Toll样受体4：动脉粥样硬化发病机制与防治新靶点的深度探索

Toll样受体4：动脉粥样硬化发病机制与防治新靶点的深度探索一、引言1.1研究背景动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是一种严重威胁人类健康的心血管疾病，其发病率和死亡率在全球范围内居高不下。据世界卫生组织（WHO）统计，心血管疾病每年导致约1790万人死亡，占全球死亡总数的31%，而动脉粥样硬化是心血管疾病的主要病理基础。动脉粥样硬化的发生发展是一个复杂的过程，涉及脂质代谢紊乱、炎症反应、氧化应激、血管平滑肌细胞增殖和迁移等多个环节。传统观点认为，动脉粥样硬化是由于脂质在血管壁内沉积，逐渐形成粥样斑块，导致血管狭窄和阻塞。然而，近年来的研究表明，炎症反应在动脉粥样硬化的发生发展中起着关键作用。越来越多的证据显示，动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，炎症细胞和炎症介质参与了动脉粥样硬化的各个阶段，从早期的脂质条纹形成到晚期的斑块破裂和血栓形成。Toll样受体4（Toll-likereceptor4，TLR4）作为Toll样受体家族中的重要成员，在天然免疫和炎症反应中发挥着核心作用。TLR4能够识别病原体相关分子模式（Pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs），如细菌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）等，以及内源性危险信号分子，如热休克蛋白、高迁移率族蛋白B1等。当TLR4被激活后，会启动一系列的信号转导通路，导致核因子κB（Nuclearfactor-κB，NF-κB）等转录因子的活化，进而诱导多种炎性细胞因子、趋化因子和黏附分子的表达，引发炎症反应。研究发现，TLR4不仅在免疫细胞中高表达，在血管内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞等动脉粥样硬化相关细胞中也有表达。在动脉粥样硬化的发生发展过程中，TLR4通过识别内、外源性配体，激活炎症信号通路，促进炎症细胞的浸润和活化，加速脂质沉积和斑块形成，同时还可能影响斑块的稳定性，增加斑块破裂和血栓形成的风险。因此，深入研究TLR4与动脉粥样硬化之间的关系，对于揭示动脉粥样硬化的发病机制、寻找新的治疗靶点具有重要意义。目前，虽然已经有大量关于TLR4与动脉粥样硬化的研究，但仍存在许多未解之谜，如TLR4在动脉粥样硬化不同阶段的具体作用机制、TLR4信号通路的精细调控等。进一步探索TLR4与动脉粥样硬化的关系，有望为动脉粥样硬化的防治提供新的策略和方法。1.2研究目的与意义本研究旨在深入揭示Toll样受体4与动脉粥样硬化之间的内在联系，全面剖析TLR4在动脉粥样硬化发生、发展及转归过程中的具体作用机制。通过细胞实验和动物模型，观察TLR4激活或抑制后，动脉粥样硬化相关细胞的生物学行为变化，如巨噬细胞的炎症反应、泡沫细胞的形成，血管平滑肌细胞的增殖与迁移等。同时，探究TLR4信号通路中关键分子的调控机制，明确其上下游信号分子的相互作用关系。动脉粥样硬化严重威胁人类健康，当前治疗手段存在一定局限性，深入研究其发病机制以寻找新的治疗靶点至关重要。本研究具有重要意义，在理论层面，有望补充和完善动脉粥样硬化的发病机制理论。传统的动脉粥样硬化发病机制主要集中在脂质代谢异常等方面，对炎症免疫机制的研究相对较少。本研究深入探讨TLR4与动脉粥样硬化的关系，有助于从炎症免疫角度更全面地理解动脉粥样硬化的发病过程，为后续研究提供新的理论依据。在临床应用方面，若能明确TLR4在动脉粥样硬化中的关键作用及机制，将为动脉粥样硬化的防治提供新的靶点和策略。可以研发针对TLR4或其信号通路关键分子的药物，阻断炎症信号传导，从而抑制动脉粥样硬化的发展。同时，还能为动脉粥样硬化的早期诊断和病情评估提供新的生物标志物，通过检测TLR4及其相关分子的表达水平，更准确地预测疾病的发生风险和进展情况，实现早期干预和精准治疗。1.3国内外研究现状在国外，对于Toll样受体4与动脉粥样硬化关系的研究起步较早且成果丰硕。早在2002年，Edfeldt等学者通过研究发现，TLR4在人类动脉粥样硬化病变中呈现表达状态，这一发现为后续探究TLR4在动脉粥样硬化中的作用奠定了基础。此后，诸多研究从不同角度深入剖析两者关联。Tobias和Curtiss指出，TLR4在动脉粥样硬化发生发展过程中，对病原体保护的同时也付出了代价，其在炎症反应与动脉粥样硬化进程中扮演着关键角色。Pasterkamp等人的研究表明，TLR4参与了动脉粥样硬化疾病的起始与发展进程。在细胞和动物实验方面，有研究利用基因敲除技术构建TLR4基因敲除小鼠，以此探究TLR4缺失对动脉粥样硬化发展的影响。结果显示，TLR4基因敲除小鼠在高脂饮食诱导下，动脉粥样硬化斑块形成明显减少，炎症细胞浸润程度降低，炎性细胞因子表达水平显著下降。这一系列研究充分表明，TLR4在动脉粥样硬化发生发展中起着促进作用，其激活会导致炎症反应加剧，加速斑块形成。国内学者也在积极开展相关研究，并取得了一系列重要成果。宫玉玲等人通过免疫组织化学方法，对行冠状动脉旁路移植术患者的主动脉壁全层组织以及肾移植供体者的动脉壁全层组织进行检测。研究发现，TLR4在冠状动脉粥样硬化患者的动脉壁全层组织中有明显表达，而在对照组中无表达。进一步分析发现，TLR4表达与高血压、高血糖、低密度脂蛋白胆固醇升高、高密度脂蛋白胆固醇降低等动脉粥样硬化危险因素密切相关。这表明TLR4可能是动脉粥样硬化的始动因素之一，这些危险因素通过TLR4信号途径促进动脉粥样硬化的发生发展。杨波等人探讨了TLR4/NF-κB信号通路在溶血磷脂酸致动脉粥样硬化中的作用。研究结果显示，溶血磷脂酸可显著上调人单核细胞株THP-1细胞中TLR4表达，并促进NF-κB的活化，提示溶血磷脂酸致动脉粥样硬化作用可能部分是由TLR4/NF-κB信号途径介导的。尽管国内外在TLR4与动脉粥样硬化关系的研究上已取得诸多成果，但仍存在一些不足之处。在研究内容方面，虽然已知TLR4参与动脉粥样硬化过程，但对于TLR4在动脉粥样硬化不同阶段的具体作用机制尚未完全明确。例如，在动脉粥样硬化早期，TLR4如何精准识别内源性危险信号分子，启动炎症反应，进而促使脂质条纹形成；在斑块进展期，TLR4对血管平滑肌细胞增殖、迁移以及细胞外基质合成与降解的调控机制还需深入研究。在研究方法上，目前多采用细胞实验和动物模型，与人体实际情况存在一定差异。如何将基础研究成果更好地转化到临床应用，实现从实验室到临床的跨越，是亟待解决的问题。在信号通路研究方面，TLR4信号通路复杂，涉及多个上下游信号分子和多条信号转导途径，它们之间的相互作用和精细调控机制尚未完全阐明。此外，针对TLR4开发的治疗药物在临床试验中效果仍有待进一步提升，如何优化药物设计，提高药物疗效和安全性，也是未来研究的重要方向。二、Toll样受体4与动脉粥样硬化的相关理论基础2.1Toll样受体4概述Toll样受体4（TLR4）作为Toll样受体家族的重要成员，在免疫系统中扮演着关键角色，其发现历程充满了探索与突破。1980年，Nusslein-Volhard等在研究果蝇胚胎发育时，发现了Toll基因，该基因决定着果蝇的背腹侧分化。1988年，Hashimoto等人阐明了Toll基因编码的是一种跨膜蛋白质，揭示了Toll蛋白的结构。1991年，Gay等人发现Toll蛋白在结构上与哺乳动物中白细胞介素1受体（IL-1R）的细胞质部分具有同源性，首次暗示了Toll与免疫的关联。1996年，JulesA.Hoffmann和他的同事们发现Toll在果蝇对真菌感染的免疫中起着重要作用，确立了Toll的免疫学意义。1997年，CharlesJaneway和RuslanMedzhitov鉴定和克隆了人的一种果蝇Toll同源体，将其命名为Toll样受体4（TLR4），自此开启了对TLR4深入研究的新篇章。从结构特征来看，TLR4属于I型跨膜蛋白，由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成。胞外区富含亮氨酸重复序列（LRR），这些LRR序列呈马蹄状结构域，其中包含2段保守模块以及1个配体结合区域（LBR）。这种独特的结构使得胞外区能够直接识别病原体相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs）。由于配体结合区域在进化过程中具有较大的变异性，这赋予了TLR4识别不同配体分子的能力，使其可以感知多种外来病原体和内源性危险信号。跨膜区由21个主要为半胱氨酸的氨基酸螺旋连接而成，它如同一个桥梁，将胞外区与胞内区连接起来，并且有助于TLR4在细胞膜上的精准定位，确保其能够在合适的位置接收和传递信号。胞内区则是由大约200个氨基酸残基组成的高度保守的Toll/白细胞介素-1受体（TIR）结构域，该结构域是TLR4信号通路活化和传导的关键环节。当TLR4识别配体后，TIR结构域会特异性募集接头分子髓样分化因子88（MyD88）和β干扰素TIR结构域衔接蛋白（TRIF）。TIR结构域与接头分子的TIR结构域发生二聚化，这一过程是活化后TLR4向下游进行信号传递的起始步骤，如同信号传导的“开关”，一旦开启，便会引发一系列的信号级联反应。在免疫系统中，TLR4发挥着核心作用，是连接固有免疫和获得性免疫的重要桥梁。固有免疫是机体抵御病原体入侵的第一道防线，具有快速响应的特点，但识别病原体的特异性相对有限。而获得性免疫则具有高度特异性和记忆性，能够针对特定病原体产生精准的免疫应答。TLR4在这两种免疫之间起到了关键的衔接作用。当病原体入侵机体时，TLR4能够识别病原体表面的PAMPs，如细菌脂多糖（LPS）、病毒双链RNA等，以及机体自身细胞在应激或损伤时释放的DAMPs，如热休克蛋白、高迁移率族蛋白B1等。一旦TLR4识别到这些配体，便会启动一系列复杂的信号转导通路。其中主要包括MyD88依赖性和非依赖性两条信号通路。在MyD88依赖性通路中，TLR4与配体结合后，其胞内的TIR结构域与MyD88结合，MyD88再招募白细胞介素1受体相关激酶（IRAK）家族成员，使IRAK发生磷酸化。磷酸化的IRAK激活肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6），进而激活核因子κB（NF-κB）抑制物的激酶（IKKs）复合物。IKKs复合物使IkB磷酸化，磷酸化的IkB发生泛素化而降解，最终导致NF-κB的活化。活化的NF-κB进入细胞核，诱导一系列炎性细胞因子、趋化因子和黏附分子的基因转录和表达，如白细胞介素1（IL-1）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等。这些炎性介质能够招募和激活免疫细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞、T细胞和B细胞等，引发炎症反应，从而清除病原体。在TRIF依赖性通路中，TLR4与配体结合后，通过TRIF激活TANK结合激酶1（TBK1）和干扰素调节因子3（IRF3），诱导干扰素（IFN）的产生。IFN具有抗病毒、调节免疫细胞功能等作用，进一步增强机体的免疫防御能力。此外，TRIF还能通过激活NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等通路，促进炎症因子的产生。通过这两条信号通路，TLR4不仅能够迅速启动固有免疫应答，对病原体进行初步的防御，还能为获得性免疫应答的启动提供必要的信号和条件。它能够激活树突状细胞等抗原呈递细胞，使其成熟并更好地呈递抗原给T细胞，从而启动获得性免疫应答。在这个过程中，TLR4就像是免疫系统的“预警雷达”，及时发现病原体和危险信号，并通过复杂的信号传导网络，调动机体的免疫细胞和免疫分子，共同抵御病原体的入侵，维护机体的免疫平衡和健康。2.2动脉粥样硬化概述动脉粥样硬化是一种严重危害人类健康的慢性进行性心血管疾病，其定义为动脉管壁增厚变硬、失去弹性和管腔缩小，主要特征是动脉内膜下脂质沉积，形成粥样斑块。这些斑块由胆固醇、甘油三酯、磷脂、载脂蛋白以及炎性细胞等组成，外观呈黄色粥样，故而得名。动脉粥样硬化的发生发展是一个复杂的病理过程，涉及多个阶段和多种细胞的参与。从病理特征来看，动脉粥样硬化的早期病变表现为脂纹，主要由内皮下大量脂质和泡沫细胞聚集而成。泡沫细胞是由巨噬细胞吞噬氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）后形成的，它们的出现标志着动脉粥样硬化的起始。随着病变的进展，脂纹逐渐发展为纤维斑块，纤维斑块由脂质核心、纤维帽和周边的平滑肌细胞、炎性细胞等组成。纤维帽主要由平滑肌细胞分泌的胶原蛋白、弹性蛋白等细胞外基质构成，起到稳定斑块的作用。然而，在某些因素的作用下，纤维帽可能会变薄、破裂，导致脂质核心暴露，引发血小板聚集和血栓形成，形成粥样溃疡和血栓，这是动脉粥样硬化的晚期病变，也是导致急性心血管事件如心肌梗死、脑卒中等发生的主要原因。动脉粥样硬化的发病机制十分复杂，目前尚未完全明确，但普遍认为是多种因素共同作用的结果。炎症反应在动脉粥样硬化的发生发展中起着核心作用。当血管内皮细胞受到各种危险因素的刺激，如高血脂、高血压、高血糖、吸烟、感染等，会发生功能障碍，表现为内皮细胞的通透性增加、黏附分子表达上调、炎性细胞因子释放等。这些变化使得血液中的单核细胞、低密度脂蛋白（LDL）等成分更容易进入血管内膜下。单核细胞进入内膜下后分化为巨噬细胞，巨噬细胞通过表面的清道夫受体大量摄取ox-LDL，逐渐转化为泡沫细胞。泡沫细胞的堆积形成脂纹，启动了动脉粥样硬化的进程。同时，巨噬细胞和内皮细胞释放的炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1（IL-1）、白细胞介素6（IL-6）等，会进一步招募和激活更多的炎性细胞，如T淋巴细胞、中性粒细胞等，形成慢性炎症微环境。在这个微环境中，炎性细胞分泌的多种蛋白酶，如基质金属蛋白酶（MMPs）等，会降解细胞外基质，导致纤维帽变薄，斑块稳定性下降。脂质代谢紊乱也是动脉粥样硬化发生的重要因素。血液中LDL水平升高，尤其是ox-LDL的增加，是动脉粥样硬化的主要危险因素之一。ox-LDL具有很强的细胞毒性，能够损伤血管内皮细胞，促进炎症反应，同时也是泡沫细胞形成的关键物质。高密度脂蛋白（HDL）则具有抗动脉粥样硬化的作用，它可以通过逆向转运胆固醇，将动脉壁中的胆固醇转运回肝脏进行代谢，从而减少脂质在血管壁的沉积。此外，HDL还具有抗氧化、抗炎、抗血栓等多种功能，能够抑制动脉粥样硬化的发展。氧化应激在动脉粥样硬化的发生发展中也扮演着重要角色。当机体处于氧化应激状态时，体内产生过多的活性氧（ROS），如超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等。这些ROS会氧化修饰LDL，形成ox-LDL，同时还会损伤血管内皮细胞、促进炎性细胞因子的释放、激活细胞内的信号转导通路，从而加速动脉粥样硬化的进程。血管平滑肌细胞的增殖和迁移在动脉粥样硬化的发展过程中也起着重要作用。在炎症因子和生长因子的刺激下，血管平滑肌细胞从收缩型转变为合成型，具有更强的增殖和迁移能力。它们迁移到内膜下，分泌大量的细胞外基质，参与纤维斑块的形成。同时，平滑肌细胞的增殖还会导致血管壁增厚，管腔狭窄，进一步加重血流动力学异常。动脉粥样硬化的主要危险因素包括高血脂、高血压、糖尿病、吸烟、肥胖、遗传因素等。高血脂，尤其是高胆固醇血症和高甘油三酯血症，以及低HDL血症，与动脉粥样硬化的发生密切相关。高血压会增加血管壁的压力，损伤血管内皮细胞，促进脂质沉积和炎症反应。糖尿病患者常伴有糖代谢紊乱和脂代谢异常，高血糖会导致蛋白质糖基化，产生糖基化终末产物（AGEs），AGEs具有很强的氧化应激作用，能够损伤血管内皮细胞，促进动脉粥样硬化的发生。吸烟中的尼古丁、焦油等有害物质会损伤血管内皮细胞，降低HDL水平，增加血液黏稠度，促进血栓形成。肥胖患者往往伴有胰岛素抵抗、高血脂、高血压等代谢紊乱，这些因素都会增加动脉粥样硬化的发病风险。遗传因素在动脉粥样硬化的发生中也起着重要作用，某些基因突变会导致脂质代谢异常、炎症反应增强等，使个体更容易患动脉粥样硬化。2.3Toll样受体4与动脉粥样硬化的关联Toll样受体4与动脉粥样硬化之间存在着紧密且复杂的关联，这种关联主要体现在炎症反应、免疫调节以及对血管细胞功能的影响等多个关键方面。炎症反应是TLR4与动脉粥样硬化关联的核心纽带。在动脉粥样硬化的起始阶段，血管内皮细胞由于受到诸如高血脂、高血压、高血糖、吸烟、感染等多种危险因素的刺激，其正常功能会遭到破坏，表现为细胞间连接松散、通透性增加，同时分泌一系列炎性细胞因子和趋化因子，如白细胞介素6（IL-6）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）等。这些变化使得血管内皮细胞表面的TLR4表达上调，并且增强了其对配体的敏感性。当TLR4识别到病原体相关分子模式（PAMPs），如细菌脂多糖（LPS），或者损伤相关分子模式（DAMPs），如氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）、热休克蛋白（HSPs）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）等内源性危险信号分子时，便会迅速启动信号转导通路。在MyD88依赖性信号通路中，TLR4与配体结合后，其胞内的TIR结构域会与髓样分化因子88（MyD88）结合。MyD88再招募白细胞介素1受体相关激酶（IRAK）家族成员，包括IRAK1、IRAK2和IRAK4，使它们发生磷酸化。磷酸化的IRAK激活肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6），TRAF6进一步激活核因子κB（NF-κB）抑制物的激酶（IKKs）复合物。IKKs复合物使抑制蛋白IkB磷酸化，磷酸化的IkB随即发生泛素化并被降解，从而解除了对NF-κB的抑制，使其得以活化并进入细胞核。在细胞核内，NF-κB与特定的DNA序列结合，启动一系列炎性细胞因子、趋化因子和黏附分子的基因转录和表达，如白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、细胞间黏附分子1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子1（VCAM-1）等。这些炎性介质会吸引血液中的单核细胞、淋巴细胞等炎性细胞向血管内膜下迁移和聚集。单核细胞进入内膜下后，会分化为巨噬细胞，巨噬细胞通过表面的清道夫受体大量摄取ox-LDL，逐渐转化为泡沫细胞，泡沫细胞的大量堆积形成脂纹，标志着动脉粥样硬化的起始。同时，TNF-α、IL-1β等炎性细胞因子还会进一步激活内皮细胞、巨噬细胞和血管平滑肌细胞，促使它们分泌更多的炎性介质，形成炎症的级联放大反应。在TRIF依赖性信号通路中，TLR4与配体结合后，通过β干扰素TIR结构域衔接蛋白（TRIF）激活TANK结合激酶1（TBK1）和干扰素调节因子3（IRF3），诱导干扰素（IFN）的产生。IFN具有抗病毒、调节免疫细胞功能等作用，但同时也会促进炎症反应的发生。此外，TRIF还能通过激活NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等通路，进一步促进炎症因子的产生，加剧炎症反应。免疫调节方面，TLR4在动脉粥样硬化进程中对固有免疫和适应性免疫均有着重要的调节作用。在固有免疫中，TLR4激活后，巨噬细胞和树突状细胞等抗原呈递细胞被活化，它们不仅会分泌大量炎性细胞因子，还会表达更多的共刺激分子，如CD80、CD86等。这些共刺激分子与T细胞表面的相应受体结合，为T细胞的活化提供第二信号，从而促进T细胞的增殖和分化。活化的T细胞进一步释放细胞因子，如干扰素γ（IFN-γ）、白细胞介素2（IL-2）等，这些细胞因子会增强巨噬细胞的吞噬能力和杀伤活性，同时也会促进其他免疫细胞的活化和募集，进一步加剧炎症反应。在适应性免疫中，TLR4通过调节树突状细胞的功能，影响T细胞和B细胞的活化和分化。树突状细胞摄取抗原后，在TLR4信号的作用下，会成熟并迁移到淋巴结，将抗原呈递给T细胞。不同类型的T细胞在TLR4信号的影响下，会分化为不同的亚群，如Th1、Th2、Th17和Treg等。Th1细胞主要分泌IFN-γ等细胞因子，参与细胞免疫应答，促进炎症反应；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5等细胞因子，参与体液免疫应答，在一定程度上抑制炎症反应；Th17细胞主要分泌IL-17等细胞因子，具有很强的促炎作用；Treg细胞则通过分泌抑制性细胞因子，如IL-10、转化生长因子β（TGF-β）等，抑制免疫细胞的活化和炎症反应。在动脉粥样硬化中，TLR4的激活会打破这些T细胞亚群之间的平衡，导致Th1和Th17细胞的比例增加，Treg细胞的比例减少，从而促进炎症反应和动脉粥样硬化的发展。对血管细胞功能的影响也是TLR4与动脉粥样硬化关联的重要体现。在血管内皮细胞中，TLR4激活后会导致内皮细胞功能障碍，表现为一氧化氮（NO）释放减少，内皮素1（ET-1）释放增加。NO是一种重要的血管舒张因子，其释放减少会导致血管收缩，血流阻力增加；ET-1是一种强效的血管收缩因子，其释放增加会进一步加剧血管收缩。此外，TLR4激活还会使内皮细胞表面的黏附分子表达增加，促进炎性细胞的黏附和迁移，同时也会增加内皮细胞对ox-LDL的摄取，加速脂质沉积。在血管平滑肌细胞中，TLR4激活会促使平滑肌细胞从收缩型转变为合成型。合成型平滑肌细胞具有更强的增殖和迁移能力，它们会迁移到内膜下，分泌大量的细胞外基质，如胶原蛋白、弹性蛋白等，参与纤维斑块的形成。同时，平滑肌细胞的增殖还会导致血管壁增厚，管腔狭窄，进一步加重血流动力学异常。此外，TLR4激活还会影响平滑肌细胞的收缩功能，使其对血管收缩物质的反应性增强，导致血管痉挛。在巨噬细胞中，TLR4激活会促进巨噬细胞对ox-LDL的摄取和泡沫细胞的形成。同时，巨噬细胞会分泌更多的炎性细胞因子和基质金属蛋白酶（MMPs）。MMPs能够降解细胞外基质，导致纤维帽变薄，斑块稳定性下降，增加斑块破裂和血栓形成的风险。三、Toll样受体4与动脉粥样硬化关系的研究方法3.1实验动物模型的建立3.1.1动脉粥样硬化动物模型小鼠是常用的实验动物，其繁殖周期短、饲养成本低，且基因编辑技术成熟，便于构建各种基因修饰模型。在构建小鼠动脉粥样硬化模型时，载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠和低密度脂蛋白受体基因敲除（Ldlr-/-）小鼠是常用的品系。ApoE在脂蛋白代谢中起着关键作用，ApoE-/-小鼠缺乏ApoE，导致血浆中胆固醇和甘油三酯水平显著升高。在正常饮食条件下，ApoE-/-小鼠就会逐渐出现动脉粥样硬化病变，随着年龄的增长，病变会不断进展。通常在8周龄左右，ApoE-/-小鼠主动脉根部开始出现脂质条纹，16周龄时，动脉粥样硬化病变较为明显，表现为内膜下脂质沉积、泡沫细胞形成。Ldlr负责介导低密度脂蛋白（LDL）的摄取和代谢，Ldlr-/-小鼠由于Ldlr基因缺失，无法有效清除血液中的LDL，使得血浆LDL水平升高。给予Ldlr-/-小鼠高脂饮食，能加速动脉粥样硬化的发展。一般在高脂饮食4-8周后，Ldlr-/-小鼠主动脉弓和冠状动脉等部位会出现明显的粥样斑块。兔子也是构建动脉粥样硬化模型的常用动物，其优点是体型较大，便于进行各种操作和检测。以新西兰大白兔为例，高脂饮食法是常用的建模方法之一。给予兔子高脂饲料，饲料中通常含有高胆固醇（1%-2%）、高脂肪（5%-10%）等成分。在高脂饮食喂养12-16周后，兔子主动脉和冠状动脉等部位会出现明显的动脉粥样硬化病变。内膜损伤结合高脂饮食法能更快速地诱导动脉粥样硬化模型的形成。在高脂饮食的基础上，通过手术对兔子的腹主动脉或颈动脉内膜进行损伤，如使用球囊导管损伤内膜。这种方法可使兔子在8-12周内就形成较为稳定的动脉粥样硬化斑块，斑块内含有大量的脂质、泡沫细胞和炎性细胞，纤维帽较薄，更接近人类动脉粥样硬化斑块的特征。3.1.2Toll样受体4相关基因编辑动物模型对于Toll样受体4基因敲除小鼠，利用基因编辑技术，如CRISPR/Cas9系统，在小鼠胚胎干细胞中对Tlr4基因进行敲除。将经过基因编辑的胚胎干细胞注射到小鼠囊胚中，再将囊胚移植到假孕母鼠的子宫内，使其发育成嵌合体小鼠。通过后续的繁育和筛选，获得纯合的Tlr4基因敲除小鼠。Tlr4基因敲除小鼠缺失功能性的TLR4蛋白，在研究TLR4在动脉粥样硬化中的作用机制时，可将其与ApoE-/-或Ldlr-/-小鼠进行杂交。杂交后代小鼠同时具备动脉粥样硬化易感性和TLR4缺失的特点，通过观察这些小鼠在高脂饮食或其他刺激条件下动脉粥样硬化的发展情况，与正常对照小鼠进行对比。若杂交后代小鼠的动脉粥样硬化病变明显减轻，如斑块面积减小、炎症细胞浸润减少、炎性细胞因子表达降低等，可表明TLR4在动脉粥样硬化的发生发展中起促进作用。Toll样受体4过表达小鼠模型的构建可采用转基因技术。将编码TLR4的基因与特定的启动子连接，构建表达载体。例如，使用巨细胞病毒（CMV）启动子或肝脏特异性启动子，将表达载体通过显微注射的方法导入小鼠受精卵的雄原核中。将注射后的受精卵移植到假孕母鼠的子宫内，使其发育成转基因小鼠。对转基因小鼠进行鉴定，筛选出TLR4过表达的小鼠品系。在研究中，将TLR4过表达小鼠与正常小鼠同时给予高脂饮食或其他动脉粥样硬化诱导因素。若TLR4过表达小鼠的动脉粥样硬化病变加重，如斑块面积增大、纤维帽变薄、炎症反应增强等，可进一步证实TLR4在动脉粥样硬化中的促炎作用。3.2细胞实验方法3.2.1细胞培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的培养：从新鲜的脐带中分离出脐静脉内皮细胞，将其接种于含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素双抗的M199培养基中。将培养瓶置于37℃、5%CO₂的恒温培养箱中培养，待细胞生长至80%-90%融合时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液进行消化传代。传代时，轻轻吸去旧培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞2-3次，加入适量消化液，在显微镜下观察，当细胞变圆、脱离瓶壁时，立即加入含血清的培养基终止消化。然后将细胞悬液转移至离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，加入新鲜培养基重悬细胞，按照1:2或1:3的比例接种到新的培养瓶中继续培养。小鼠巨噬细胞RAW264.7的培养：将RAW264.7细胞复苏后，接种于含10%FBS、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM高糖培养基中。同样置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，细胞长满后进行传代。传代方法与HUVECs类似，先吸去旧培养基，PBS冲洗，加入消化液消化，待细胞脱离瓶壁后，加入含血清培养基终止消化，离心收集细胞，重悬后接种到新培养瓶。在培养过程中，定期观察细胞形态和生长状态，确保细胞处于良好的生长环境。3.2.2细胞刺激对于HUVECs，当细胞生长至对数生长期时，进行刺激实验。实验组加入终浓度为100ng/mL的脂多糖（LPS），以模拟病原体感染，刺激时间设定为6h、12h和24h。同时设置对照组，加入等体积的无菌PBS缓冲液。在刺激过程中，每隔一定时间观察细胞形态变化，如细胞是否出现肿胀、变形，细胞间连接是否改变等。对于RAW264.7细胞，将细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后，实验组加入终浓度为50μg/mL的氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），刺激时间为12h、24h和48h。对照组加入等体积的无血清DMEM培养基。在刺激不同时间点，收集细胞及培养上清液，用于后续检测。3.2.3检测指标及方法采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测细胞培养上清液中炎性细胞因子的水平。如检测白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β）等。按照ELISA试剂盒说明书进行操作，首先将捕获抗体包被在酶标板上，4℃过夜。次日，弃去包被液，用洗涤缓冲液洗涤3-5次。然后加入封闭液，37℃孵育1-2h，以减少非特异性结合。弃去封闭液，加入不同稀释度的标准品和待测样品，37℃孵育1-2h。再次洗涤后，加入生物素化的检测抗体，37℃孵育1h。洗涤后，加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）结合物，37℃孵育30min。最后加入底物溶液，室温避光反应15-30min，加入终止液终止反应。用酶标仪在450nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线计算样品中炎性细胞因子的浓度。利用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测细胞中相关基因的表达水平。提取细胞总RNA，使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，进行qPCR反应。反应体系包括SYBRGreenMasterMix、上下游引物和cDNA模板。引物设计根据目的基因序列，如TLR4、MyD88、NF-κB等基因。反应条件一般为95℃预变性30s，然后95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因，采用2⁻ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。采用蛋白质免疫印迹（Westernblot）检测细胞中相关蛋白的表达。收集细胞，加入RIPA裂解液裂解细胞，提取总蛋白。用BCA法测定蛋白浓度，然后将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸变性5min。将变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1-2h，以阻断非特异性结合。封闭后，加入一抗，如抗TLR4抗体、抗MyD88抗体、抗NF-κBp65抗体等，4℃孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3-5次，每次10min。然后加入相应的二抗，室温孵育1-2h。再次洗涤后，加入化学发光底物，在化学发光成像系统下曝光显影，分析蛋白条带的灰度值，以β-actin作为内参，计算目的蛋白的相对表达量。3.3临床研究方法临床研究选取某三甲医院心内科收治的患者作为研究对象。纳入标准为：经冠状动脉造影或血管超声确诊为动脉粥样硬化患者，年龄在40-75岁之间；签署知情同意书，自愿参与本研究。排除标准为：近期（3个月内）有急性感染、创伤、手术史；患有恶性肿瘤、自身免疫性疾病、严重肝肾功能不全等影响研究结果的疾病；正在使用免疫抑制剂、抗炎药物或其他可能影响TLR4表达及动脉粥样硬化进程的药物。最终纳入动脉粥样硬化患者100例，同时选取50例年龄、性别匹配的健康体检者作为对照组。在样本采集方面，所有研究对象均于清晨空腹状态下采集外周静脉血5ml。将采集的血液注入含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝剂的采血管中，轻轻颠倒混匀，防止血液凝固。采集的血样在2小时内进行处理，以3000r/min的转速离心15分钟，分离出血浆，将血浆转移至无菌冻存管中，标记后置于-80℃冰箱中保存，待后续检测。对于动脉粥样硬化患者，若有机会进行血管介入治疗或手术切除病变血管组织，在取得患者同意后，采集少量动脉粥样硬化斑块组织。将采集的斑块组织迅速放入预冷的生理盐水中冲洗，去除表面的血液和杂质，然后将其切成小块，一部分放入10%中性甲醛溶液中固定，用于病理切片和免疫组织化学检测；另一部分置于液氮中速冻，随后转移至-80℃冰箱保存，用于蛋白质和核酸提取。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血浆中TLR4、炎性细胞因子（如白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β））以及脂质相关指标（如总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C））的水平。操作过程严格按照ELISA试剂盒说明书进行，在酶标仪上测定各样本的吸光度值，根据标准曲线计算出相应指标的浓度。运用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测动脉粥样硬化斑块组织中TLR4及相关炎症基因（如MyD88、NF-κB等）的mRNA表达水平。提取组织总RNA，逆转录为cDNA后进行qPCR反应，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因，采用2⁻ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。利用免疫组织化学法检测动脉粥样硬化斑块组织中TLR4蛋白的表达和定位。将固定好的斑块组织制成石蜡切片，依次进行脱蜡、水化、抗原修复、封闭等步骤，然后加入抗TLR4抗体孵育，再加入相应的二抗和显色剂进行显色，最后在显微镜下观察并拍照，分析TLR4蛋白的表达强度和分布情况。对于数据统计分析，使用SPSS22.0统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），若组间差异有统计学意义，进一步进行两两比较（LSD法）。计数资料以例数和百分比表示，组间比较采用χ²检验。采用Pearson相关分析或Spearman相关分析探讨TLR4表达与动脉粥样硬化相关指标之间的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。四、Toll样受体4在动脉粥样硬化发生发展中的作用机制4.1Toll样受体4的信号传导通路Toll样受体4（TLR4）的信号传导通路主要包括MyD88依赖性和非依赖性两条通路，它们在动脉粥样硬化的发生发展过程中发挥着关键作用，通过一系列复杂的分子相互作用，调控炎症反应、细胞增殖与迁移等生物学过程。MyD88依赖性信号通路是TLR4信号传导的经典途径。当TLR4识别病原体相关分子模式（PAMPs）如细菌脂多糖（LPS），或损伤相关分子模式（DAMPs）如氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）、热休克蛋白（HSPs）等配体后，其胞内的Toll/白细胞介素-1受体（TIR）结构域会与髓样分化因子88（MyD88）结合。MyD88分子含有死亡结构域（DD）和TIR结构域，其TIR结构域与TLR4的TIR结构域相互作用，而死亡结构域则负责招募白细胞介素1受体相关激酶（IRAK）家族成员。IRAK家族包括IRAK1、IRAK2、IRAK4和IRAK-M，其中IRAK4在信号传导的起始阶段起着关键作用。MyD88与IRAK4结合后，促使IRAK4发生自身磷酸化，激活的IRAK4进一步磷酸化IRAK1和IRAK2。磷酸化的IRAK1和IRAK2从MyD88复合物中解离出来，与肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）相互作用。TRAF6是一种E3泛素连接酶，它能催化自身发生K63连接的多聚泛素化修饰。泛素化的TRAF6招募并激活转化生长因子β激活激酶1（TAK1）及其结合蛋白TAB1和TAB2。TAK1是丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAP3K）家族的成员，被激活后，它可以通过两条主要途径进一步传递信号。一方面，TAK1激活核因子κB（NF-κB）抑制物的激酶（IKKs）复合物，该复合物由IKKα、IKKβ和调节亚基IKKγ（也称为NEMO）组成。IKKβ磷酸化抑制蛋白IkB，使其发生泛素化修饰，进而被蛋白酶体降解。IkB的降解使得NF-κB得以释放，NF-κB由p50和p65亚基组成，活化后转位进入细胞核，与特定的DNA序列结合，启动一系列炎性细胞因子、趋化因子和黏附分子的基因转录和表达，如白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、细胞间黏附分子1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子1（VCAM-1）等。这些炎性介质的释放吸引血液中的单核细胞、淋巴细胞等炎性细胞向血管内膜下迁移和聚集，引发炎症反应，促进动脉粥样硬化的发展。另一方面，TAK1激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，包括细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK。激活的MAPK进一步磷酸化下游的转录因子，如激活蛋白1（AP-1）等，调节细胞的增殖、分化、凋亡和炎症反应等过程，在动脉粥样硬化中，MAPK的激活可促进血管平滑肌细胞的增殖和迁移，参与纤维斑块的形成。MyD88非依赖性信号通路（也称为TRIF依赖性信号通路）在TLR4信号传导中也起着重要作用。在这条通路中，TLR4与配体结合后，通过TIR结构域招募含有TIR结构域的接头分子β干扰素TIR结构域衔接蛋白（TRIF）。TRIF分子含有TIR结构域和一个RIP同源相互作用基序（RHIM）。TRIF通过其RHIM结构域与受体相互作用蛋白1（RIP1）和RIP3相互作用，形成一个信号复合物。RIP1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它在TRIF依赖性信号通路中起着关键的调节作用。RIP1的激酶活性对于激活下游信号分子至关重要。TRIF还可以通过TANK结合激酶1（TBK1）和干扰素调节因子3（IRF3）途径发挥作用。TBK1被TRIF招募并激活，激活的TBK1磷酸化IRF3。IRF3是一种转录因子，磷酸化后发生二聚化并转位进入细胞核，与特定的DNA序列结合，诱导干扰素（IFN）相关基因的表达，如IFN-β等。IFN具有抗病毒、调节免疫细胞功能等作用，但在动脉粥样硬化中，IFN的产生也会促进炎症反应。此外，TRIF还能通过激活NF-κB和MAPK等通路，促进炎症因子的产生。在NF-κB激活过程中，TRIF可能通过与TRAF6等分子相互作用，间接激活IKKs复合物，从而导致NF-κB的活化。在MAPK激活方面，TRIF可能通过激活其他MAP3K家族成员，如ASK1等，进而激活JNK和p38MAPK，促进炎症因子的表达。MyD88非依赖性信号通路在动脉粥样硬化中的作用主要体现在调节抗病毒免疫反应、促进炎症反应以及影响细胞的存活和凋亡等方面。在动脉粥样硬化的发生发展过程中，病毒感染或内源性危险信号可能通过激活TRIF依赖性信号通路，导致炎症反应的加剧和斑块的不稳定。4.2Toll样受体4对炎症反应的调控在动脉粥样硬化的起始阶段，血管内皮细胞由于受到诸如高血脂、高血压、高血糖、吸烟、感染等多种危险因素的刺激，其正常功能会遭到破坏，表现为细胞间连接松散、通透性增加，同时分泌一系列炎性细胞因子和趋化因子，如白细胞介素6（IL-6）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）等。这些变化使得血管内皮细胞表面的TLR4表达上调，并且增强了其对配体的敏感性。当TLR4识别到病原体相关分子模式（PAMPs），如细菌脂多糖（LPS），或者损伤相关分子模式（DAMPs），如氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）、热休克蛋白（HSPs）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）等内源性危险信号分子时，便会迅速启动信号转导通路。在MyD88依赖性信号通路中，TLR4与配体结合后，其胞内的TIR结构域会与髓样分化因子88（MyD88）结合。MyD88分子含有死亡结构域（DD）和TIR结构域，其TIR结构域与TLR4的TIR结构域相互作用，而死亡结构域则负责招募白细胞介素1受体相关激酶（IRAK）家族成员。IRAK家族包括IRAK1、IRAK2、IRAK4和IRAK-M，其中IRAK4在信号传导的起始阶段起着关键作用。MyD88与IRAK4结合后，促使IRAK4发生自身磷酸化，激活的IRAK4进一步磷酸化IRAK1和IRAK2。磷酸化的IRAK1和IRAK2从MyD88复合物中解离出来，与肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）相互作用。TRAF6是一种E3泛素连接酶，它能催化自身发生K63连接的多聚泛素化修饰。泛素化的TRAF6招募并激活转化生长因子β激活激酶1（TAK1）及其结合蛋白TAB1和TAB2。TAK1是丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAP3K）家族的成员，被激活后，它可以通过两条主要途径进一步传递信号。一方面，TAK1激活核因子κB（NF-κB）抑制物的激酶（IKKs）复合物，该复合物由IKKα、IKKβ和调节亚基IKKγ（也称为NEMO）组成。IKKβ磷酸化抑制蛋白IkB，使其发生泛素化修饰，进而被蛋白酶体降解。IkB的降解使得NF-κB得以释放，NF-κB由p50和p65亚基组成，活化后转位进入细胞核，与特定的DNA序列结合，启动一系列炎性细胞因子、趋化因子和黏附分子的基因转录和表达，如白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、细胞间黏附分子1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子1（VCAM-1）等。这些炎性介质的释放吸引血液中的单核细胞、淋巴细胞等炎性细胞向血管内膜下迁移和聚集，引发炎症反应，促进动脉粥样硬化的发展。另一方面，TAK1激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，包括细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK。激活的MAPK进一步磷酸化下游的转录因子，如激活蛋白1（AP-1）等，调节细胞的增殖、分化、凋亡和炎症反应等过程，在动脉粥样硬化中，MAPK的激活可促进血管平滑肌细胞的增殖和迁移，参与纤维斑块的形成。在TRIF依赖性信号通路中，TLR4与配体结合后，通过TIR结构域招募含有TIR结构域的接头分子β干扰素TIR结构域衔接蛋白（TRIF）。TRIF分子含有TIR结构域和一个RIP同源相互作用基序（RHIM）。TRIF通过其RHIM结构域与受体相互作用蛋白1（RIP1）和RIP3相互作用，形成一个信号复合物。RIP1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它在TRIF依赖性信号通路中起着关键的调节作用。RIP1的激酶活性对于激活下游信号分子至关重要。TRIF还可以通过TANK结合激酶1（TBK1）和干扰素调节因子3（IRF3）途径发挥作用。TBK1被TRIF招募并激活，激活的TBK1磷酸化IRF3。IRF3是一种转录因子，磷酸化后发生二聚化并转位进入细胞核，与特定的DNA序列结合，诱导干扰素（IFN）相关基因的表达，如IFN-β等。IFN具有抗病毒、调节免疫细胞功能等作用，但在动脉粥样硬化中，IFN的产生也会促进炎症反应。此外，TRIF还能通过激活NF-κB和MAPK等通路，促进炎症因子的产生。在NF-κB激活过程中，TRIF可能通过与TRAF6等分子相互作用，间接激活IKKs复合物，从而导致NF-κB的活化。在MAPK激活方面，TRIF可能通过激活其他MAP3K家族成员，如ASK1等，进而激活JNK和p38MAPK，促进炎症因子的表达。MyD88非依赖性信号通路在动脉粥样硬化中的作用主要体现在调节抗病毒免疫反应、促进炎症反应以及影响细胞的存活和凋亡等方面。在动脉粥样硬化的发生发展过程中，病毒感染或内源性危险信号可能通过激活TRIF依赖性信号通路，导致炎症反应的加剧和斑块的不稳定。4.3Toll样受体4对脂质代谢的影响Toll样受体4（TLR4）对脂质代谢的影响在动脉粥样硬化的发生发展中扮演着关键角色，主要通过影响脂质摄取、代谢和转运等多个环节，导致脂质在血管壁的异常沉积，从而促进动脉粥样硬化的进程。在脂质摄取方面，TLR4的激活能够显著增强巨噬细胞对氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的摄取能力，这一过程与清道夫受体的表达密切相关。研究表明，当巨噬细胞受到TLR4配体如脂多糖（LPS）或ox-LDL刺激时，细胞内的TLR4信号通路被激活。在MyD88依赖性信号通路中，TLR4与配体结合后，通过MyD88招募白细胞介素1受体相关激酶（IRAK），激活的IRAK进一步激活肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）。TRAF6通过激活核因子κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，上调清道夫受体A（SR-A）和CD36等清道夫受体的表达。SR-A和CD36能够特异性地识别和结合ox-LDL，促进巨噬细胞对ox-LDL的摄取。一项细胞实验研究发现，用LPS刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7后，SR-A和CD36的mRNA和蛋白表达水平显著升高，同时细胞对ox-LDL的摄取量也明显增加。当使用siRNA干扰TLR4基因表达后，LPS诱导的SR-A和CD36表达上调以及ox-LDL摄取增加的现象被明显抑制。这充分表明，TLR4通过上调清道夫受体的表达，促进巨噬细胞对ox-LDL的摄取，加速泡沫细胞的形成，而泡沫细胞的大量堆积是动脉粥样硬化早期病变的重要特征。在脂质代谢过程中，TLR4对胆固醇代谢相关酶和转运蛋白的表达和功能产生重要影响。胆固醇酯化是细胞内胆固醇代谢的重要环节，胆固醇酰基转移酶1（ACAT1）是催化胆固醇酯化的关键酶。研究发现，TLR4激活后，通过MyD88依赖性信号通路，激活NF-κB和AP-1等转录因子，上调ACAT1的表达。ACAT1活性增强，促使细胞内游离胆固醇与脂肪酸结合，形成胆固醇酯储存起来。在动脉粥样硬化病变部位，巨噬细胞因TLR4激活导致ACAT1表达增加，使得细胞内胆固醇酯大量蓄积，进一步促进泡沫细胞的形成和发展。胆固醇逆向转运是维持体内胆固醇平衡的重要机制，三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）和三磷酸腺苷结合盒转运体G1（ABCG1）是参与胆固醇逆向转运的关键转运蛋白。TLR4激活后，会抑制ABCA1和ABCG1的表达和功能。在MyD88非依赖性信号通路中，TLR4通过激活TANK结合激酶1（TBK1）和干扰素调节因子3（IRF3），抑制肝脏X受体（LXR）的活性。LXR是调控ABCA1和ABCG1表达的重要转录因子，其活性受到抑制后，ABCA1和ABCG1的表达减少，导致胆固醇逆向转运受阻。细胞内多余的胆固醇无法有效转运出去，进一步加重脂质沉积，促进动脉粥样硬化的发展。有研究对TLR4基因敲除小鼠和野生型小鼠进行对比，发现TLR4基因敲除小鼠巨噬细胞中ABCA1和ABCG1的表达水平明显高于野生型小鼠，胆固醇逆向转运能力增强，动脉粥样硬化病变程度减轻。在脂质转运方面，TLR4对载脂蛋白和脂蛋白受体的表达和功能产生影响，进而干扰脂质的正常转运。载脂蛋白E（ApoE）在脂蛋白代谢中起着关键作用，它能够与脂蛋白受体结合，促进脂蛋白的摄取和代谢。研究表明，TLR4激活后，通过炎症信号通路，抑制ApoE的表达。在动脉粥样硬化模型中，TLR4高表达的小鼠血浆中ApoE水平降低，导致脂蛋白代谢异常，脂质在血液中堆积。脂蛋白受体如低密度脂蛋白受体（LDLR）的表达和功能也受到TLR4的影响。TLR4激活后，通过激活NF-κB等转录因子，下调LDLR的表达。LDLR表达减少，使得细胞对LDL的摄取能力下降，血液中LDL水平升高，增加了动脉粥样硬化的发病风险。4.4Toll样受体4与血管平滑肌细胞的相互作用血管平滑肌细胞（Vascularsmoothmusclecells，VSMCs）在动脉粥样硬化的发生发展过程中扮演着关键角色，而Toll样受体4（TLR4）与VSMCs之间存在着复杂而紧密的相互作用，这种相互作用对动脉粥样硬化的进程产生着深远影响。在正常生理状态下，VSMCs主要呈收缩型，具有维持血管张力和调节血压的重要功能。它们通过表达特异性的收缩蛋白，如α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、平滑肌肌球蛋白重链（SM-MHC）等，实现对血管管径的精确调控。同时，收缩型VSMCs分泌细胞外基质的能力较弱，主要维持血管壁的结构稳定。然而，在动脉粥样硬化等病理条件下，VSMCs会发生表型转化，从收缩型转变为合成型。合成型VSMCs失去了部分收缩功能，但其增殖和迁移能力显著增强。它们能够大量合成和分泌细胞外基质成分，如胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白等，同时还分泌多种细胞因子、趋化因子和蛋白酶，如血小板衍生生长因子（PDGF）、转化生长因子β（TGF-β）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、基质金属蛋白酶（MMPs）等。这些变化使得VSMCs在动脉粥样硬化的发生发展中发挥重要作用，它们参与了纤维斑块的形成、血管壁的重构以及斑块的不稳定过程。TLR4在VSMCs中广泛表达，其表达水平会受到多种因素的影响。当VSMCs受到病原体相关分子模式（PAMPs）如细菌脂多糖（LPS），或损伤相关分子模式（DAMPs）如氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）、热休克蛋白（HSPs）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）等刺激时，TLR4的表达会显著上调。研究表明，用LPS刺激体外培养的VSMCs，TLR4的mRNA和蛋白表达水平在刺激后6小时开始升高，12-24小时达到峰值。ox-LDL也能以时间和剂量依赖的方式上调VSMCs中TLR4的表达。TLR4激活对VSMCs的增殖和迁移具有显著的促进作用。在增殖方面，TLR4激活后，通过MyD88依赖性信号通路，激活核因子κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路。NF-κB活化后，进入细胞核，与特定的DNA序列结合，启动一系列与细胞增殖相关基因的转录和表达，如细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）等。这些基因的表达增加，促进VSMCs从G1期进入S期，加速细胞增殖。MAPK信号通路中的细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK被激活后，通过磷酸化下游的转录因子和其他信号分子，调节细胞的增殖和分化。研究发现，使用LPS刺激VSMCs，细胞增殖活性明显增强，而当使用TLR4抗体阻断TLR4信号，或使用siRNA干扰TLR4基因表达后，LPS诱导的VSMCs增殖受到显著抑制。在迁移方面，TLR4激活促使VSMCs迁移能力增强。TLR4激活后，通过激活RhoA/ROCK信号通路，调节细胞骨架的重组。RhoA是一种小GTP酶，被激活后与ROCK结合，激活的ROCK使肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）失活，导致肌球蛋白轻链（MLC）磷酸化增加。MLC磷酸化增加促进肌动蛋白和肌球蛋白相互作用，引起细胞骨架收缩和重排，从而增强VSMCs的迁移能力。此外，TLR4激活还会促进VSMCs分泌基质金属蛋白酶（MMPs），如MMP-2和MMP-9。MMPs能够降解细胞外基质成分，为VSMCs的迁移开辟道路。有研究表明，用LPS刺激VSMCs后，细胞的迁移能力显著提高，迁移到划痕区域的细胞数量明显增加，而当使用RhoA抑制剂或MMPs抑制剂处理细胞后，LPS诱导的VSMCs迁移受到抑制。TLR4激活还会导致VSMCs分泌多种细胞因子和趋化因子，进一步促进炎症反应和动脉粥样硬化的发展。TLR4激活后，通过NF-κB和MAPK信号通路，诱导VSMCs分泌白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素8（IL-8）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）等炎性细胞因子和趋化因子。IL-6和TNF-α能够激活其他免疫细胞和血管细胞，促进炎症反应的放大。IL-8和MCP-1则具有强大的趋化作用，能够吸引血液中的单核细胞、淋巴细胞等炎性细胞向血管内膜下迁移和聚集，加剧炎症反应。研究发现，在动脉粥样硬化斑块中，VSMCs分泌的这些细胞因子和趋化因子的水平明显升高，且与TLR4的表达呈正相关。当使用TLR4抑制剂或基因敲除TLR4后，VSMCs分泌的细胞因子和趋化因子水平显著降低，炎症反应得到缓解。五、Toll样受体4基因多态性与动脉粥样硬化的关系5.1Toll样受体4基因多态性概述Toll样受体4（TLR4）基因多态性是指在人群中TLR4基因序列存在的差异，这些差异主要表现为单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphisms，SNPs），即基因组DNA序列中单个核苷酸（A、T、C或G）的改变。TLR4基因位于人类染色体9q32-33区域，全长约60kb，包含3个外显子和2个内含子。目前已发现多个TLR4基因的单核苷酸多态性位点，其中较为常见的有Asp299Gly和Thr399Ile。Asp299Gly多态性是由于TLR4基因外显子3上第896位核苷酸发生A-G的替换，导致其编码的蛋白质在第299位氨基酸由天冬氨酸（Asp）替换为甘氨酸（Gly）。这种氨基酸的替换发生在TLR4的胞外区富含亮氨酸重复序列（LRR）结构域，该结构域对于TLR4识别病原体相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs）起着关键作用。研究表明，Asp299Gly多态性可能会影响TLR4与配体的结合能力。一些体外实验发现，携带Gly299等位基因的TLR4对细菌脂多糖（LPS）的识别和结合能力较野生型Asp299有所降低。这种结合能力的改变可能会影响TLR4信号通路的激活，进而影响炎症反应的强度。有研究对携带不同TLR4Asp299Gly基因型的人群进行LPS刺激实验，发现携带Gly299等位基因的个体，其外周血单核细胞在LPS刺激后产生的炎性细胞因子如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）等的水平明显低于携带Asp299等位基因的个体。Thr399Ile多态性是TLR4基因外显子3上第1196位核苷酸发生C-T的替换，使得编码的蛋白质在第399位氨基酸由苏氨酸（Thr）替换为异亮氨酸（Ile）。这一氨基酸替换同样位于TLR4的胞外区LRR结构域。Thr399Ile多态性也会对TLR4的功能产生影响。研究发现，Thr399Ile多态性可能影响TLR4的空间构象，进而影响其与配体的相互作用以及信号传导。有研究报道，携带Ile399等位基因的TLR4在识别内源性危险信号分子如热休克蛋白60（HSP60）时，其亲和力与野生型Thr399存在差异。在细胞实验中，将表达携带Ile399等位基因TLR4的细胞与表达野生型TLR4的细胞分别用HSP60刺激，发现携带Ile399等位基因的细胞中，TLR4信号通路的激活程度以及下游炎性细胞因子的表达水平与野生型存在明显差异。5.2不同基因多态性与动脉粥样硬化易感性的关联Toll样受体4（TLR4）基因的不同多态性与动脉粥样硬化易感性之间存在着复杂的关联，众多研究围绕常见的单核苷酸多态性位点展开，旨在揭示其内在机制，但目前研究结果存在一定差异。对于Asp299Gly多态性，Ameziane等学者研究发现，具有Asp299GlyTLR-4基因多态性的人，急性冠状动脉事件发生率降低，且独立于其他危险因素。他们推测，该多态性可能改变了TLR4的结构和功能，使其对病原体相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs）的识别和应答能力发生变化，从而降低了炎症反应的强度，减少了急性冠状动脉事件的发生风险。然而，Erridge等学者持有不同观点，他们认为TLR-4基因多态性Asp299Gly与动脉粥样硬化进程无关。最近也有研究发现，TLR-4基因多态性Asp299Gly与冠脉狭窄有一定联系，但是与急性或陈旧性心肌梗死的发生无相关性。这些不一致的研究结果可能是由于研究对象的种族差异、样本量大小、研究方法不同以及环境因素等多种因素共同作用导致的。不同种族人群的遗传背景存在差异，可能使得TLR4基因多态性在不同种族中的分布频率以及与动脉粥样硬化的关联程度有所不同。样本量较小可能无法准确反映总体人群的特征，研究方法的差异，如基因检测技术的准确性、研究设计的合理性等，也会对结果产生影响。在Thr399Ile多态性方面，有研究表明，携带Ile399等位基因的个体，其动脉粥样硬化的发病风险可能增加。这可能是因为Ile399等位基因影响了TLR4与配体的结合亲和力，或者改变了TLR4信号通路中某些关键分子的相互作用，从而导致炎症反应失调，促进动脉粥样硬化的发生发展。然而，也有部分研究未发现Thr399Ile多态性与动脉粥样硬化易感性之间存在显著关联。这些矛盾的结果可能与研究人群的遗传背景、生活方式以及其他遗传因素与环境因素的交互作用有关。某些遗传背景下，Thr399Ile多态性可能对动脉粥样硬化易感性产生影响，而在其他遗传背景下，这种影响可能被其他因素所掩盖。生活方式，如饮食习惯、运动量等，也可能与TLR4基因多态性相互作用，影响动脉粥样硬化的发生风险。除了Asp299Gly和Thr399Ile这两个常见的多态性位点外，TLR4基因还存在其他一些罕见的多态性位点，它们与动脉粥样硬化易感性的关系也逐渐受到关注。一些研究发现，某些罕见多态性位点可能通过影响TLR4的表达水平、蛋白稳定性或信号传导效率，进而影响动脉粥样硬化的发生发展。但由于这些罕见多态性位点的频率较低，研究难度较大，目前相关研究相对较少，其具体作用机制尚有待进一步深入探索。5.3基因多态性影响动脉粥样硬化的潜在机制Toll样受体4（TLR4）基因多态性对动脉粥样硬化产生影响，主要通过受体功能改变、信号传导异常和炎症反应失调等潜在机制，在动脉粥样硬化的发生发展过程中发挥作用。从受体功能改变角度来看，TLR4基因多态性如Asp299Gly和Thr399Ile，可使编码的蛋白质氨基酸序列改变，影响受体空间构象。以Asp299Gly多态性为例，第299位氨基酸由天冬氨酸替换为甘氨酸，发生在胞外区富含亮氨酸重复序列（LRR）结构域。该结构域对识别病原体相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs）至关重要，氨基酸替换可能降低TLR4与LPS、ox-LDL等配体的结合亲和力。研究发现，携带Gly299等位基因的TLR4对LPS的结合能力弱于野生型，导致受体激活减少，信号传导减弱。这种受体功能改变影响了对危险信号的识别和免疫应答启动，进而影响动脉粥样硬化进程。若TLR4不能有效识别ox-LDL，巨噬细胞对其摄取减少，泡沫细胞形成受抑制，动脉粥样硬化发展可能减缓。在信号传导异常方面，基因多态性可干扰TLR4信号通路关键分子的相互作用和活化过程。MyD88依赖性信号通路中，TLR4与MyD88结合是信号起始的关键步骤。基因多态性可能改变TLR4的TIR结构域与MyD88的结合能力，影响IRAK的招募和活化。Thr399Ile多态性可能改变TLR4空间构象，使TIR结构域与MyD88结合位点改变，导致MyD88不能正常招募和激活IRAK。IRAK活化受阻，无法激活下游的TRAF6和NF-κB，炎性细胞因子基因转录和表达受抑制，炎症反应减弱。TRIF依赖性信号通路也受影响，基因多态性可能干扰TRIF与TLR4的结合，或影响TRIF激活TBK1和IRF3的过程。若TRIF与TLR4结合异常，TBK1和IRF3无法激活，IFN相关基因表达受阻，影响抗病毒免疫反应和炎症调节，对动脉粥样硬化进程产生作用。炎症反应失调也是基因多态性影响动脉粥样硬化的重要机制。TLR4基因多态性通过改变受体功能和信号传导，导致炎症因子表达和释放异常。携带特定基因多态性的个体，在受到PAMPs或DAMPs刺激时，炎性细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β的产生量与野生型个体不同。研究表明，携带Asp299Gly多态性Gly299等位基因的个体，外周血单核细胞在LPS刺激后，TNF-α和IL-6水平低于携带Asp299等位基因个体。炎症因子表达失调影响免疫细胞活化、迁移和聚集。TNF-α和IL-6可激活巨噬细胞、T淋巴细胞等免疫细胞，促进其向血管内膜下迁移。炎症因子水平改变会影响免疫细胞功能和炎症微环境，进而影响动脉粥样硬化的发生发展。炎症因子还可作用于血管内皮细胞、平滑肌细胞等，影响其功能和代谢，如促进平滑肌细胞增殖和迁移，参与纤维斑块形成。六、基于Toll样受体4的动脉粥样硬化防治策略6.1药物干预针对Toll样受体4（TLR4）的药物研发在动脉粥样硬化防治领域具有重要意义，目前主要集中在抑制剂、抗体等方面，这些药物通过不同机制作用于TLR4及其信号通路，展现出潜在的治疗效果。抑制剂是当前研究的重点之一。其中，TAK-242（resatorvid）是一种备受关注的小分子TLR4抑制剂。它能够特异性地结合TLR4，阻断其与配体的相互作用，从而抑制TLR4信号通路的激活。研究表明，在动脉粥样硬化动物模型中，给予TAK-242处理后，可显著降低炎症细胞因子的表达水平，如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）等。一项针对载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠的研究发现，在高脂饮食诱导动脉粥样硬化的过程中，给予TAK-242干预，小鼠主动脉根部的粥样斑块面积明显减小，炎症细胞浸润减少，同时巨噬细胞中TLR4信号通路相关蛋白的磷酸化水平降低。这表明TAK-242通过抑制TLR4信号通路，减轻了炎症反应，进而抑制了动脉粥样硬化的发展。另一种抑制剂E5564，它是一种合成的脂多糖（LPS）类似物，能够与TLR4/MD-2复合物结合，但不激活信号通路，从而竞争性地抑制LPS与T