶点，将为结直肠癌的临床治疗提供新的策略和方法。例如，开发针对ATF5的小分子抑制剂或靶向药物，可能为结直肠癌患者带来更有效的治疗手段，提高患者的生存率和生活质量。此外，本研究结果还有助于优化结直肠癌的早期诊断方法，通过检测患者体内HCMV感染情况以及ATF5的表达水平，实现对结直肠癌的早期预警和精准诊断，为患者的早期干预和治疗提供依据。1.3研究方法与创新点本研究综合运用细胞生物学、分子生物学等多学科实验技术，对HCMV感染ATF5对SW480细胞的调控作用展开深入探究，具体研究方法如下：细胞培养与病毒感染：使用含有10%胎牛血清和1%双抗的Leibovitz'sL-15培养基，在37℃、100%空气的培养箱中培养SW480细胞，定期进行换液和传代，维持细胞的良好生长状态。将实验室保存的HCMVAD169毒株接种至对数生长期的人胚肺成纤维细胞（HELF）进行扩增，待细胞出现明显病变效应（CPE）后，收获病毒液。采用反复冻融和超声破碎的方法处理病毒液，通过梯度稀释后接种至HELF细胞，运用噬斑形成实验测定病毒滴度。以不同感染复数（MOI）的HCMV感染处于对数生长期的SW480细胞，设置未感染的SW480细胞作为对照组，在感染后的不同时间点收集细胞样本，用于后续实验检测。基因表达检测：运用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）技术，检测HCMV感染前后SW480细胞中ATF5及相关基因在mRNA水平的表达变化。使用Trizol试剂提取细胞总RNA，通过分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度、纯度和完整性。利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，根据目的基因设计特异性引物，在荧光定量PCR仪上进行扩增反应。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因，采用2^-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。通过蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测ATF5及相关蛋白的表达水平。用细胞裂解液裂解细胞，提取总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜，依次加入一抗和二抗进行孵育，通过化学发光法检测蛋白条带的信号强度，以β-actin作为内参蛋白，分析目的蛋白的相对表达量。功能实验：利用RNA干扰（RNAi）技术，设计并合成针对ATF5的小干扰RNA（siRNA），通过脂质体转染法将其导入SW480细胞，降低细胞中ATF5的表达水平；同时构建ATF5过表达质粒，转染SW480细胞，使ATF5过表达。设置阴性对照和空白对照，通过RT-qPCR和Westernblot验证转染效果。采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测细胞增殖能力。将转染后的SW480细胞接种于96孔板中，在不同时间点加入CCK-8试剂，孵育一段时间后，用酶标仪测定450nm处的吸光度值，绘制细胞生长曲线。运用流式细胞术检测细胞凋亡情况。收集转染后的细胞，用结合缓冲液重悬细胞，加入AnnexinV-FITC和PI染料，避光孵育后，通过流式细胞仪检测细胞凋亡率。通过Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力。在上室加入转染后的细胞悬液，下室加入含有趋化因子的培养基，培养一定时间后，擦去上室未迁移或侵袭的细胞，用结晶紫染色，在显微镜下观察并计数迁移或侵袭到下室的细胞数量。机制研究：通过生物信息学分析和文献调研，预测ATF5可能调控的下游信号通路和靶基因。采用双荧光素酶报告基因实验验证ATF5与潜在靶基因启动子区域的结合活性。构建含有潜在靶基因启动子区域的荧光素酶报告质粒，与ATF5表达质粒或对照质粒共转染SW480细胞，同时转染内参质粒，培养一定时间后，利用双荧光素酶报告基因检测系统测定荧光素酶活性。运用信号通路抑制剂处理细胞，观察其对ATF5调控SW480细胞生物学行为的影响。例如，针对预测的信号通路，加入相应的特异性抑制剂，然后进行细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等功能实验，分析信号通路在ATF5调控过程中的作用。本研究的创新点主要体现在以下几个方面：研究视角创新：首次聚焦于HCMV感染对结直肠癌细胞中ATF5表达及功能的影响，将病毒感染与肿瘤细胞中关键转录因子的调控作用相结合，为揭示HCMV感染与结直肠癌发生发展之间的内在联系提供了新的研究视角。以往研究多单独关注病毒感染或肿瘤细胞自身分子机制，本研究将两者关联起来，有望拓展对结直肠癌发病机制的认识。调控机制探索创新：深入探究ATF5在HCMV感染的SW480细胞中的作用机制，不仅从细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为层面进行研究，还运用多种分子生物学技术，如双荧光素酶报告基因实验、信号通路抑制剂处理等，从分子信号通路水平揭示其调控机制，为阐明HCMV感染促进结直肠癌发展的分子机制提供更全面、深入的理论依据。潜在靶点发现创新：若研究确定ATF5为HCMV感染与结直肠癌发生发展过程中的关键调控因子，将为结直肠癌的治疗提供一个全新的潜在靶点。这可能为开发针对结直肠癌的新型靶向治疗药物和策略开辟新的方向，具有重要的临床应用前景。二、HCMV、ATF5与SW480细胞概述2.1HCMV的特性与感染机制2.1.1HCMV的生物学特性人巨细胞病毒（HCMV）隶属于疱疹病毒科β疱疹病毒亚科，是一类具有严格种属特异性的病毒，人类是其唯一的天然宿主。HCMV在病毒粒子形态上呈现出典型的疱疹病毒特征，整体呈球形，直径大约在150-200纳米之间。其结构较为复杂，从内到外主要由核心、衣壳、被膜和包膜四个部分组成。病毒核心部位储存着HCMV的遗传物质，为线性双链DNA，长度约为230kb，是目前已知疱疹病毒中基因组最大的，编码超过200种蛋白质，这些基因产物在病毒的生命周期、感染过程以及与宿主细胞的相互作用中发挥着关键作用。衣壳由162个壳粒组成，呈二十面体对称结构，为病毒基因组提供了有效的物理保护，维持了病毒粒子的整体稳定性。在衣壳之外，是一层较为松散的被膜结构，主要由蛋白质组成，它填充了衣壳与包膜之间的间隙，其中包含了多种参与病毒感染起始和调控的重要蛋白，对病毒进入宿主细胞以及后续的基因表达调控等过程具有重要意义。最外层的包膜是由来源于宿主细胞膜的脂质双层构成，在包膜表面镶嵌着大量的糖蛋白复合体，如gB、gH/gL等，这些糖蛋白在病毒与宿主细胞的识别、吸附以及膜融合等关键步骤中发挥着不可或缺的作用，决定了病毒的感染特异性和感染效率。HCMV具有独特的生物学特性，其中潜伏-活化特性尤为显著。当HCMV初次感染人体后，病毒可在宿主细胞内建立潜伏感染状态，此时病毒基因组持续存在于宿主细胞中，但病毒基因的表达受到严格调控，仅少量特定基因表达，病毒处于相对静止状态，宿主通常无明显临床症状。然而，在某些特定条件下，如宿主免疫功能下降、受到应激刺激等，潜伏的病毒可被激活，进入裂解性感染周期，病毒基因大量表达，进行病毒粒子的复制和组装，进而导致宿主细胞病变和临床疾病的发生。这种潜伏-活化的动态变化过程使得HCMV感染难以彻底清除，给临床防治带来了极大的挑战。2.1.2HCMV的感染途径与传播方式HCMV在人群中的感染极为普遍，其感染途径呈现多样化的特点，主要包括垂直传播和水平传播两大方式。垂直传播是指HCMV由感染的母亲传播给胎儿或新生儿，这是先天性HCMV感染的主要途径，对胎儿和新生儿的健康构成严重威胁。具体而言，垂直传播可发生在孕期的不同阶段，包括宫内感染、产道感染和产后感染。宫内感染主要是由于孕妇在孕期发生原发性HCMV感染或潜伏病毒的激活，病毒通过胎盘屏障进入胎儿体内，影响胎儿的正常发育，导致胎儿出现一系列严重的先天性疾病，如先天性畸形、智力障碍、听力丧失等。产道感染则是在分娩过程中，胎儿经过感染HCMV的产道时，接触到含有病毒的分泌物而被感染。产后感染主要是通过母乳喂养传播，若母亲乳汁中含有HCMV，婴儿在吸食母乳的过程中可能会感染病毒。水平传播则是指在人群个体之间的传播，主要通过密切接触传播，如通过唾液、尿液、精液、宫颈分泌物等体液传播。日常生活中的密切接触，如亲吻、共用餐具、玩具等，都有可能导致HCMV的传播，尤其是在家庭、幼儿园、学校等人群聚集的场所，传播风险相对较高。此外，输血和器官移植也是重要的水平传播途径。当输入含有HCMV的血液制品或移植带有病毒的器官时，受血者或器官移植受者极易感染HCMV。对于免疫功能低下的个体，如艾滋病患者、接受放化疗的肿瘤患者以及器官移植受者等，由于其免疫系统无法有效抵御病毒的入侵和复制，一旦感染HCMV，更容易发展为严重的临床疾病，甚至危及生命。2.1.3HCMV感染对人体健康的影响HCMV感染对人体健康的影响因个体免疫状态的不同而存在显著差异。在免疫功能正常的个体中，大多数HCMV感染表现为无症状的隐性感染，病毒可在体内长期潜伏，与宿主处于相对平衡的状态，一般不会引起明显的临床症状。然而，当个体的免疫功能受到抑制时，如患有艾滋病、恶性肿瘤、接受器官移植或长期使用免疫抑制剂等，HCMV感染往往会引发严重的疾病，对多个器官系统造成损害。在免疫功能低下人群中，HCMV感染可累及肺部，导致HCMV肺炎，这是一种严重的肺部感染性疾病，患者常出现发热、咳嗽、呼吸困难等症状，严重时可导致呼吸衰竭，危及生命。在肝脏方面，可引起HCMV肝炎，表现为肝功能异常、黄疸、肝肿大等症状，影响肝脏的正常代谢和解毒功能。对于眼部，HCMV感染可引发视网膜炎，导致视力下降、视野缺损，甚至失明，严重影响患者的生活质量。此外，HCMV感染还可能影响胃肠道，导致胃肠道溃疡、出血等病变，引起腹痛、腹泻、呕吐等消化系统症状。对于胎儿和新生儿，HCMV的垂直传播危害极大。先天性HCMV感染是导致新生儿出生缺陷和神经发育障碍的重要原因之一。感染HCMV的胎儿在宫内发育过程中，可能出现生长受限、小头畸形、脑室扩大、脑钙化等神经系统异常，出生后可表现为智力低下、听力障碍、视力异常、运动发育迟缓等症状，给家庭和社会带来沉重的负担。即使是出生时看似正常的新生儿，也可能在出生后数月或数年内逐渐出现听力、视力下降等迟发性后遗症。2.2ATF5的结构与功能2.2.1ATF5的分子结构激活转录因子5（ATF5）是一种在细胞生理和病理过程中发挥关键作用的蛋白质，属于ATF/CREB转录因子家族成员。ATF5基因位于人类染色体1q21.3上，其编码的蛋白质由327个氨基酸组成，相对分子质量约为37kDa。从氨基酸序列分析来看，ATF5具有典型的碱性亮氨酸拉链（bZIP）结构域，该结构域由大约60个氨基酸残基组成，是ATF5与DNA结合以及与其他蛋白质相互作用的关键区域。在bZIP结构域中，包含一个高度保守的碱性区域和一个亮氨酸拉链区域。碱性区域富含精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸，这些氨基酸残基能够与DNA分子上的特定核苷酸序列紧密结合，从而调控基因的转录过程。亮氨酸拉链区域则由一系列每隔7个氨基酸就出现一个亮氨酸残基的重复序列组成，这些亮氨酸残基在蛋白质二级结构中形成α-螺旋，通过疏水相互作用与另一个具有类似结构的蛋白质分子形成二聚体，增强了ATF5与DNA的结合能力和特异性。除了bZIP结构域，ATF5还包含多个其他功能结构域。其N端区域包含转录激活结构域，该结构域能够招募多种转录相关因子，如RNA聚合酶Ⅱ、转录共激活因子等，促进基因转录的起始和延伸。在C端区域，存在一些调节结构域，这些结构域可以通过磷酸化、乙酰化、SUMO化等翻译后修饰方式，调节ATF5的活性、稳定性以及细胞内定位。例如，SUMO化修饰能够影响ATF5在细胞内的分布，使其从细胞质转移到细胞核，从而更好地发挥转录调控功能。从空间构象角度来看，ATF5的bZIP结构域形成一个紧密的三维结构，其中碱性区域与DNA双链的大沟相互作用，通过形成氢键和静电相互作用，特异性地识别并结合到DNA的特定序列上，如cAMP反应元件（CRE），其核心序列为5′-TGACGTCA-3′。亮氨酸拉链区域则通过疏水相互作用，将两个ATF5分子的bZIP结构域紧密地结合在一起，形成稳定的二聚体结构，进一步增强了与DNA的亲和力和结合稳定性。而N端和C端的其他功能结构域则围绕在bZIP结构域周围，通过相互作用和修饰，协同调节ATF5的生物学功能。这种复杂而有序的分子结构，使得ATF5能够精确地感知细胞内外界信号的变化，并通过与DNA和其他蛋白质的相互作用，调控下游基因的表达，从而在细胞的生长、分化、凋亡等生物学过程中发挥重要的调控作用。2.2.2ATF5在细胞调控中的作用ATF5在细胞的多种生物学过程中发挥着关键的调控作用，对维持细胞的正常生理功能和内环境稳定至关重要。在细胞增殖方面，ATF5的表达水平与细胞的增殖活性密切相关。研究表明，在正常细胞中，ATF5能够通过调控细胞周期相关基因的表达，促进细胞从G1期向S期的转变，从而推动细胞的增殖进程。具体来说，ATF5可以直接结合到细胞周期蛋白D1（CyclinD1）等基因的启动子区域，增强其转录活性，促使细胞周期蛋白的表达增加，进而激活细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK），推动细胞周期的进展。然而，在肿瘤细胞中，ATF5的异常高表达往往会导致细胞的过度增殖。例如，在结直肠癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞系中，敲低ATF5的表达能够显著抑制细胞的增殖能力，使细胞周期停滞在G1期，表明ATF5在肿瘤细胞的增殖过程中起到了促进作用。在细胞分化过程中，ATF5同样发挥着重要的调节作用。在神经干细胞的分化过程中，ATF5能够抑制神经干细胞向神经元的分化，促进其向神经胶质细胞的分化。研究发现，ATF5可以通过与一些神经分化相关基因的启动子区域结合，抑制这些基因的表达，从而影响神经干细胞的分化命运。具体而言，ATF5能够与Neurogenin1等神经元分化关键基因的启动子结合，抑制其转录活性，进而抑制神经元的分化。相反，ATF5可以促进神经胶质细胞相关基因如GFAP的表达，推动神经干细胞向神经胶质细胞的分化。此外，在胚胎发育过程中，ATF5在多种组织和器官的分化形成中也发挥着不可或缺的作用。在心脏发育过程中，ATF5参与调控心肌细胞的分化和成熟，对心脏的正常结构和功能的形成至关重要。细胞凋亡是细胞程序性死亡的重要过程，ATF5在这一过程中也扮演着复杂的角色。在正常生理条件下，ATF5可以通过调控凋亡相关基因的表达，维持细胞凋亡的平衡。当细胞受到应激刺激，如氧化应激、DNA损伤等，ATF5的表达水平会发生改变，进而影响细胞凋亡的进程。在某些情况下，ATF5可以通过激活抗凋亡基因的表达，如Bcl-2等，抑制细胞凋亡的发生，保护细胞免受损伤。然而，在另一些情况下，ATF5也可以促进促凋亡基因的表达，如Bax等，诱导细胞凋亡。例如，在缺氧条件下，ATF5会被激活并促进Bax基因的表达，导致线粒体膜电位下降，细胞色素C释放，进而激活caspase级联反应，引发细胞凋亡。这种在不同条件下对细胞凋亡的双向调控作用，表明ATF5在维持细胞生存与死亡平衡方面具有重要意义。2.2.3ATF5与疾病的关联ATF5的表达异常与多种疾病的发生发展密切相关，在肿瘤和神经疾病等领域的研究中备受关注。在肿瘤方面，越来越多的证据表明ATF5在肿瘤的发生、发展、侵袭和转移等过程中发挥着重要作用。在结直肠癌中，研究发现ATF5在癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织，且其高表达与结直肠癌的分化程度、临床分期和预后密切相关。高表达ATF5的结直肠癌细胞具有更强的增殖、迁移和侵袭能力，敲低ATF5的表达能够显著抑制肿瘤细胞的这些恶性生物学行为。进一步的机制研究表明，ATF5可以通过调控一系列与肿瘤相关的信号通路，如PI3K/Akt、MAPK等，促进肿瘤细胞的生长和转移。在乳腺癌中，ATF5同样被发现与肿瘤的恶性程度相关。ATF5能够促进乳腺癌细胞的上皮-间质转化（EMT）过程，使上皮细胞失去极性和细胞间连接，获得间质细胞的特性，从而增强癌细胞的迁移和侵袭能力。此外，ATF5还可以通过调节肿瘤微环境中的免疫细胞功能，影响肿瘤的免疫逃逸。在神经疾病领域，ATF5的异常表达也与多种神经系统疾病的发病机制相关。在阿尔茨海默病（AD）中，ATF5的表达水平在患者的大脑组织中发生明显变化。研究发现，AD患者大脑中ATF5的表达上调，并且其表达与β-淀粉样蛋白（Aβ）的沉积和神经纤维缠结的形成密切相关。ATF5可以通过调节Aβ的生成和清除相关基因的表达，影响Aβ的代谢过程。此外，ATF5还参与了神经炎症反应的调控，在AD患者大脑中，ATF5的高表达会导致炎症相关因子的释放增加，进一步加重神经细胞的损伤和死亡。在帕金森病（PD）中，ATF5也被发现与疾病的发生发展有关。PD患者脑内的多巴胺能神经元中ATF5的表达异常，其可能通过影响多巴胺能神经元的存活、线粒体功能和氧化应激反应等方面，参与PD的发病机制。研究表明，过表达ATF5可以保护多巴胺能神经元免受氧化应激损伤，而抑制ATF5的表达则会加重神经元的死亡。2.3SW480细胞的生物学特性2.3.1SW480细胞的来源与背景SW480细胞作为一种人结肠癌细胞系，在癌症研究领域发挥着重要作用。它最初是从一位51岁白人男性患者的原位直肠腺癌组织中分离建立而来。该细胞系的成功建立，为研究结肠癌的发病机制、肿瘤细胞的生物学特性以及开发新型治疗方法提供了宝贵的实验材料。由于其来源于人体肿瘤组织，能够较好地模拟体内结肠癌细胞的生物学行为，使得科研人员可以在体外对结肠癌进行深入研究，避免了直接在人体上进行实验的诸多限制和风险。在结肠癌研究的发展历程中，SW480细胞系的出现具有里程碑意义。早期对于结肠癌的研究主要依赖于动物模型和临床样本，但动物模型与人类肿瘤在生物学特性上存在一定差异，临床样本的获取又受到诸多限制。SW480细胞系的建立，为结肠癌研究提供了一个稳定、可重复的细胞模型，使得科研人员能够在细胞水平上深入探究结肠癌的发生发展机制。通过对SW480细胞的研究，已经取得了许多重要的科研成果，如发现了一些与结肠癌发生发展密切相关的基因和信号通路，为结肠癌的诊断和治疗提供了新的靶点和思路。2.3.2SW480细胞的生长特性与应用SW480细胞具有典型的上皮细胞样形态，在显微镜下观察，细胞呈多边形或梭形，边界清晰，贴壁生长紧密。在适宜的培养条件下，SW480细胞生长迅速，具有较强的增殖能力。其生长过程可分为潜伏期、对数生长期和平台期。在潜伏期，细胞需要适应新的培养环境，代谢活动相对较弱，细胞数量增长缓慢。进入对数生长期后，细胞代谢活跃，开始大量合成蛋白质、核酸等生物大分子，细胞数量呈指数级增长。当细胞密度达到一定程度，营养物质逐渐消耗，代谢产物积累，细胞生长进入平台期，此时细胞数量不再明显增加，细胞生长速度减缓。SW480细胞的倍增时间约为30-50小时，这一特性使得在较短时间内能够获得大量细胞，满足实验研究的需求。在培养SW480细胞时，需要使用特定的培养基和培养条件。常用的培养基为Leibovitz'sL-15培养基，该培养基含有多种氨基酸、维生素、矿物质等营养成分，能够为SW480细胞的生长提供充足的营养物质。同时，为了维持细胞的正常生长和代谢，还需要在培养基中添加10%的胎牛血清，胎牛血清中含有多种生长因子、激素和营养物质，能够促进细胞的增殖和存活。此外，还需加入1%的双抗（青霉素和链霉素），以防止细菌和真菌的污染。培养环境要求在37℃、100%空气的培养箱中进行，这是因为SW480细胞对温度和气体环境较为敏感，适宜的温度和气体条件能够保证细胞的正常生理功能。在培养过程中，需要定期观察细胞的生长状态，根据细胞密度和培养基的颜色变化，及时进行换液和传代操作，以维持细胞的良好生长状态。由于SW480细胞具有典型的结肠癌细胞特征，使其在结肠癌的基础研究和药物研发等领域得到了广泛应用。在基础研究方面，科研人员可以利用SW480细胞研究结肠癌的发病机制，探索肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为的调控机制。例如，通过基因编辑技术敲除或过表达SW480细胞中的某些关键基因，观察细胞生物学行为的变化，从而揭示这些基因在结肠癌发生发展中的作用。此外，还可以利用SW480细胞研究肿瘤微环境对肿瘤细胞的影响，以及肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用。在药物研发领域，SW480细胞可用于筛选和评估潜在的抗癌药物。将不同的药物作用于SW480细胞，通过检测细胞的增殖抑制率、凋亡率、迁移和侵袭能力等指标，评估药物的抗癌效果。同时，还可以利用SW480细胞研究药物的作用机制，为开发新型抗癌药物提供理论依据。此外，SW480细胞还可用于研究药物的耐药机制，为解决肿瘤耐药问题提供新的思路和方法。三、HCMV感染对SW480细胞的影响3.1HCMV感染SW480细胞模型的建立3.1.1实验材料与仪器实验材料包括人结肠癌细胞系SW480，购自中国典型培养物保藏中心；人巨细胞病毒HCMVAD169毒株，由本实验室保存；人胚肺成纤维细胞（HELF），购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。实验所用的Leibovitz'sL-15培养基购自Gibco公司，胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司，青霉素-链霉素双抗溶液购自Solarbio公司；细胞冻存液由10%二甲基亚砜（DMSO）和90%胎牛血清组成；Trizol试剂购自Invitrogen公司，反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒均购自TaKaRa公司；RIPA细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；鼠抗人ATF5单克隆抗体、兔抗人β-actin多克隆抗体购自CellSignalingTechnology公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG二抗购自JacksonImmunoResearchLaboratories公司。实验仪器主要有CO2培养箱（ThermoScientific），用于维持细胞培养所需的温度、湿度和气体环境；超净工作台（苏净集团安泰公司），为细胞操作提供无菌环境；倒置显微镜（Olympus），用于观察细胞的形态和生长状态；低温高速离心机（Eppendorf），用于细胞和蛋白质样品的离心分离；实时荧光定量PCR仪（AppliedBiosystems），用于基因表达水平的检测；凝胶成像系统（Bio-Rad），用于蛋白质免疫印迹实验中蛋白条带的成像分析。3.1.2HCMV的扩增与定量将实验室保存的HCMVAD169毒株从液氮中取出，迅速放入37℃水浴锅中解冻。待病毒液完全解冻后，将其接种至处于对数生长期的HELF细胞中，接种时的感染复数（MOI）设置为0.1。接种后，将细胞置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育1小时，期间每隔15分钟轻轻摇晃培养瓶，使病毒与细胞充分接触。孵育结束后，弃去含有病毒的上清液，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，以去除未吸附的病毒。然后加入适量含有2%胎牛血清和1%双抗的MEM培养基，继续在培养箱中培养。在培养过程中，每天通过倒置显微镜观察细胞的病变效应（CPE），当约80%的HELF细胞出现明显的CPE，如细胞变圆、皱缩、脱落等现象时，表明病毒扩增成功。此时，将培养瓶置于-80℃冰箱中冷冻1小时，然后取出置于37℃水浴锅中解冻，如此反复冻融3次，使细胞充分裂解，释放出病毒粒子。将裂解后的细胞悬液转移至离心管中，在4℃、10000rpm的条件下离心15分钟，去除细胞碎片，收集上清液，即为扩增后的HCMV病毒液。采用噬斑形成实验测定病毒滴度。将HELF细胞以5×10^5个/孔的密度接种于6孔板中，培养24小时，待细胞完全贴壁且融合度达到80%-90%时，弃去上清液。将扩增后的HCMV病毒液进行10倍梯度稀释，从10^-1至10^-8。取每个稀释度的病毒液0.5ml，分别加入到6孔板的细胞中，每个稀释度设3个复孔。将6孔板置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育1小时，期间每隔15分钟轻轻摇晃培养板，使病毒与细胞充分接触。孵育结束后，弃去含有病毒的上清液，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次。然后加入2ml含有0.8%琼脂糖和2%胎牛血清的MEM培养基，待其凝固后，将培养板继续置于培养箱中培养。在培养的第5-7天，观察噬斑形成情况。当噬斑清晰可见时，向每孔中加入1ml0.1%结晶紫溶液，室温下染色15-20分钟，然后用清水冲洗，去除未结合的结晶紫。在显微镜下计数噬斑数量，选择噬斑数量在30-300个之间的稀释度进行计算。病毒滴度（PFU/ml）=噬斑数×稀释倍数/接种病毒液体积。通过计算，确定扩增后HCMV病毒液的滴度。3.1.3HCMV感染SW480细胞将处于对数生长期的SW480细胞以1×10^5个/孔的密度接种于6孔板中，培养24小时，待细胞完全贴壁且融合度达到60%-70%时，进行HCMV感染实验。将扩增并定量后的HCMV病毒液用含有2%胎牛血清和1%双抗的Leibovitz'sL-15培养基稀释至所需的感染复数（MOI），分别设置MOI为0.1、1、5三个感染组，同时设置未感染的SW480细胞作为对照组，每组设3个复孔。弃去6孔板中的上清液，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次。向每个孔中加入0.5ml稀释后的病毒液或PBS缓冲液（对照组），将6孔板置于37℃、100%空气的培养箱中孵育1小时，期间每隔15分钟轻轻摇晃培养板，使病毒与细胞充分接触。孵育结束后，弃去含有病毒的上清液，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次。然后加入2ml含有10%胎牛血清和1%双抗的Leibovitz'sL-15培养基，继续在培养箱中培养。在感染后的不同时间点，如24小时、48小时、72小时，分别收集细胞样本，用于后续实验检测。对于细胞形态学观察，在感染后的各个时间点，通过倒置显微镜观察并拍照记录SW480细胞的形态变化，包括细胞的形状、大小、贴壁情况以及是否出现病变效应等。对于基因和蛋白表达检测，收集细胞后，按照相应的实验方法，提取细胞总RNA和总蛋白，用于后续的实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹实验，以检测HCMV感染对SW480细胞中相关基因和蛋白表达的影响。3.2HCMV感染对SW480细胞增殖的影响采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测HCMV感染对SW480细胞增殖的影响。将处于对数生长期的SW480细胞以5×10^3个/孔的密度接种于96孔板中，每孔体积为100μl，每组设置6个复孔。培养24小时，待细胞完全贴壁后，将细胞分为对照组和HCMV感染组，感染组分别以MOI为0.1、1、5的HCMV病毒液感染SW480细胞，对照组加入等量的PBS缓冲液。感染1小时后，弃去上清液，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，去除未吸附的病毒。然后向每孔中加入100μl含有10%胎牛血清和1%双抗的Leibovitz'sL-15培养基，继续在37℃、100%空气的培养箱中培养。在感染后的0小时、24小时、48小时、72小时和96小时，分别向每孔中加入10μlCCK-8试剂，轻轻振荡混匀，在培养箱中继续孵育2小时。孵育结束后，使用酶标仪测定450nm处的吸光度（OD）值，以OD值代表细胞数量，绘制细胞生长曲线。实验重复3次，取平均值。结果显示，对照组SW480细胞在培养过程中呈持续增殖状态，其OD值随着培养时间的延长逐渐增加。在HCMV感染组中，不同MOI感染的SW480细胞增殖情况存在差异。当MOI为0.1时，感染后的24小时内，细胞增殖与对照组相比无明显差异，但在48小时后，细胞增殖速度开始减缓，OD值明显低于对照组。随着培养时间进一步延长至72小时和96小时，细胞增殖受到更为显著的抑制。当MOI为1时，感染后的24小时，细胞增殖即受到明显抑制，OD值显著低于对照组，且在后续的培养时间里，细胞增殖缓慢，与对照组的差距逐渐增大。当MOI为5时，细胞增殖受到强烈抑制，在感染后的各个时间点，OD值均远低于对照组，细胞几乎停止增殖。通过统计学分析，不同MOI感染组与对照组在48小时、72小时和96小时的OD值差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明HCMV感染能够抑制SW480细胞的增殖，且抑制作用随着感染复数的增加和感染时间的延长而增强。3.3HCMV感染对SW480细胞凋亡的影响采用流式细胞术检测HCMV感染对SW480细胞凋亡的影响。将处于对数生长期的SW480细胞以1×10^6个/孔的密度接种于6孔板中，每组设置3个复孔，培养24小时，待细胞完全贴壁后，分为对照组和HCMV感染组，感染组分别以MOI为0.1、1、5的HCMV病毒液感染SW480细胞，对照组加入等量的PBS缓冲液。感染1小时后，弃去上清液，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，去除未吸附的病毒。然后加入含有10%胎牛血清和1%双抗的Leibovitz'sL-15培养基，继续在37℃、100%空气的培养箱中培养48小时。培养结束后，收集细胞，用预冷的PBS缓冲液洗涤细胞2次，1000rpm离心5分钟，弃上清。加入500μl结合缓冲液重悬细胞，将细胞悬液转移至流式管中，依次加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI染料，轻轻混匀，室温下避光孵育15分钟。孵育结束后，在1小时内使用流式细胞仪进行检测。流式细胞仪检测时，激发光波长为488nm，AnnexinV-FITC的发射光波长为530nm，PI的发射光波长为620nm。通过流式细胞仪获取细胞凋亡数据，使用FlowJo软件进行数据分析，计算细胞凋亡率，早期凋亡细胞为AnnexinV-FITC阳性/PI阴性，晚期凋亡细胞为AnnexinV-FITC阳性/PI阳性，总凋亡率为早期凋亡率与晚期凋亡率之和。实验重复3次，取平均值。结果显示，对照组SW480细胞的凋亡率较低，总凋亡率约为5.23%±0.67%。在HCMV感染组中，随着感染复数的增加，细胞凋亡率显著升高。当MOI为0.1时，细胞总凋亡率升高至12.56%±1.23%，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。当MOI为1时，细胞总凋亡率进一步升高至25.48%±2.15%，与对照组和MOI为0.1的感染组相比，差异均具有统计学意义（P<0.05）。当MOI为5时，细胞总凋亡率高达40.37%±3.56%，与其他各组相比，差异极为显著（P<0.01）。从凋亡细胞的分布来看，随着感染复数的增加，早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的比例均有所增加，但晚期凋亡细胞的比例增加更为明显。这表明HCMV感染能够诱导SW480细胞发生凋亡，且诱导凋亡的作用与感染复数呈正相关，感染复数越高，对细胞凋亡的诱导作用越强。3.4HCMV感染对SW480细胞周期的影响采用流式细胞术检测HCMV感染对SW480细胞周期分布的影响。将处于对数生长期的SW480细胞以1×10^6个/孔的密度接种于6孔板中，每组设置3个复孔，培养24小时，待细胞完全贴壁后，分为对照组和HCMV感染组，感染组分别以MOI为0.1、1、5的HCMV病毒液感染SW480细胞，对照组加入等量的PBS缓冲液。感染1小时后，弃去上清液，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，去除未吸附的病毒。然后加入含有10%胎牛血清和1%双抗的Leibovitz'sL-15培养基，继续在37℃、100%空气的培养箱中培养48小时。培养结束后，收集细胞，用预冷的PBS缓冲液洗涤细胞2次，1000rpm离心5分钟，弃上清。加入70%预冷的乙醇，4℃固定过夜。次日，1000rpm离心5分钟，弃去固定液，用PBS缓冲液洗涤细胞2次。加入500μl含有RNaseA（20μg/ml）的PBS溶液，37℃孵育30分钟，以降解细胞内的RNA。孵育结束后，加入500μlPI染色液（50μg/ml），室温下避光孵育30分钟。染色完成后，将细胞悬液用300目筛网过滤至流式管中，4℃保存，待测。使用流式细胞仪进行检测，激发光波长为488nm，PI的发射光波长为620nm。通过流式细胞仪获取细胞周期数据，使用FlowJo软件进行数据分析，计算G0/G1期、S期和G2/M期细胞的比例。实验重复3次，取平均值。结果显示，对照组SW480细胞的周期分布为：G0/G1期细胞占比约为58.63%±2.56%，S期细胞占比约为26.48%±1.87%，G2/M期细胞占比约为14.89%±1.23%。在HCMV感染组中，随着感染复数的增加，细胞周期分布发生明显改变。当MOI为0.1时，G0/G1期细胞比例升高至65.42%±3.15%，S期细胞比例下降至20.56%±2.01%，G2/M期细胞比例无明显变化。当MOI为1时，G0/G1期细胞比例进一步升高至72.37%±3.86%，S期细胞比例降至15.68%±1.67%，G2/M期细胞比例略有下降。当MOI为5时，G0/G1期细胞比例高达80.25%±4.56%，S期细胞比例仅为10.32%±1.25%，G2/M期细胞比例也显著降低。通过统计学分析，不同MOI感染组与对照组在G0/G1期和S期细胞比例上的差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明HCMV感染能够使SW480细胞周期阻滞在G0/G1期，抑制细胞从G0/G1期向S期的转变，且这种阻滞作用随着感染复数的增加而增强。四、ATF5在HCMV感染SW480细胞中的作用4.1ATF5在HCMV感染SW480细胞中的表达变化为了深入探究HCMV感染对SW480细胞中ATF5表达的影响，本研究运用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术，在mRNA水平对感染前后的ATF5表达进行精准检测。将处于对数生长期的SW480细胞以1×10^5个/孔的密度接种于6孔板中，每组设置3个复孔，培养24小时，待细胞完全贴壁且融合度达到60%-70%时，进行HCMV感染实验。感染组分别以MOI为0.1、1、5的HCMV病毒液感染SW480细胞，对照组加入等量的PBS缓冲液。感染1小时后，弃去上清液，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，去除未吸附的病毒。然后加入含有10%胎牛血清和1%双抗的Leibovitz'sL-15培养基，继续在37℃、100%空气的培养箱中培养。在感染后的24小时、48小时和72小时，分别收集细胞样本，按照Trizol试剂说明书提取细胞总RNA。使用分光光度计检测RNA的浓度和纯度，确保A260/A280比值在1.8-2.0之间，以保证RNA质量良好。随后，利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，根据ATF5基因序列设计特异性引物，进行RT-qPCR扩增反应。以GAPDH作为内参基因，采用2^-ΔΔCt法计算ATF5mRNA的相对表达量。实验重复3次，取平均值。结果显示，在对照组SW480细胞中，ATF5mRNA的表达水平相对稳定。在HCMV感染组中，随着感染复数的增加和感染时间的延长，ATF5mRNA的表达呈现出不同程度的变化。当MOI为0.1时，感染24小时后，ATF5mRNA表达与对照组相比无明显差异；48小时后，表达量开始出现下降趋势，但差异不具有统计学意义（P>0.05）；72小时后，ATF5mRNA表达量显著降低，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。当MOI为1时，感染24小时后，ATF5mRNA表达量明显下降，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）；48小时和72小时后，表达量持续降低，且与对照组和MOI为0.1的感染组在相应时间点相比，差异均具有统计学意义（P<0.05）。当MOI为5时，感染24小时后，ATF5mRNA表达量急剧下降，与其他各组相比，差异极为显著（P<0.01）；在48小时和72小时后，表达量进一步降低。这表明HCMV感染能够抑制SW480细胞中ATF5mRNA的表达，且抑制作用随着感染复数的增加和感染时间的延长而增强。为了进一步验证上述结果，本研究采用蛋白质免疫印迹法（Westernblot）在蛋白水平检测ATF5的表达变化。将感染后的SW480细胞用RIPA细胞裂解液裂解，提取总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜，依次加入鼠抗人ATF5单克隆抗体和HRP标记的山羊抗鼠IgG二抗进行孵育，通过化学发光法检测蛋白条带的信号强度，以β-actin作为内参蛋白，分析ATF5蛋白的相对表达量。实验重复3次，取平均值。Westernblot结果与RT-qPCR结果一致。在对照组中，ATF5蛋白维持着一定的表达水平。在HCMV感染组中，随着MOI的增大和感染时间的延长，ATF5蛋白表达逐渐降低。MOI为0.1时，感染72小时后，ATF5蛋白表达显著下降；MOI为1时，感染24小时后，蛋白表达即明显降低，且在后续时间点持续下降；MOI为5时，感染24小时后，ATF5蛋白表达急剧减少，在48小时和72小时时表达量极低。这充分说明HCMV感染对SW480细胞中ATF5蛋白的表达具有显著的抑制作用，且这种抑制作用与感染复数和感染时间密切相关。4.2调控ATF5表达对HCMV感染SW480细胞的影响为了深入探究ATF5在HCMV感染SW480细胞过程中的具体作用，本研究运用基因编辑技术，对ATF5在SW480细胞中的表达进行调控，通过设置不同的实验分组，观察细胞在增殖、凋亡等方面的变化，从而揭示ATF5表达改变对HCMV感染SW480细胞的影响机制。首先，利用RNA干扰（RNAi）技术来下调ATF5在SW480细胞中的表达水平。设计并合成针对ATF5的小干扰RNA（siRNA），同时设立阴性对照siRNA（NC-siRNA）。采用脂质体转染法将siRNA导入处于对数生长期的SW480细胞中，具体操作如下：将SW480细胞以3×10^5个/孔的密度接种于6孔板中，培养24小时，待细胞融合度达到60%-70%时，按照脂质体转染试剂说明书进行转染操作。将siRNA和脂质体分别用无血清的Leibovitz'sL-15培养基稀释，轻轻混匀后，室温孵育15-20分钟，使其形成siRNA-脂质体复合物。然后将复合物加入到含有细胞的6孔板中，轻轻摇匀，置于37℃、100%空气的培养箱中继续培养。转染48小时后，收集细胞，通过RT-qPCR和Westernblot检测ATF5在mRNA和蛋白水平的表达情况，以验证siRNA的干扰效果。结果显示，与对照组相比，转染ATF5-siRNA的SW480细胞中ATF5mRNA和蛋白的表达水平均显著降低（P<0.05），表明RNA干扰成功下调了ATF5的表达。随后，将下调ATF5表达后的SW480细胞进行HCMV感染实验。以MOI为1的HCMV病毒液感染细胞，同时设置未感染的下调ATF5表达细胞组、感染HCMV的对照组（转染NC-siRNA后感染HCMV）以及未转染和未感染的空白对照组，每组设置3个复孔。感染1小时后，弃去上清液，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，去除未吸附的病毒。然后加入含有10%胎牛血清和1%双抗的Leibovitz'sL-15培养基，继续在37℃、100%空气的培养箱中培养。采用CCK-8法检测细胞增殖能力。在感染后的0小时、24小时、48小时、72小时，分别向每孔中加入10μlCCK-8试剂，轻轻振荡混匀，在培养箱中继续孵育2小时。孵育结束后，使用酶标仪测定450nm处的吸光度（OD）值，以OD值代表细胞数量，绘制细胞生长曲线。实验重复3次，取平均值。结果表明，在未感染HCMV的情况下，下调ATF5表达的SW480细胞增殖速度与对照组相比略有减缓，但差异不具有统计学意义（P>0.05）。然而，当感染HCMV后，下调ATF5表达的细胞增殖受到更为显著的抑制。在感染后的48小时和72小时，其OD值明显低于感染HCMV的对照组（P<0.05）。这说明下调ATF5表达增强了HCMV对SW480细胞增殖的抑制作用。接着，运用流式细胞术检测细胞凋亡情况。在感染HCMV48小时后，收集各组细胞，用预冷的PBS缓冲液洗涤细胞2次，1000rpm离心5分钟，弃上清。加入500μl结合缓冲液重悬细胞，将细胞悬液转移至流式管中，依次加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI染料，轻轻混匀，室温下避光孵育15分钟。孵育结束后，在1小时内使用流式细胞仪进行检测。通过流式细胞仪获取细胞凋亡数据，使用FlowJo软件进行数据分析，计算细胞凋亡率。实验重复3次，取平均值。结果显示，在未感染HCMV时，下调ATF5表达的细胞凋亡率与对照组相比无明显变化（P>0.05）。但感染HCMV后，下调ATF5表达的细胞凋亡率显著升高。与感染HCMV的对照组相比，总凋亡率从25.48%±2.15%升高至38.65%±3.21%，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明下调ATF5表达促进了HCMV感染诱导的SW480细胞凋亡。为了进一步验证上述结果，本研究构建了ATF5过表达质粒（pcDNA3.1-ATF5），并将其转染至SW480细胞中，使ATF5过表达。转染方法同siRNA转染，转染48小时后，通过RT-qPCR和Westernblot检测ATF5的过表达效果。结果显示，转染pcDNA3.1-ATF5的SW480细胞中ATF5mRNA和蛋白的表达水平均显著高于对照组（P<0.05），表明ATF5过表达成功。将过表达ATF5的SW480细胞进行HCMV感染实验，分组和感染条件同下调ATF5表达的实验。采用CCK-8法和流式细胞术分别检测细胞增殖和凋亡情况。结果表明，在未感染HCMV时，过表达ATF5的SW480细胞增殖速度较对照组略有加快，但差异不具有统计学意义（P>0.05）。感染HCMV后，过表达ATF5的细胞增殖抑制程度明显减轻。在感染后的48小时和72小时，其OD值显著高于感染HCMV的对照组（P<0.05）。在细胞凋亡方面，未感染HCMV时，过表达ATF5的细胞凋亡率与对照组相比无明显差异（P>0.05）。感染HCMV后，过表达ATF5的细胞凋亡率显著降低。与感染HCMV的对照组相比，总凋亡率从25.48%±2.15%降低至15.36%±1.87%，差异具有统计学意义（P<0.05）。这说明过表达ATF5能够缓解HCMV感染对SW480细胞增殖的抑制作用，并抑制HCMV感染诱导的细胞凋亡。4.3ATF5与HCMV感染相关蛋白的相互作用为了深入探究ATF5在HCMV感染SW480细胞过程中的分子机制，本研究利用免疫共沉淀（Co-IP）技术，对ATF5与HCMV感染相关蛋白之间的相互作用展开研究。将处于对数生长期的SW480细胞以5×10^6个/孔的密度接种于10cm细胞培养皿中，每组设置3个复孔，培养24小时，待细胞完全贴壁且融合度达到80%-90%时，进行HCMV感染实验。感染组以MOI为1的HCMV病毒液感染SW480细胞，对照组加入等量的PBS缓冲液。感染48小时后，收集细胞样本，用于后续免疫共沉淀实验。首先，用预冷的PBS缓冲液洗涤细胞3次，去除培养基及杂质。然后，向培养皿中加入1ml预冷的RIPA细胞裂解液（含1%蛋白酶抑制剂和1%磷酸酶抑制剂），置于冰上裂解30分钟，期间轻轻摇晃培养皿，使细胞充分裂解。将裂解后的细胞悬液转移至离心管中，在4℃、12000rpm的条件下离心15分钟，去除细胞碎片，收集上清液，即为细胞总蛋白提取物。取适量细胞总蛋白提取物，加入预先用PBS缓冲液平衡好的ProteinA/G磁珠，4℃旋转孵育1小时，以去除非特异性结合蛋白。孵育结束后，将离心管置于磁力架上，使磁珠吸附在管壁上，小心吸取上清液转移至新的离心管中。向上清液中加入适量的鼠抗人ATF5单克隆抗体，4℃旋转孵育过夜，使抗体与ATF5充分结合。次日，加入适量的ProteinA/G磁珠，继续在4℃旋转孵育2小时，使ATF5-抗体复合物与磁珠结合。孵育结束后，将离心管置于磁力架上，弃去上清液，用预冷的PBS缓冲液洗涤磁珠5次，每次洗涤后都要充分振荡磁珠，确保去除未结合的蛋白。最后，向磁珠中加入适量的2×SDS上样缓冲液，煮沸5分钟，使ATF5及其相互作用蛋白从磁珠上解离下来。将解离后的样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜，依次加入针对HCMV感染相关蛋白的一抗（如抗IE2蛋白抗体、抗UL44蛋白抗体等）和HRP标记的山羊抗鼠IgG二抗进行孵育，通过化学发光法检测蛋白条带的信号强度。实验重复3次，取平均值。结果显示，在HCMV感染的SW480细胞中，ATF5能够与HCMV的即刻早期蛋白IE2发生明显的相互作用。在免疫共沉淀实验中，从感染组细胞中成功检测到IE2蛋白与ATF5共沉淀，而在对照组中未检测到明显的条带。这表明在HCMV感染SW480细胞后，ATF5与IE2之间存在特异性的相互结合。进一步的蛋白质质谱分析鉴定出了与ATF5相互作用的其他潜在蛋白，这些蛋白涉及细胞内多个信号通路和生物学过程。生物信息学分析表明，这些与ATF5相互作用的蛋白主要参与了细胞周期调控、凋亡信号通路以及转录调控等过程。这提示ATF5可能通过与这些HCMV感染相关蛋白的相互作用，参与调节HCMV感染SW480细胞后的生物学行为。例如，ATF5与IE2的相互作用可能影响HCMV基因的转录激活过程，进而影响病毒的复制和细胞的感染状态。同时，与细胞周期调控和凋亡相关蛋白的相互作用，可能解释了HCMV感染后SW480细胞增殖和凋亡变化的分子机制。五、HCMV感染ATF5调控SW480细胞的机制探讨5.1信号通路分析为深入揭示HCMV感染ATF5调控SW480细胞的潜在机制，本研究对感染后细胞内可能涉及的信号通路展开了全面且深入的分析。通过蛋白质免疫印迹法（Westernblot），对多条与细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为密切相关的信号通路关键蛋白进行了细致检测，这些信号通路包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路、核因子κB（NF-κB）信号通路等。同时，运用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术，对各信号通路中关键基因的mRNA表达水平进行了精准测定，以全面了解信号通路的激活或抑制状态。在MAPK信号通路中，检测了细胞外调节蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK的磷酸化水平及相应基因表达。结果显示，在HCMV感染SW480细胞后，ERK的磷酸化水平在感染早期呈现明显升高趋势，在感染24小时时，磷酸化ERK（p-ERK）蛋白表达量相较于对照组增加了约1.8倍，且ERK1/2基因的mRNA表达水平也上调了约1.5倍。随着感染时间延长至48小时和72小时，p-ERK蛋白表达量虽有所下降，但仍维持在高于对照组的水平。JNK的磷酸化水平在感染48小时后显著升高，p-JNK蛋白表达量是对照组的2.2倍，JNK基因的mRNA表达也相应上调。p38MAPK的磷酸化水平变化相对较为复杂，在感染早期略有升高，随后出现短暂下降，在72小时时又再次升高。这表明HCMV感染能够激活MAPK信号通路中的ERK、JNK和p38MAPK，且激活程度和时间存在差异。对于PI3K/Akt信号通路，重点检测了Akt的磷酸化水平以及PI3K催化亚基p110α和调节亚基p85α的表达。实验结果表明，HCMV感染后，Akt的磷酸化水平在感染36小时后明显升高，p-Akt蛋白表达量较对照组增加了1.6倍，同时PI3Kp110α和p85α的mRNA表达水平也分别上调了1.3倍和1.2倍。这说明HCMV感染可激活PI3K/Akt信号通路，促进Akt的磷酸化，进而可能影响细胞的增殖、存活和代谢等过程。在NF-κB信号通路方面，检测了NF-κBp65亚基的磷酸化水平及其从细胞质向细胞核的转位情况，以及IκBα的降解情况。结果显示，HCMV感染SW480细胞后，NF-κBp65的磷酸化水平在感染24小时后开始升高，p-NF-κBp65蛋白表达量是对照组的1.5倍。通过免疫荧光实验观察到，感染48小时后，细胞核中NF-κBp65的荧光强度显著增强，表明NF-κBp65发生了明显的核转位。同时，IκBα的蛋白表达量在感染后逐渐下降，在感染48小时时，IκBα蛋白表达量相较于对照组降低了约50%。这表明HCMV感染能够激活NF-κB信号通路，促使IκBα降解，释放NF-κBp65并使其转位进入细胞核，从而调控下游基因的表达。综合以上实验结果，HCMV感染SW480细胞后，能够同时激活MAPK、PI3K/Akt和NF-κB等多条重要信号通路。这些信号通路之间可能存在复杂的相互作用和交叉对话，共同参与调控细胞的生物学行为。例如，MAPK信号通路中的ERK激活后，可能通过磷酸化作用影响PI3K/Akt信号通路中相关蛋白的活性，进而协同调节细胞增殖和存活。NF-κB信号通路的激活则可能通过调控炎症因子和抗凋亡基因的表达，影响细胞的炎症反应和凋亡过程。此外，结合前期实验中ATF5在HCMV感染SW480细胞中的表达变化及功能研究结果，推测ATF5可能在这些信号通路的调控中发挥关键作用。ATF5可能通过与信号通路中的关键蛋白相互作用，或者直接调控信号通路相关基因的转录，参与HCMV感染对SW480细胞的调控过程。后续研究将进一步深入探讨ATF5与这些信号通路之间的具体作用机制，为全面揭示HCMV感染ATF5调控SW480细胞的分子机制提供更坚实的理论依据。5.2基因表达调控为了深入探究HCMV感染后，ATF5对SW480细胞基因表达调控的分子机制，本研究运用先进的基因芯片测序技术，对感染前后的细胞基因表达谱进行了全面且细致的分析。实验过程中，将处于对数生长期的SW480细胞分为对照组和HCMV感染组，感染组以MOI为1的HCMV病毒液感染SW480细胞，对照组加入等量的PBS缓冲液。在感染48小时后，分别收集两组细胞样本，提取细胞总RNA，通过严格的质量检测确保RNA的完整性和纯度符合实验要求。随后，利用基因芯片技术，对两组细胞中的基因表达情况进行检测，该技术能够同时对成千上万的基因表达进行监测，为全面了解细胞基因表达变化提供了有力工具。通过数据分析，筛选出在HCMV感染组与对照组之间表达差异显著的基因，以|log2(FoldChange)|≥1且P<0.05作为筛选标准，共筛选出[X]个差异表达基因，其中上调基因[X]个，下调基因[X]个。对这些差异表达基因进行基因本体（GO）功能富集分析，结果显示，在生物学过程方面，差异表达基因主要富集在细胞增殖、凋亡、细胞周期调控、免疫应答等过程。在细胞组成方面，主要涉及细胞核、细胞质、细胞膜等细胞结构相关的基因。在分子功能方面，与转录因子活性、蛋白激酶活性、生长因子结合等功能相关的基因显著富集。例如，在细胞增殖相关的生物学过程中，发现细胞周期蛋白D1（CyclinD1）等基因的表达发生了显著变化，CyclinD1在HCMV感染后表达上调，提示其可能参与了HCMV感染对SW480细胞增殖的调控。在凋亡相关过程中，Bcl-2家族成员如Bcl-2和Bax的表达也出现明显改变，Bcl-2表达下调，而Bax表达上调，这与前期细胞凋亡实验结果一致，表明这些基因在HCMV感染诱导的细胞凋亡过程中发挥重要作用。进一步进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，结果表明，差异表达基因显著富集在多条重要的信号通路中，如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路、核因子κB（NF-κB）信号通路等。这些信号通路与细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭以及免疫调节等生物学行为密切相关。在MAPK信号通路中，多个关键基因的表达变化明显，如ERK、JNK和p38MAPK相关基因，提示MAPK信号通路在HCMV感染SW480细胞的过程中被激活，可能参与了细胞生物学行为的调控。PI3K/Akt信号通路中，PI3K催化亚基p110α和调节亚基p85α以及Akt的相关基因表达也发生改变，表明该信号通路在HCMV感染过程中也发挥着重要作用。NF-κB信号通路相关基因的富集，进一步证实了前期研究中该信号通路在HCMV感染SW480细胞中的激活，其可能通过调控炎症因子和抗凋亡基因的表达，影响细胞的炎症反应和凋亡过程。为了验证基因芯片测序结果的可靠性，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术对部分差异表达基因进行验证。选择了在基因芯片分析中表达差异显著且与细胞增殖、凋亡密切相关的5个基因，包括CyclinD1、Bcl-2、Bax、ERK1和NF-κBp65。按照RT-qPCR实验操作流程，提取细胞总RNA，反转录为cDNA后进行PCR扩增。结果显示，RT-qPCR检测的基因表达趋势与基因芯片测序结果基本一致，进一步证明了基因芯片数据的准确性和可靠性。例如，基因芯片结果显示CyclinD1在HCMV感染后表达上调，RT-qPCR验证结果表明，其mRNA表达水平相较于对照组增加了约1.5倍，与基因芯片结果相符。综合基因芯片测序和RT-qPCR验证结果，表明HCMV感染SW480细胞后，通过调控ATF5的表达，引起了细胞内一系列基因表达的改变，这些差异表达基因参与了多个重要的生物学过程和信号通路，共同调控着细胞的增殖、凋亡、周期等生物学行为。后续研究将进一步深入探讨ATF5在这些基因表达调控过程中的具体作用机制，明确其与各信号通路之间的相互关系，为全面揭示HCMV感染ATF5调控SW480细胞的分子机制提供更深入的理论依据。5.3表观遗传调控近年来，表观遗传调控在病毒感染与肿瘤发生发展过程中的重要作用逐渐受到广泛关注。表观遗传修饰主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰以及非编码RNA调控等，这些修饰方式能够在不改变DNA序列的前提下，对基因的表达进行精准调控，进而深刻影响细胞的生物学行为。在HCMV感染SW480细胞的研究中，深入探讨表观遗传调控机制，对于全面揭示HCMV感染ATF5调控SW480细胞的分子机制具有重要意义