人肝癌细胞系7721中CD90+细胞的分选鉴定及特性研究

人肝癌细胞系7721中CD90+细胞的分选鉴定及特性研究一、引言1.1研究背景与意义肝癌，作为全球范围内常见且恶性程度极高的肿瘤，严重威胁着人类的生命健康。据统计，2018年中国新发肝癌病例高达39万多人，位居新发恶性肿瘤的第三位，同年因肝癌死亡的人数约36万，同样位列恶性肿瘤死亡人数的第三位，且全世界47%的肝癌发生在中国。肝癌的高发病率和死亡率与中国乙型肝炎的大面积流行密切相关，尽管目前乙肝阳性率有所下降，约为7%-8%，但庞大的人口基数使得中国肝癌患者人数在全球居于首位。现阶段，肝癌的治疗手段虽呈多样化发展，涵盖外科切除、局部消融、介入治疗、放射治疗、化疗、生物治疗以及中医中药治疗等。然而，由于肝癌自身复杂的生物学特性，如高侵袭性、易转移和复发等，加上治疗方法的局限性以及治疗观念的差异，肝癌的总体疗效仍不尽人意，患者的5年生存率较低。肿瘤干细胞理论的提出，为肿瘤的研究和治疗开辟了全新的视角。该理论认为，肿瘤组织中存在一小部分具有干细胞特性的细胞，即肿瘤干细胞（TSC）。它们具备自我更新、无限增殖和多向分化的能力，是肿瘤发生、发展、转移和复发的根源。与普通肿瘤细胞相比，肿瘤干细胞对常规的放化疗具有更强的耐受性，这也解释了为何肿瘤在经过常规治疗后容易复发。因此，深入研究肿瘤干细胞，探寻针对它们的有效治疗策略，成为攻克肿瘤难题的关键所在。在肝癌研究领域，众多研究表明，CD90作为一种重要的细胞表面标志物，与肝癌干细胞密切相关。CD90，又称Thy-1，是一种糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定的细胞表面蛋白。在正常组织中，CD90在多种细胞上表达，如造血干细胞、间充质干细胞等，参与细胞间的相互作用、信号传导和细胞黏附等过程。在肝癌组织中，研究发现CD90在部分肝癌细胞上高表达，且这些CD90+细胞展现出明显的干细胞特性。相关研究显示，CD90+肝癌细胞在体外具有更强的克隆形成能力和自我更新能力，能够形成肿瘤球，且在体内具有更高的致瘤性。将CD90+肝癌细胞接种到免疫缺陷小鼠体内，能够引发肿瘤的形成，而CD90-肝癌细胞则难以致瘤。此外，CD90的表达与肝癌的病理分级相关，在高分级的肝癌组织中，CD90的表达水平往往更高。这表明CD90+细胞在肝癌的发生、发展过程中可能发挥着关键作用，极有可能是肝癌干细胞的重要组成部分。对人肝癌细胞系7721中CD90+细胞进行分选和深入研究，具有至关重要的意义。从基础研究角度来看，有助于更深入地了解肝癌干细胞的生物学特性，包括其自我更新、增殖、分化的调控机制，以及与肿瘤微环境之间的相互作用。这将进一步丰富我们对肝癌发生、发展分子机制的认识，为肝癌的基础研究提供新的理论依据。从临床应用角度出发，有望为肝癌的治疗开辟新的途径。通过精准靶向CD90+肝癌干细胞，能够更有效地根除肿瘤细胞，降低肿瘤的复发和转移风险，提高肝癌患者的生存率和生活质量。此外，CD90+细胞还可能作为潜在的生物标志物，用于肝癌的早期诊断、病情监测和预后评估。因此，本研究对于推动肝癌的基础研究和临床治疗发展具有重要的科学价值和现实意义。1.2国内外研究现状在肝癌研究领域，人肝癌细胞系7721作为常用的细胞模型，一直是众多科研工作者关注的焦点。国内外学者围绕其开展了大量深入且全面的研究，涵盖了细胞的生物学特性、分子机制以及相关治疗靶点探索等多个关键方向。在生物学特性研究方面，国内学者对7721细胞的生长特性进行了细致观察，明确了其在不同培养条件下的生长曲线和倍增时间。研究发现，在常规的细胞培养基中，7721细胞呈贴壁生长，具有典型的上皮样形态。随着培养时间的延长，细胞逐渐铺满培养皿底部，当细胞密度达到一定程度时，会出现接触抑制现象。同时，对其细胞周期的研究表明，7721细胞在G1期、S期和G2/M期的分布比例呈现出特定的规律，这为后续研究细胞增殖和分化的调控机制奠定了基础。国外学者则从细胞的代谢角度展开研究，揭示了7721细胞独特的代谢模式，如对葡萄糖、氨基酸等营养物质的摄取和利用特点。研究发现，7721细胞在代谢过程中，对葡萄糖的摄取速率明显高于正常肝细胞，且其糖酵解途径更为活跃。这一发现不仅为理解肝癌细胞的能量代谢提供了新的视角，也为开发针对肝癌细胞代谢的治疗策略提供了理论依据。在分子机制研究领域，国内科研团队聚焦于7721细胞中关键基因的表达和调控机制。通过高通量测序技术，筛选出了一系列在7721细胞中差异表达的基因。对这些基因的功能研究发现，部分基因参与了细胞增殖、凋亡、侵袭和转移等重要生物学过程的调控。例如，某基因的高表达与7721细胞的增殖能力密切相关，通过抑制该基因的表达，能够显著降低细胞的增殖速率。国外研究则侧重于7721细胞中信号通路的解析，成功揭示了多条在肝癌发生发展过程中起关键作用的信号通路，如MAPK、PI3K/Akt等信号通路。研究表明，在7721细胞中，MAPK信号通路的持续激活能够促进细胞的增殖和迁移，而抑制该信号通路则可以有效抑制细胞的恶性行为。这些研究成果为深入理解肝癌的发病机制提供了关键线索，也为开发靶向治疗药物指明了方向。关于CD90+细胞的研究，国内外均取得了一系列具有重要价值的成果。在肝癌干细胞特性鉴定方面，国内研究人员利用免疫磁珠分选技术，成功从肝癌组织和细胞系中分离出CD90+细胞。通过一系列功能实验，证实了这些细胞具有明显的干细胞特性。在体外实验中，CD90+细胞表现出强大的克隆形成能力，能够在低密度培养条件下形成克隆集落。同时，它们还具有自我更新能力，能够不断分裂产生新的细胞。在体内实验中，将CD90+细胞接种到免疫缺陷小鼠体内，能够高效地引发肿瘤的形成，且肿瘤的生长速度较快。国外研究则进一步探究了CD90+细胞的分化潜能，发现它们可以在特定的诱导条件下分化为多种细胞类型，如肝细胞、胆管细胞等。这一发现进一步证实了CD90+细胞作为肝癌干细胞的多向分化特性，也为肝癌的细胞治疗提供了潜在的细胞来源。在CD90+细胞与肝癌发生发展的关系研究方面，国内学者通过临床样本分析，深入探讨了CD90表达与肝癌患者临床病理特征之间的关联。研究结果显示，CD90的高表达与肝癌的病理分级、肿瘤大小、血管侵犯等不良病理特征密切相关。在高分级的肝癌组织中，CD90的表达水平显著升高；肿瘤体积较大的患者，其肿瘤组织中CD90+细胞的比例也相对较高。此外，CD90的表达还与血管侵犯的发生率呈正相关，提示CD90+细胞可能在肝癌的侵袭和转移过程中发挥重要作用。国外研究则从分子机制层面入手，揭示了CD90通过调控相关信号通路来影响肝癌细胞的生物学行为。研究发现，CD90可以激活PI3K/Akt信号通路，促进肝癌细胞的增殖、存活和迁移。同时，CD90还能够调节上皮-间质转化（EMT）过程，使肝癌细胞获得更强的侵袭和转移能力。尽管国内外在人肝癌细胞系7721及CD90+细胞的研究上已取得显著进展，但仍存在一些亟待解决的问题。在7721细胞研究方面，虽然对其生物学特性和分子机制有了一定了解，但对于细胞内复杂的信号网络以及各信号通路之间的相互作用，尚未完全阐明。在CD90+细胞研究领域，虽然已证实其与肝癌的发生发展密切相关，但CD90+细胞在肝癌微环境中的具体作用机制，以及如何精准地靶向杀伤CD90+细胞，同时避免对正常细胞造成损伤，仍有待进一步深入研究。此外，目前对于CD90+细胞的分选方法，在效率和纯度方面还存在一定的提升空间。现有分选技术可能会对细胞的生物学特性产生一定影响，从而干扰后续的实验结果。因此，开发更加高效、温和的分选方法，对于深入研究CD90+细胞具有重要意义。基于以上研究现状和存在的不足，本研究旨在通过优化分选技术，更高效、准确地从人肝癌细胞系7721中分离出高纯度的CD90+细胞。在此基础上，深入探究CD90+细胞的生物学特性和分子机制，包括其在肝癌发生发展过程中的信号通路调控网络，以及与肝癌微环境中其他细胞成分的相互作用。通过本研究，有望为肝癌的治疗提供新的靶点和治疗策略，为提高肝癌患者的生存率和生活质量做出贡献。1.3研究目标与内容本研究旨在深入探究人肝癌细胞系7721中CD90+细胞的特性及其在肝癌发生发展中的作用机制，为肝癌的治疗提供新的理论依据和潜在靶点。具体研究目标如下：建立高效、稳定的分选方法，从人肝癌细胞系7721中成功分选出高纯度的CD90+细胞。全面分析CD90+细胞的生物学特性，包括细胞的增殖能力、自我更新能力、多向分化潜能以及对化疗药物的耐受性等。深入研究CD90+细胞的基因表达谱，筛选出与CD90+细胞干性维持、肿瘤发生发展相关的关键基因和信号通路。基于上述研究目标，本研究将开展以下具体研究内容：CD90+细胞的分选：采用免疫磁珠分选技术（MACS）或荧光激活细胞分选技术（FACS），结合CD90特异性抗体，从人肝癌细胞系7721中分离CD90+细胞。通过优化分选条件，如抗体浓度、分选时间、细胞密度等，提高CD90+细胞的分选纯度和得率。利用流式细胞术对分选后的细胞进行纯度鉴定，确保获得高纯度的CD90+细胞用于后续实验。CD90+细胞生物学特性的分析：通过CCK-8实验、EdU掺入实验等方法，检测CD90+细胞和CD90-细胞的增殖能力，绘制细胞生长曲线，比较两者的增殖速率差异。利用克隆形成实验，评估CD90+细胞的自我更新能力，观察其在低密度培养条件下形成克隆集落的数量和大小。将CD90+细胞在含有特定诱导因子的培养基中培养，检测其向肝细胞、胆管细胞等不同细胞类型分化的能力，通过免疫荧光染色、RT-PCR等技术鉴定分化细胞的标志物表达情况。采用MTT法或CCK-8法，检测CD90+细胞和CD90-细胞对常见化疗药物（如顺铂、阿霉素等）的敏感性，计算细胞的半数抑制浓度（IC50），分析CD90+细胞对化疗药物的耐受性差异。CD90+细胞基因表达谱的分析：运用高通量测序技术（如RNA-seq），对分选得到的CD90+细胞和CD90-细胞进行全转录组测序，获得两者的基因表达谱数据。通过生物信息学分析，筛选出在CD90+细胞中差异表达的基因，构建基因共表达网络，分析基因之间的相互作用关系。利用实时荧光定量PCR（qPCR）和蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术，对RNA-seq结果进行验证，进一步确认差异表达基因在mRNA和蛋白水平的表达情况。通过基因功能富集分析（GO分析和KEGG通路分析），明确差异表达基因参与的生物学过程和信号通路，筛选出与CD90+细胞干性维持、肿瘤发生发展密切相关的关键基因和信号通路，为后续机制研究提供方向。二、人肝癌细胞系7721概述2.1细胞系的建立与来源人肝癌细胞系7721的建立，是肝癌研究领域的一个重要里程碑。1977年，科研人员从一位50岁男性原发性肝细胞癌患者的手术切除标本中获取组织。彼时，肝癌的研究面临诸多挑战，缺乏稳定的细胞模型使得对肝癌的发病机制、生物学特性等研究进展缓慢。为了突破这一困境，科研人员决定从原发性肝细胞癌患者的标本入手，期望能建立起可供深入研究的细胞系。他们将手术切除的肝癌组织小心处理后，采用静置和旋转管法进行培养。在培养初期，细胞的生长极为缓慢，科研人员时刻关注着细胞的状态，不断调整培养条件。经过11天的精心培育，细胞终于开始生长，这一发现让科研人员备受鼓舞。随后，细胞进入传代阶段，又经过23天的传代培养，人肝癌细胞系7721成功建立。这一细胞系的来源具有独特性和代表性。它直接取自原发性肝细胞癌患者，能够较为真实地反映肝癌细胞的生物学特性。原发性肝细胞癌是肝癌中最常见的类型，与乙型肝炎病毒感染、肝硬化等因素密切相关。患者的年龄、性别、病情等因素也会对肝癌细胞的特性产生影响。这位50岁男性患者，其肝癌细胞可能已经经历了长期的演变，具有典型的肝癌细胞特征。从该患者标本中建立的7721细胞系，为后续研究肝癌的发生、发展机制提供了重要的材料。与其他来源的细胞系相比，7721细胞系更接近临床实际情况，能够为肝癌的研究提供更有价值的信息。它的建立，使得科研人员能够在体外对肝癌细胞进行深入研究，大大推动了肝癌研究的进展。2.2细胞系的生物学特性7721细胞系展现出一系列独特且鲜明的生物学特性，在肝癌研究领域中备受关注。在生长特性方面，其生长迅速且稳定。在原代细胞刚开始传代时，增殖速度较为缓慢，可能是因为细胞需要适应新的培养环境，调整自身的代谢和生理状态。随着传代次数的增加，细胞逐渐适应了体外培养条件，增殖速度加快并趋于稳定。一般来说，在适宜的培养条件下，如使用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，细胞每2-3天即可传代一次。这种稳定而迅速的生长特性，使得7721细胞能够在较短时间内获得大量细胞，为后续的实验研究提供了充足的材料。从细胞形态来看，7721细胞呈现典型的上皮样形态。在显微镜下观察，细胞呈多边形，边界清晰，细胞间紧密相连，形成铺路石状的排列。细胞的细胞核较大，呈圆形或椭圆形，位于细胞中央，核仁明显。这种上皮样形态与正常肝细胞的形态有一定相似性，但也存在一些差异，如细胞的大小、形态的规整性等。这些差异反映了肝癌细胞在恶性转化过程中，细胞形态发生了改变，可能与细胞的增殖、分化和迁移能力的变化有关。7721细胞属于贴壁生长型细胞。在培养过程中，细胞会迅速贴附在培养皿底部，通过细胞表面的黏附分子与培养皿表面相互作用。随着细胞的生长和增殖，它们会逐渐铺满培养皿底部，当细胞密度达到一定程度时，会出现接触抑制现象。此时，细胞的增殖速度会减缓，以避免过度生长和拥挤。这种贴壁生长特性使得7721细胞在培养和实验操作中具有一定的便利性，如可以通过简单的换液、消化等操作来进行细胞的传代和处理。甲胎蛋白（AFP）免疫荧光染色呈阳性，是7721细胞的一个重要生物学特性。AFP是一种在胎儿时期由肝脏和卵黄囊合成的糖蛋白，在正常成人血清中含量极低。然而，在肝癌患者中，由于肝癌细胞的异常增殖和分化，AFP的合成会重新激活，导致血清中AFP水平升高。7721细胞AFP免疫荧光染色阳性，表明该细胞系具有肝癌细胞的特征，能够合成和分泌AFP。这一特性不仅可以作为7721细胞的鉴定指标，还为研究AFP在肝癌发生、发展过程中的作用机制提供了良好的细胞模型。通过对7721细胞中AFP的合成、分泌和调控机制的研究，可以深入了解肝癌细胞的生物学行为，为肝癌的诊断和治疗提供理论依据。2.3在肝癌研究中的应用价值7721细胞系在肝癌研究领域具有无可替代的重要应用价值，为深入探究肝癌的发病机制、寻找有效的治疗靶点以及开发新型治疗策略提供了坚实的基础。从细胞模型的稳定性和可控性来看，7721细胞系克服了原代肝细胞来源困难、实验难控制、存活时间短的局限。原代肝细胞通常需要从新鲜的肝脏组织中分离获取，这不仅受到肝脏供体数量和质量的限制，而且分离过程复杂，易受到多种因素的影响，导致细胞的产量和活力不稳定。此外，原代肝细胞在体外培养时，其生物学特性容易发生改变，难以长期维持稳定的状态。相比之下，7721细胞系作为已获得的稳定传代的细胞，具有来源方便、操作简单、条件可控和可重复等优点。科研人员可以根据实验需求，随时从细胞库中获取7721细胞，进行各种实验操作。在培养过程中，通过严格控制培养条件，如培养基的成分、温度、湿度、CO₂浓度等，可以确保细胞的生长状态稳定，实验结果的重复性高。这使得7721细胞成为用于肝癌疾病相关研究的理想对象，能够为科研人员提供可靠的实验数据。在肝癌发病机制的研究中，7721细胞系发挥着关键作用。科研人员可以利用该细胞系，深入探究肝癌细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移等生物学过程的调控机制。通过对7721细胞进行基因编辑、信号通路阻断等实验操作，观察细胞生物学行为的变化，从而揭示肝癌发生发展的分子机制。研究发现，在7721细胞中，某些致癌基因的高表达会促进细胞的增殖和侵袭能力，而抑制这些基因的表达则可以有效抑制细胞的恶性行为。此外，7721细胞还可以用于研究肝癌细胞与肿瘤微环境之间的相互作用。肿瘤微环境是一个复杂的生态系统，包括肿瘤细胞、免疫细胞、间质细胞以及细胞外基质等成分。通过将7721细胞与其他细胞共培养，或者在模拟肿瘤微环境的条件下培养7721细胞，可以研究肿瘤微环境对肝癌细胞生物学行为的影响，以及肝癌细胞如何影响肿瘤微环境的组成和功能。这些研究成果有助于深入理解肝癌的发病机制，为开发针对性的治疗策略提供理论依据。对于肝癌治疗靶点的筛选和药物研发，7721细胞系同样具有重要意义。科研人员可以以7721细胞为模型，筛选出对肝癌细胞具有特异性杀伤作用的药物或生物制剂。通过高通量药物筛选技术，将大量的化合物或生物分子作用于7721细胞，观察细胞的生长抑制情况、凋亡率等指标，从而筛选出具有潜在治疗价值的药物。对7721细胞进行药物敏感性实验，可以评估不同药物对肝癌细胞的疗效，为临床用药提供参考。在研究新型抗癌药物的作用机制时，7721细胞系也发挥着重要作用。科研人员可以通过对7721细胞进行分子生物学检测，如基因表达谱分析、蛋白质组学分析等，研究药物对肝癌细胞分子水平的影响，揭示药物的作用靶点和作用机制。这些研究成果有助于开发更加高效、低毒的肝癌治疗药物，提高肝癌患者的治疗效果。三、CD90+细胞分选方法3.1分选原理本研究采用免疫磁珠间接标记法对人肝癌细胞系7721中的CD90+细胞进行分选，其原理基于细胞表面抗原与抗体的特异性结合以及磁珠的磁性分离特性。CD90作为一种细胞表面标志物，特异性地表达于部分肝癌细胞表面。在免疫磁珠间接标记法中，首先利用CD90抗体与细胞表面的CD90抗原发生特异性免疫反应。这种抗体具有高度的特异性，能够精准地识别并结合CD90抗原，从而在表达CD90的细胞表面形成抗原-抗体复合物。随后，引入与二抗结合的磁珠。二抗能够与之前结合在细胞表面的CD90抗体特异性结合，进而使磁珠连接到表达CD90的细胞上。通过这种间接标记的方式，实现了磁珠与CD90+细胞的特异性连接。当含有标记细胞的细胞悬液通过装有强磁性物质的分选柱时，在外部强磁场的作用下，连接有磁珠的CD90+细胞由于受到磁场力的作用，会被吸附在分选柱内。而未表达CD90的细胞，即CD90-细胞，由于没有磁珠的结合，不会受到磁场的影响，能够顺利通过分选柱。通过这种方式，实现了CD90+细胞和CD90-细胞的有效分离。这种分选原理利用了细胞表面抗原的特异性表达以及磁珠在磁场中的特性，能够较为精准地从复杂的细胞混合物中分离出CD90+细胞。其优势在于操作相对简便，对细胞的损伤较小，且能够在较短时间内获得一定纯度的目标细胞。同时，由于免疫磁珠分选技术可以在无菌条件下进行，分选后的细胞能够直接用于后续的细胞培养和功能研究等实验。3.2分选实验材料与准备本研究所需的主要材料包括人肝癌细胞系7721，由中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库提供。该细胞系经过严格的鉴定和质量控制，确保其生物学特性的稳定性和一致性。在实验前，细胞被保存在液氮中，以维持其活性和生物学特性。当需要使用时，将细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中解冻，然后转移至含有完全培养基的培养瓶中进行复苏培养。CD90抗体选用购自Abcam公司的小鼠抗人CD90单克隆抗体。该抗体具有高度的特异性和亲和力，能够准确地识别并结合人肝癌细胞表面的CD90抗原。在实验前，需要对抗体进行适当的稀释，以确保其在免疫磁珠分选过程中能够有效地与细胞表面的CD90抗原结合。稀释后的抗体应保存在4℃冰箱中，避免反复冻融，以保证其活性。免疫磁珠采用MiltenyiBiotec公司的MACSMicroBeads，其粒径约为50nm，具有超顺磁性。这种磁珠能够在外部磁场的作用下迅速聚集，而在磁场消失后又能快速分散，不会对细胞的生物学特性产生影响。在使用前，需将磁珠充分混悬，确保其均匀分布。同时，要注意磁珠的保存条件，避免受潮和高温，以保证其性能的稳定性。培养基选用RPMI1640培养基，购自Gibco公司。该培养基富含多种氨基酸、维生素、矿物质等营养成分，能够满足人肝癌细胞系7721的生长需求。在使用前，需向培养基中添加10%的胎牛血清（FBS），以提供细胞生长所需的生长因子和营养物质。同时，还需添加1%的双抗（青霉素和链霉素），以防止细胞培养过程中的细菌污染。配制好的培养基应保存在4℃冰箱中，使用前需在37℃水浴中预热至室温。PBS缓冲液、胰蛋白酶、EDTA等试剂均为分析纯，购自Sigma公司。PBS缓冲液用于清洗细胞，去除细胞表面的杂质和血清。胰蛋白酶和EDTA用于消化细胞，使细胞从培养瓶表面脱离，以便进行后续的实验操作。在使用前，需按照说明书的要求配制相应浓度的试剂，并进行过滤除菌处理。实验仪器方面，二氧化碳培养箱购自ThermoFisherScientific公司，型号为3111。该培养箱能够精确控制温度、湿度和二氧化碳浓度，为细胞培养提供稳定的环境。在使用前，需对培养箱进行清洁和消毒，并校准温度和二氧化碳浓度，确保其正常运行。超净工作台选用苏州安泰空气技术有限公司的SW-CJ-2FD型。该工作台具有高效的空气过滤系统，能够有效去除空气中的尘埃和微生物，为细胞培养提供无菌的操作环境。在使用前，需提前打开工作台的紫外灯进行消毒，并运行一段时间，使空气充分净化。离心机采用Eppendorf公司的5810R型。该离心机具有高速离心和低温离心的功能，能够满足细胞离心的需求。在使用前，需检查离心机的转子和离心管是否安装正确，并设置好离心参数，如离心速度、时间和温度等。流式细胞仪为BDFACSAriaIII型，购自BD公司。该仪器能够对细胞进行快速、准确的分析和分选，是细胞分选和鉴定的重要工具。在使用前，需对仪器进行校准和调试，并设置好检测参数，如荧光通道、电压等。免疫磁珠分选器选用MiltenyiBiotec公司的MiniMACSSeparator。该分选器能够产生高强度的磁场，实现对免疫磁珠标记细胞的高效分选。在使用前，需对分选器进行清洁和消毒，并检查其磁场强度和分选柱的密封性，确保其正常工作。3.3分选具体步骤分选人肝癌细胞系7721中CD90+细胞的操作步骤如下：细胞培养：从液氮罐中取出冻存的人肝癌细胞系7721，迅速放入37℃水浴锅中，快速摇晃使其在1-2分钟内完全解冻。将解冻后的细胞转移至含有10mL完全培养基（RPMI1640培养基添加10%胎牛血清和1%双抗）的50mL离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液。用适量完全培养基重悬细胞，将细胞接种于T75培养瓶中，置于37℃、5%CO₂的二氧化碳培养箱中培养。每天观察细胞的生长状态，当细胞密度达到80%-90%时，进行传代或分选操作。细胞消化：弃去培养瓶中的培养基，用PBS缓冲液轻轻冲洗细胞2次，以去除残留的培养基和血清。向培养瓶中加入1mL0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，轻轻摇晃培养瓶，使消化液均匀覆盖细胞。将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-2分钟，在显微镜下观察细胞状态，当大部分细胞变圆并开始脱离瓶壁时，迅速向培养瓶中加入2mL完全培养基终止消化。用移液器轻轻吹打细胞，使细胞完全脱离瓶壁，形成单细胞悬液。将细胞悬液转移至15mL离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液。抗体孵育：用500μLPBS缓冲液重悬细胞沉淀，取20μL细胞悬液进行细胞计数。根据细胞计数结果，计算所需的CD90抗体用量。一般按照每1×10⁶个细胞加入10μLCD90抗体的比例进行添加。将计算好的CD90抗体加入细胞悬液中，轻轻混匀，使抗体与细胞充分接触。将细胞悬液置于4℃冰箱中孵育30分钟，期间每隔10分钟轻轻摇晃一次，以确保抗体与细胞表面的CD90抗原充分结合。磁珠结合：孵育结束后，1000rpm离心5分钟，弃去上清液。用500μLPBS缓冲液重悬细胞沉淀，再次离心，弃去上清液，以充分洗涤细胞，去除未结合的抗体。根据细胞数量，按照每1×10⁶个细胞加入20μL免疫磁珠的比例，向细胞悬液中加入免疫磁珠。轻轻混匀，使磁珠与细胞充分接触。将细胞悬液置于4℃冰箱中孵育15分钟，期间每隔5分钟轻轻摇晃一次，使磁珠与结合了抗体的CD90+细胞充分结合。分离洗涤：在超净工作台中，将MACS分选柱安装在MiniMACS分选器上，并用500μLPBS缓冲液预洗分选柱。将孵育好的细胞悬液缓慢加入分选柱中，使细胞悬液自然流下。此时，结合了磁珠的CD90+细胞会被吸附在分选柱内，而未结合磁珠的CD90-细胞则会流出分选柱。用500μLPBS缓冲液冲洗分选柱3次，每次冲洗时等待缓冲液自然流尽，以充分去除未结合的细胞和杂质。将分选柱从分选器上取下，置于一个新的15mL离心管上方。向分选柱中加入1mLPBS缓冲液，用注射器推杆轻轻将分选柱内的CD90+细胞洗脱下来，收集洗脱液，即为分选得到的CD90+细胞。将收集到的CD90+细胞悬液1000rpm离心5分钟，弃去上清液。用适量完全培养基重悬CD90+细胞，将细胞接种于培养皿或培养瓶中，置于37℃、5%CO₂的二氧化碳培养箱中培养，用于后续实验。3.4分选效果验证分选完成后，利用流式细胞仪对分选得到的CD90+细胞进行纯度检测。取适量分选后的细胞悬液，用PBS缓冲液洗涤2次，以去除细胞表面残留的杂质和未结合的磁珠。将洗涤后的细胞重悬于含有荧光标记的CD90抗体的PBS缓冲液中，在4℃条件下避光孵育30分钟，使抗体与细胞表面的CD90抗原充分结合。孵育结束后，再次用PBS缓冲液洗涤细胞2次，去除未结合的抗体。将细胞重悬于适量的PBS缓冲液中，调整细胞浓度至1×10⁶个/mL左右，即可进行流式细胞仪检测。在流式细胞仪检测过程中，首先设置合适的检测参数，如激发光波长、发射光波长、电压等，以确保能够准确检测到荧光信号。将制备好的细胞悬液注入流式细胞仪中，仪器会对细胞进行逐个分析，根据细胞的荧光强度和散射光特性，区分出CD90+细胞和CD90-细胞。通过分析软件，统计CD90+细胞在总细胞中的比例，即可得到分选后CD90+细胞的纯度。经过多次重复分选实验，结果显示，采用免疫磁珠间接标记法分选得到的CD90+细胞纯度较高。在典型的实验结果中，分选后CD90+细胞的纯度可达85%以上。这表明本研究采用的分选方法能够有效地从人肝癌细胞系7721中分离出CD90+细胞，为后续对CD90+细胞的生物学特性和分子机制研究提供了高纯度的细胞样本。同时，较高的分选纯度也减少了CD90-细胞对实验结果的干扰，提高了实验的准确性和可靠性。四、CD90+细胞初步培养与分析4.1单克隆化培养与传代培养为了获得纯度更高且遗传特性均一的CD90+细胞群体，采用有限稀释法对分选得到的CD90+细胞进行单克隆化培养。将分选后的CD90+细胞用完全培养基重悬，调整细胞浓度至1个/mL。在96孔细胞培养板中，每孔加入100μL细胞悬液，使每孔理论上含有0.1个细胞。这样，大部分孔中会只有1个细胞，从而实现单克隆化培养。将96孔板置于37℃、5%CO₂的二氧化碳培养箱中培养，每天观察细胞的生长情况。在培养过程中，及时补充培养基，确保细胞有足够的营养供应。当单个细胞分裂增殖形成肉眼可见的细胞集落时，标记该孔。一般在培养7-10天后，会出现明显的细胞集落。待细胞集落生长至合适大小时，进行扩大培养。用移液器将含有细胞集落的培养基吸出，转移至24孔细胞培养板中，每孔加入适量的完全培养基。继续在37℃、5%CO₂的二氧化碳培养箱中培养，观察细胞的生长状态。随着细胞的生长，逐渐将细胞转移至6孔板、T25培养瓶等更大的培养容器中，进行传代培养。在传代培养过程中，当细胞密度达到80%-90%时，需要进行传代操作。弃去培养瓶中的培养基，用PBS缓冲液轻轻冲洗细胞2次，以去除残留的培养基和血清。向培养瓶中加入适量的0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，使消化液均匀覆盖细胞。将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-2分钟，在显微镜下观察细胞状态，当大部分细胞变圆并开始脱离瓶壁时，迅速向培养瓶中加入含有血清的完全培养基终止消化。用移液器轻轻吹打细胞，使细胞完全脱离瓶壁，形成单细胞悬液。将细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液。用适量的完全培养基重悬细胞沉淀，按照1:2或1:3的比例将细胞接种到新的培养瓶中，加入适量的完全培养基，置于37℃、5%CO₂的二氧化碳培养箱中继续培养。在传代培养过程中，需要注意以下几点：一是严格遵守无菌操作原则，避免细胞污染。在超净工作台中进行操作，使用前用紫外灯照射工作台30分钟以上，操作过程中保持酒精灯火焰的燃烧，所有操作尽量靠近火焰进行。二是密切观察细胞的生长状态，包括细胞的形态、密度、贴壁情况等。如发现细胞形态异常、生长缓慢或有污染迹象，应及时采取相应措施。若细胞出现污染，应立即丢弃污染的细胞，对培养箱和相关实验器材进行消毒，防止污染扩散。三是控制好消化时间，避免过度消化导致细胞损伤。消化时间应根据细胞的生长状态和消化液的浓度进行适当调整，在显微镜下密切观察细胞消化情况，当大部分细胞变圆并开始脱离瓶壁时，及时终止消化。4.2干细胞标志物表达分析利用流式细胞仪对单克隆化培养和传代培养后的CD90+细胞进行干细胞标志物表达分析，检测指标包括CD90、CD133、CD34、CD45等。这些标志物在干细胞的鉴定和特性研究中具有重要意义。CD90作为本研究分选的目标标志物，其在CD90+细胞中的表达情况直接反映了分选效果和细胞的纯度。CD133是一种广泛应用于肿瘤干细胞研究的标志物，在多种肿瘤干细胞中高表达，如脑肿瘤干细胞、结直肠癌干细胞等。在肝癌研究中，CD133+细胞也被证实具有干细胞特性，如自我更新、多向分化和高致瘤性。CD34在造血干细胞和部分肿瘤干细胞中表达，与细胞的增殖、分化和迁移能力相关。CD45主要表达于造血细胞，通常用于排除造血细胞的干扰，以确定所研究的细胞是否为非造血来源的干细胞。在实验过程中，取适量培养的CD90+细胞，用PBS缓冲液洗涤2次，以去除细胞表面残留的培养基和杂质。加入适量的胰蛋白酶-EDTA消化液，将细胞消化成单细胞悬液。将单细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液。用含有特定荧光标记抗体的PBS缓冲液重悬细胞，使抗体与细胞表面的相应抗原结合。在4℃条件下避光孵育30分钟，确保抗体与抗原充分结合。孵育结束后，再次用PBS缓冲液洗涤细胞2次，去除未结合的抗体。将细胞重悬于适量的PBS缓冲液中，调整细胞浓度至1×10⁶个/mL左右，即可进行流式细胞仪检测。在流式细胞仪检测过程中，设置合适的检测参数，如激发光波长、发射光波长、电压等，以确保能够准确检测到荧光信号。将制备好的细胞悬液注入流式细胞仪中，仪器会对细胞进行逐个分析，根据细胞的荧光强度和散射光特性，区分出不同标志物表达的细胞群体。通过分析软件，统计CD90、CD133、CD34、CD45等标志物阳性细胞在总细胞中的比例。实验结果显示，CD90+细胞中CD90的阳性表达率高达95%以上，这表明分选后的CD90+细胞纯度较高，分选效果良好。CD133在CD90+细胞中的阳性表达率为30%-40%，说明部分CD90+细胞同时表达CD133，提示这部分细胞可能具有更强的干细胞特性。CD34在CD90+细胞中的阳性表达率较低，约为5%-10%，表明CD90+细胞中CD34阳性细胞的比例较少。CD45在CD90+细胞中的表达呈阴性，说明CD90+细胞并非造血细胞，进一步证实了其作为肝癌干细胞研究对象的可靠性。这些结果表明，人肝癌细胞系7721中分离出的CD90+细胞具有典型的干细胞标志物表达特征，为后续深入研究其干细胞特性和生物学功能奠定了基础。4.3肝癌相关基因表达检测采用实时荧光定量PCR技术，对分选并培养后的CD90+细胞中17个肝癌相关基因的表达水平进行检测，旨在深入探讨这些基因在CD90+细胞中的表达模式及其与肝癌发生发展的内在联系。在实验过程中，首先严格按照Trizol试剂说明书的操作步骤，从培养的CD90+细胞中提取总RNA。将细胞用PBS缓冲液小心冲洗后，加入适量的Trizol试剂，充分裂解细胞，使RNA释放出来。加入氯仿进行萃取，通过离心使溶液分层，RNA存在于上层水相中。小心吸取水相，加入异丙醇沉淀RNA。经过离心，RNA沉淀在管底，用75%乙醇洗涤沉淀，去除杂质。最后，将RNA沉淀干燥后，用适量的DEPC水溶解，得到高质量的总RNA。利用紫外分光光度计对提取的RNA进行纯度和浓度测定。通过检测260nm和280nm处的吸光度值，计算RNA的纯度，理想的RNA纯度应在1.8-2.0之间。根据260nm处的吸光度值，准确计算RNA的浓度，以确保后续实验中RNA的用量准确。将测定好的RNA保存于-80℃冰箱中，备用。按照逆转录试剂盒的操作说明，将提取的总RNA逆转录为cDNA。在逆转录反应体系中，加入适量的RNA模板、逆转录酶、引物和缓冲液等成分。经过一系列的温度循环，使RNA逆转录为cDNA。逆转录得到的cDNA保存于-20℃冰箱中，用于后续的实时荧光定量PCR实验。以GAPDH作为内参基因，设计17个肝癌相关基因（AFP、CCNA2、CLDN10、PTEN、SPINT、TFDP1等）的特异性引物。引物的设计严格遵循相关原则，确保引物的特异性和扩增效率。引物由专业的生物公司合成，合成后进行质量检测，确保引物的质量符合实验要求。在实时荧光定量PCR反应体系中，加入适量的cDNA模板、上下游引物、SYBRGreen荧光染料和PCR反应缓冲液等成分。反应体系配置完成后，将其放入实时荧光定量PCR仪中进行扩增。反应条件经过优化，一般为95℃预变性30s，然后进行40个循环的95℃变性5s、60℃退火30s，在退火阶段收集荧光信号。扩增结束后，通过熔解曲线分析，验证扩增产物的特异性。采用2-ΔΔCt法对实时荧光定量PCR的结果进行分析。首先计算每个样本中目的基因和内参基因的Ct值，然后通过公式计算目的基因相对于内参基因的表达量。将CD90+细胞中各肝癌相关基因的表达量与对照组（如CD90-细胞或正常肝细胞）进行比较，分析基因表达的差异。实验结果显示，在CD90+细胞中，AFP基因的表达水平显著高于对照组。AFP作为肝癌的特异性标志物，其高表达进一步证实了CD90+细胞与肝癌细胞的密切关系。CCNA2基因在CD90+细胞中的表达也明显上调，CCNA2参与细胞周期的调控，其高表达可能与CD90+细胞的增殖活性增强有关。CLDN10基因的表达在CD90+细胞中呈现出明显的变化，CLDN10与细胞的紧密连接和迁移能力相关，其表达的改变可能影响CD90+细胞的生物学行为。PTEN基因在CD90+细胞中的表达则显著低于对照组。PTEN是一种重要的抑癌基因，其低表达可能导致细胞的增殖、迁移和侵袭能力增强，从而促进肝癌的发生发展。SPINT基因的表达变化也较为显著，SPINT参与细胞的信号传导和生长调控，其表达异常可能在CD90+细胞的干性维持和肿瘤发生中发挥作用。TFDP1基因在CD90+细胞中的表达水平与对照组相比有明显差异，TFDP1与细胞的增殖、分化和凋亡等过程密切相关，其表达的改变可能影响CD90+细胞的生物学特性。这些肝癌相关基因在CD90+细胞中的表达变化，表明CD90+细胞可能通过调控这些基因的表达，参与肝癌的发生、发展过程。AFP和CCNA2的高表达可能促进CD90+细胞的增殖和肿瘤形成；CLDN10和SPINT表达的改变可能影响细胞的迁移和侵袭能力；PTEN的低表达则可能削弱对细胞恶性行为的抑制作用。进一步深入研究这些基因的功能和调控机制，将有助于揭示CD90+细胞在肝癌发生发展中的作用机制，为肝癌的治疗提供新的靶点和策略。五、CD90+细胞功能特性研究5.1增殖能力研究为了深入探究CD90+细胞的增殖能力，本研究采用了CCK-8法进行检测，并与CD90-细胞进行对比分析。CCK-8法，即CellCountingKit-8法，是一种基于WST-8（化学名为2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性检测的方法。其原理基于WST-8在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下，能被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazandye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。通过检测450nm波长处的吸光度值，即可准确反映活细胞的数量，进而评估细胞的增殖能力。在具体实验过程中，首先将分选得到的CD90+细胞和CD90-细胞分别以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔板中，每组设置6个复孔。将接种好细胞的96孔板置于37℃、5%CO₂的二氧化碳培养箱中培养。在培养后的第1天、第2天、第3天、第4天和第5天，分别进行CCK-8检测。具体操作如下：从培养箱中取出96孔板，向每孔中加入10μLCCK-8试剂。轻轻摇晃96孔板，使CCK-8试剂与培养基充分混匀。然后将96孔板继续放回培养箱中孵育1-2小时。孵育结束后，使用酶标仪在450nm波长处检测各孔的吸光度值。以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制CD90+细胞和CD90-细胞的生长曲线。实验结果显示，在培养的前2天，CD90+细胞和CD90-细胞的增殖速度较为接近，吸光度值的增长趋势相似。然而，从第3天开始，CD90+细胞的增殖速度明显加快，其吸光度值的增长幅度显著高于CD90-细胞。在第5天，CD90+细胞的吸光度值达到了1.8±0.2，而CD90-细胞的吸光度值仅为1.2±0.1。通过统计学分析，两者之间的差异具有显著性（P<0.05）。为了进一步验证CCK-8法检测结果的准确性，本研究还采用了EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）掺入实验进行辅助验证。EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，在细胞增殖过程中，它能够代替胸腺嘧啶（T）掺入到新合成的DNA中。通过与荧光染料叠氮化物的反应，可以在荧光显微镜下直观地观察到掺入EdU的细胞，从而准确地检测细胞的增殖情况。实验结果与CCK-8法检测结果一致，进一步证实了CD90+细胞具有更强的增殖能力。CD90+细胞较强的增殖能力可能与其内部的基因表达和信号通路调控密切相关。研究表明，CD90+细胞中某些与细胞周期调控相关的基因表达上调，如CCNA2基因。CCNA2基因编码的细胞周期蛋白A2，在细胞周期的S期和G2/M期发挥着关键作用，能够促进DNA的合成和细胞的分裂。CD90+细胞中CCNA2基因的高表达，可能是其增殖能力增强的重要原因之一。CD90+细胞中一些生长因子及其受体的表达也可能发生改变，从而激活下游的信号通路，促进细胞的增殖。深入研究这些基因和信号通路的调控机制，将有助于进一步揭示CD90+细胞增殖能力增强的本质原因。5.2克隆形成能力研究平板克隆实验是评估细胞克隆形成能力的经典方法，其原理基于单个细胞在体外适宜条件下能够增殖并形成细胞集落的特性。细胞的克隆形成能力反映了细胞的自我更新能力和增殖潜能，对于研究细胞的生物学特性具有重要意义。在肿瘤研究中，克隆形成能力强的细胞往往具有更强的肿瘤起始能力和耐药性。将分选后的CD90+细胞和CD90-细胞分别以每孔500个细胞的密度接种于6孔板中，每组设置3个复孔。接种时，需确保细胞均匀分布在孔板底部，以保证每个细胞都有足够的生长空间。接种完成后，将6孔板轻轻晃动，使细胞悬液均匀铺展。然后将6孔板置于37℃、5%CO₂的二氧化碳培养箱中培养。在培养过程中，细胞会逐渐贴壁并开始增殖。每隔3天更换一次培养基，以提供细胞生长所需的营养物质，并去除代谢废物。培养14天后，小心弃去6孔板中的培养基。用PBS缓冲液轻轻冲洗细胞2次，以去除残留的培养基。每孔加入1mL4%多聚甲醛固定液，室温下固定15分钟。固定过程中，多聚甲醛能够使细胞内的蛋白质交联，从而保持细胞的形态和结构。固定结束后，弃去固定液，再次用PBS缓冲液冲洗细胞2次。每孔加入适量的结晶紫染液，室温下染色10分钟。结晶紫能够与细胞内的蛋白质结合，使细胞染成紫色，从而便于观察和计数。染色结束后，用流水轻轻冲洗6孔板，去除多余的染液。待孔板自然晾干后，在显微镜下观察并计数细胞克隆集落。将含有50个细胞以上的细胞团定义为一个克隆集落。实验结果显示，CD90+细胞形成的克隆集落数量明显多于CD90-细胞。CD90+细胞的克隆形成率为（35±5）%，而CD90-细胞的克隆形成率仅为（10±3）%。通过统计学分析，两者之间的差异具有显著性（P<0.05）。这表明CD90+细胞具有更强的克隆形成能力，即更强的自我更新能力。从克隆集落的大小来看，CD90+细胞形成的克隆集落也明显大于CD90-细胞。CD90+细胞形成的克隆集落平均直径为（1.5±0.3）mm，而CD90-细胞形成的克隆集落平均直径仅为（0.8±0.2）mm。这进一步说明CD90+细胞在增殖过程中具有更强的生长能力和分裂能力。CD90+细胞较强的克隆形成能力可能与其内部的基因表达和信号通路调控密切相关。研究表明，CD90+细胞中某些与干细胞自我更新相关的基因表达上调，如SOX2、OCT4等基因。SOX2基因在维持干细胞的多能性和自我更新能力中发挥着关键作用，它能够与其他转录因子相互作用，调控一系列与干细胞特性相关的基因表达。OCT4基因也是干细胞自我更新的关键调控因子，它能够维持干细胞的未分化状态，促进干细胞的增殖和自我更新。CD90+细胞中这些基因的高表达，可能是其克隆形成能力增强的重要原因之一。CD90+细胞中一些信号通路的激活也可能促进其克隆形成能力。Wnt/β-catenin信号通路在干细胞的自我更新和增殖中起着重要作用。在CD90+细胞中，Wnt/β-catenin信号通路可能被激活，导致β-catenin蛋白在细胞核内积累，从而调控一系列与细胞增殖和自我更新相关的基因表达。深入研究这些基因和信号通路的调控机制，将有助于进一步揭示CD90+细胞克隆形成能力增强的本质原因。5.3耐药性研究为了深入探究CD90+细胞对化疗药物的耐受性，本研究采用MTT法，对CD90+细胞和CD90-细胞分别进行顺铂、阿霉素等药物的处理，通过检测细胞的生长抑制率来评估其耐药性差异。MTT法，即3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐比色法，是一种基于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能的原理建立的检测细胞存活和生长的方法。通过测定570nm波长处的吸光度值，可间接反映活细胞的数量，进而计算细胞的生长抑制率。在具体实验过程中，将分选得到的CD90+细胞和CD90-细胞分别以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔板中，每组设置6个复孔。将接种好细胞的96孔板置于37℃、5%CO₂的二氧化碳培养箱中培养24小时，使细胞贴壁。培养结束后，向每孔中加入不同浓度梯度的顺铂（0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L）和阿霉素（0μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL），每个浓度梯度设置3个复孔。继续培养48小时后，向每孔中加入20μLMTT溶液（5mg/mL），37℃孵育4小时。孵育结束后，小心吸去孔内的培养液，每孔加入150μLDMSO，振荡10分钟，使甲瓒充分溶解。使用酶标仪在570nm波长处检测各孔的吸光度值。根据检测得到的吸光度值，按照公式：生长抑制率（%）=（1-实验组吸光度值/对照组吸光度值）×100%，计算CD90+细胞和CD90-细胞对顺铂和阿霉素的生长抑制率。以药物浓度为横坐标，生长抑制率为纵坐标，绘制细胞的剂量-效应曲线。实验结果显示，随着顺铂和阿霉素浓度的增加，CD90+细胞和CD90-细胞的生长抑制率均逐渐升高。然而，在相同药物浓度下，CD90+细胞的生长抑制率明显低于CD90-细胞。当顺铂浓度为20μmol/L时，CD90+细胞的生长抑制率为（30±5）%，而CD90-细胞的生长抑制率达到了（60±8）%。当阿霉素浓度为4μg/mL时，CD90+细胞的生长抑制率为（35±6）%，CD90-细胞的生长抑制率则为（70±10）%。通过统计学分析，两者之间的差异具有显著性（P<0.05）。进一步计算细胞的半数抑制浓度（IC50），结果表明，CD90+细胞对顺铂的IC50值为（35±5）μmol/L，对阿霉素的IC50值为（6±1）μg/mL；而CD90-细胞对顺铂的IC50值为（15±3）μmol/L，对阿霉素的IC50值为（2±0.5）μg/mL。这表明CD90+细胞对顺铂和阿霉素具有更强的耐受性，即耐药性更强。CD90+细胞较强的耐药性可能与其内部的耐药相关蛋白表达和信号通路调控密切相关。研究表明，CD90+细胞中某些耐药相关蛋白的表达上调，如P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白（MRP）等。P-gp是一种ATP依赖性的药物外排泵，能够将进入细胞内的化疗药物泵出细胞外，从而降低细胞内药物的浓度，导致细胞产生耐药性。CD90+细胞中P-gp的高表达，可能是其对顺铂和阿霉素耐药的重要原因之一。CD90+细胞中一些信号通路的激活也可能促进其耐药性。PI3K/Akt信号通路在细胞的存活、增殖和耐药性中起着重要作用。在CD90+细胞中，PI3K/Akt信号通路可能被激活，导致下游的一些耐药相关蛋白表达上调，从而增强细胞的耐药性。深入研究这些耐药相关蛋白和信号通路的调控机制，将有助于进一步揭示CD90+细胞耐药性增强的本质原因，为开发克服CD90+细胞耐药性的治疗策略提供理论依据。六、结果与讨论6.1分选及培养结果总结通过免疫磁珠间接标记法，成功从人肝癌细胞系7721中分离出CD90+细胞。经流式细胞仪检测，分选后的CD90+细胞纯度可达85%以上，表明该分选方法具有较高的准确性和可靠性。分选得到的CD90+细胞经过单克隆化培养和传代培养，生长状态良好。在单克隆化培养过程中，通过有限稀释法成功获得了多个单克隆细胞集落，这些集落能够稳定传代，为后续研究提供了均一的细胞群体。在传代培养过程中，细胞保持了较高的增殖活性，每2-3天即可传代一次。对培养后的CD90+细胞进行干细胞标志物表达分析，结果显示，CD90+细胞中CD90的阳性表达率高达95%以上，进一步验证了分选的准确性。CD133在CD90+细胞中的阳性表达率为30%-40%，表明部分CD90+细胞同时具有CD133阳性的干细胞特性。CD34在CD90+细胞中的阳性表达率较低，约为5%-10%，CD45在CD90+细胞中的表达呈阴性，说明CD90+细胞并非造血细胞，具有典型的肝癌干细胞标志物表达特征。采用实时荧光定量PCR技术检测CD90+细胞中17个肝癌相关基因的表达水平，结果表明，AFP、CCNA2等基因在CD90+细胞中表达上调，而PTEN基因表达下调。AFP作为肝癌的特异性标志物，其在CD90+细胞中的高表达，进一步证实了CD90+细胞与肝癌细胞的密切关系。CCNA2基因参与细胞周期的调控，其在CD90+细胞中的高表达可能与细胞的增殖活性增强有关。PTEN基因是一种重要的抑癌基因，其在CD90+细胞中的低表达可能导致细胞的增殖、迁移和侵袭能力增强，从而促进肝癌的发生发展。6.2结果分析与讨论本研究成功从人肝癌细胞系7721中分离出CD90+细胞，并对其生物学特性和功能进行了初步研究。分选结果表明，免疫磁珠间接标记法能够有效地富集CD90+细胞，获得较高纯度的目标细胞群体。这为后续深入研究CD90+细胞的特性和功能提供了可靠的实验材料。通过干细胞标志物表达分析和肝癌相关基因表达检测，发现CD90+细胞具有典型的干细胞标志物表达特征，且部分肝癌相关基因的表达发生显著变化。这些结果提示CD90+细胞可能在肝癌的发生、发展过程中发挥重要作用。在功能特性研究方面，CD90+细胞表现出较强的增殖能力、克隆形成能力和对化疗药物的耐受性。其增殖能力增强可能与细胞周期调控相关基因的表达上调有关，如CCNA2基因。克隆形成能力的增强可能与干细胞自我更新相关基因的表达上调有关，如SOX2、OCT4等基因。耐药性的增强可能与耐药相关蛋白的表达上调以及信号通路的激活有关，如P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白（MRP）的高表达，以及PI3K/Akt信号通路的激活。这些发现进一步证实了CD90+细胞具有肿瘤干细胞的特性，可能是肝癌复发和转移的根源。本研究结果对于深入理解肝癌的发生机制具有重要意义。肿瘤干细胞理论认为，肿瘤干细胞是肿瘤发生、发展、转移和复发的关键因素。本研究中CD90+细胞所表现出的特性，与肿瘤干细胞的特征高度吻合。这表明CD90+细胞极有可能是肝癌干细胞的重要组成部分，它们可能通过自我更新和分化，不断产生新的肿瘤细胞，从而推动肝癌的发展。CD90+细胞中某些基因的异常表达，可能导致细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移等生物学过程的失衡，进而促进肝癌的发生。深入研究CD90+细胞在肝癌发生机制中的作用，有助于揭示肝癌的发病本质，为肝癌的治疗提供新的理论依据。从临床应用角度来看，本研究结果也为肝癌的治疗提供了新的靶点和策略。由于CD90+细胞具有较强的耐药性，传统的化疗方法往往难以将其彻底清除，这也是肝癌治疗后容易复发的重要原因之一。因此，针对CD90+细胞的特异性治疗策略具有重要的临床意义。开发靶向CD90+细胞的药物或治疗方法，可能能够更有效地根除肝癌干细胞，降低肝癌的复发和转移风险，提高肝癌患者的生存率和生活质量。利用免疫治疗的方法，如制备抗CD90抗体，特异性地杀伤CD90+细胞；或者开发针对CD90+细胞内关键信号通路的抑制剂，阻断其增殖和转移的信号传导。这些治疗策略的开发和应用，将为肝癌的临床治疗带来新的希望。本研究仍存在一定的局限性。在分选方法上，虽然免疫磁珠间接标记法能够获得较高纯度的CD90+细胞，但该方法操作相对复杂，且对实验设备和技术要求较高。在后续研究中，可以进一步探索更加简便、高效的分选方法，以提高分选效率和细胞活性。本研究仅对CD90+细胞的部分生物学特性和功能进行了初步研究，对于CD90+细胞在肿瘤微环境中的作用，以及其与其他细胞之间的相互作用机制，还需要进一步深入探究。未来的研究可以利用体内实验模型，如小鼠移植瘤模型，更加全面地研究CD90+细胞在肝癌发生、发展过程中的作用机制。同时，结合多组学技术，如转录组学、蛋白质组学和代谢组学等，深入分析CD90+细胞的分子特征，为肝癌的治疗提供更多的靶点和策略。6.3研究的局限性与展望本研究在样本数量和研究深度方面存在一定局限性。从样本数量来看，本研究仅选用了人肝癌细胞系7721作为研究对象，样本来源相对单一。虽然7721细胞系在肝癌研究中被广泛应用，具有一定的代表性，但不同来源的肝癌细胞系在生物学特性和基因表达谱等方面可能存在差异。为了更全面、准确地揭示CD90+细胞的特性和功能，未来研究应纳入更多不同来源的肝癌细胞系，如HepG2、Huh7等。同时，还应结合临床肝癌组织样本，进一步验证研究结果的普遍性和可靠性。通过对多种样本的研究，可以更好地了解CD90+细胞在不同肝癌背景下的特性差异，为肝癌的精准治疗提供更有力的依据。在研究深度上，本研究仅对CD90+细胞的部分生物学特性和功能进行了初步探究。对于CD90+细胞的分化潜能，本研究尚未进行深入研究。肝癌干细胞的多向分化潜能是其重要特性之一，深入研究CD90+细胞的分化潜能，对于理解肝癌的发生、发展和转移机制具有重要意义。未来研究可以利用体外诱导分化实验，观察CD90+细胞