T-CIQA 112-2025 动物源性食品中牛、羊和猪源性成分定性检测方法 CRISPR法

动物源性食品中牛、羊和猪源性成分定性检测方法CRISPR法Determinationofingredientsofcattle,sheepandpiginanimalfoo I 1 13缩略语 1 15试剂和材料 16仪器和耗材 27试样制备 28试验步骤 3 4 4 4 4 4 5I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中国出入境检验检疫协会进出口食品标准化技术委国农业科学院深圳农业基因组研究所(岭南现代农业科学与技术广东省实验室深圳分中心)、上海市生1动物源性食品中牛、羊和猪源性成分定性检测方法CRISPR法本文件描述了动物源性食品中牛、羊和猪源性成分的CRISPR检本文件适用于动物源性食品中牛、羊和猪源性成分的定GB/T6682分析实验室用水规格GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生GB/T24777-2009化学品理化及其危险性检测实验室SN/T5624-2023检测实验室质量crRNA：规律间隔成簇短回文重复序列核糖核苷酸（CRISPRRPA：重组酶聚合酶扩增（recombinasepolymeraseamplificattracrRNA：反式激活CRISPRRNA（trans-activationCRISPRR通过CRISPR方法对动物产品中牛、羊和猪源性成分开展定性检测。首先采用RPA进行牛、羊和猪源性基因特异性扩增，再用CRISPR反应特异性切割扩增产物5.610XNEBuffer2.1:100mM氯化钠,50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐,10mM氯化镁,pb）醋酸镁溶液5.9Cas12a酶选用NewEnglandBiolab商业化产品EnGen®LbaCas12a。牛UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUTGGGCTTTAGGGCTTCCG羊ATCTACAAAACTAACCTTTACCCTAAAAGCTAAGAGAGAGTTCTACGGTCTGUAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUUGGCCUGUGUGUAUA猪AAACAATGAGGGTAACGAGUAAUUUCUACUAAGUGUAGAUACACCGAAACAAAATACTC对不限于猪牛羊的肉类取样。所取样品50mg分别至于1.5mL离心管中，3min，期间不时振荡混匀；用离心机（6.3）12000r/min离心5min；转移上清液于洁净离心管中，加4008.2阴性对照、阳性对照和空白对照的8.2.1检测过程中分别设阴性对照、空白对照和阳性对照。8.2.3阴性对照采用已知含有牛、羊和猪源性成分的样品。8.2.4阳性对照采用已知不含牛、羊和猪源性成分的样品。浴锅（6.2）中37℃孵育20min。试剂体积/(μL)正向引物(10μM)（5.10）2.4反向引物(10μM)（5.10）2.4样品DNA（第8.1章的产物）2灭菌H2O补足至47.5无引物再水和缓冲液[5.8（a）]29.5醋酸镁溶液（280mM）[5.8（b）]2.5NEBuffer2.1(10X)（5.6）2221137℃温度下，孵育30min后用酶标仪（6.1）检测荧光(494nm-5259．结果计算10.2阴性对照：无特异性扩增荧光增长，或N值10.3阳性对照：有特异性扩增荧光增长，或N值11.1当样品值与对照值相比有显著性差异，判定在样11.2当样品值与对照值相比没有显著性差异，判定在样品性基