Notch1 - 4及Jagged1在肝细胞肝癌组织中的表达及临床意义探究

Notch1-4及Jagged1在肝细胞肝癌组织中的表达及临床意义探究一、引言1.1研究背景与目的肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）作为原发性肝癌中最常见的病理类型，约占95%以上，是全球范围内严重威胁人类健康的消化系统恶性肿瘤。据统计，在全球范围内男性发病率位居第五，女性发病率位居第七，而其病死率男性排名第二位，女性排名第六位。大多数肝癌患者就诊时已属中晚期，手术切除率很低，术后复发率及病死率很高。肝细胞癌的发生发展是一个多因素、多步骤的复杂过程，涉及多种基因和信号通路的异常改变。深入探究其发病机制，寻找有效的诊断标志物和治疗靶点，对于提高肝细胞癌患者的生存率和生活质量具有至关重要的意义。Notch信号通路是一个在进化中高度保守的反映细胞间通讯机制的通路，它调控细胞的增殖、分化和凋亡，在胚胎发育和细胞命运的决定中发挥重要作用。Notch信号通路在不同组织细胞中作用不同，甚至在同一组织细胞的不同发展阶段作用也不同，这种生理作用依赖于细胞所处的环境。在肿瘤研究领域，Notch信号通路的异常活化与多种肿瘤的发生、发展密切相关。Notch信号不仅对正常细胞分化起重要作用，在肿瘤的形成中所起的重要作用已成为近年来研究的热点问题，但Notch信号在肝癌形成过程的机制，目前尚不十分清楚。Notch信号通路由Notch受体（Notch1-4）、Notch配体（如Jagged1、Delta-like等）、CSLDNA结合蛋白以及下游靶基因等组成。当Notch配体与相邻细胞表面的Notch受体结合后，Notch受体经过一系列蛋白水解切割，释放出具有转录激活活性的Notch胞内结构域（NICD），NICD进入细胞核与CSL蛋白结合，从而调控下游靶基因（如HES、HEY等）的表达，进而影响细胞的生物学行为。在肝细胞癌中，Notch信号通路成员的异常表达可能参与了肝癌细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭和转移等过程。已有研究表明，Notch1、Jagged1等在肝细胞癌组织中的表达水平与癌旁组织存在差异，且与肿瘤的临床病理特征及预后相关。然而，目前对于Notch1-4及Jagged1在肝细胞癌组织中的表达情况及其与肝癌临床病理学参数的相关性研究仍存在一定的争议和不足，不同研究结果之间存在差异，尚未形成统一的结论。此外，对于这五种蛋白之间的相关性研究也相对较少。本研究旨在通过检测Notch1-4及Jagged1在肝细胞癌组织、癌旁硬化肝组织及正常肝组织中的表达特点，分析其与肝癌临床病理学参数（如患者性别、年龄、癌灶数目、肿瘤大小、AFP阴阳性、肿瘤包膜是否完整、瘤栓有无、肝癌临床分期及病理分级等）的相关性，并探讨这五种蛋白间的相关性，以期为深入了解肝细胞癌的发病机制提供理论依据，为肝癌的早期诊断、治疗及预后评估提供新的潜在靶点和思路。1.2国内外研究现状在国外，对Notch信号通路在肝细胞癌中的研究开展较早。早期研究就已发现Notch信号通路在胚胎肝脏发育中起着关键作用，调控着肝细胞的分化与增殖。随着研究的深入，诸多学者聚焦于Notch1-4及Jagged1在肝细胞癌组织中的表达。有研究运用免疫组化及基因芯片技术，检测出Notch1在肝细胞癌组织中的表达显著高于正常肝组织，且其高表达与肿瘤的大小、侵袭性及不良预后密切相关。对于Notch2和Notch3，部分研究表明它们在肝癌组织中的表达水平变化与肿瘤的病理分级、临床分期存在一定关联，可能参与了肝癌细胞的恶性生物学行为调控。关于Notch4，有实验显示其在肝癌发生发展过程中，表达呈现动态变化，在癌前病变及早期肝癌组织中表达上调，而在晚期肝癌组织中表达有所下降，提示其可能在肝癌的不同阶段发挥不同作用。在Notch信号通路的配体研究方面，Jagged1在肝细胞癌组织中的高表达被证实，且其表达与肿瘤血管生成、癌细胞的转移潜能相关，可能通过激活Notch信号促进肿瘤的进展。在国内，相关研究也在不断深入。众多研究团队采用免疫组织化学、实时荧光定量PCR及Westernblot等多种技术手段，对Notch1-4及Jagged1在肝细胞癌中的表达及临床意义进行了广泛探索。研究发现，Notch1在肝细胞癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织，且其表达与患者的血清AFP水平、肿瘤包膜完整性及瘤栓形成等临床病理参数密切相关。有研究进一步分析了Notch2在肝癌组织中的表达与患者预后的关系，结果表明Notch2高表达的患者术后生存率较低，提示其可能作为评估肝癌患者预后的潜在指标。在探讨Notch3与肝癌的关系时，发现其在肝癌组织中的表达与肿瘤的大小、临床分期相关，可能参与了肝癌的侵袭与转移过程。对于Notch4，国内研究同样发现其在肝癌组织中的表达异常，但其具体作用机制及与其他临床病理参数的相关性仍有待进一步明确。在Jagged1的研究中，证实了其在肝细胞癌组织中的高表达，且与肿瘤的分化程度、淋巴结转移等相关。然而，目前国内外关于Notch1-4及Jagged1在肝细胞癌组织中的表达研究仍存在一些争议和不足之处。不同研究中，由于实验方法、样本量及研究对象的差异，导致部分研究结果不一致。例如，在Notch2和Notch4与肝癌临床病理参数的相关性研究中，不同研究报道的结果存在差异。此外，对于这五种蛋白之间在肝细胞癌发生发展过程中的相互作用及协同调控机制研究相对较少，尚未形成完整的理论体系。因此，深入研究Notch1-4及Jagged1在肝细胞癌组织中的表达特点及其相关性，对于揭示肝细胞癌的发病机制、寻找有效的治疗靶点具有重要的理论和临床意义。1.3研究意义与创新点肝细胞癌严重威胁人类健康，其发病机制复杂，Notch信号通路成员在其中的作用研究存在争议和不足。本研究检测Notch1-4及Jagged1在肝细胞癌组织、癌旁硬化肝组织及正常肝组织中的表达，分析其与临床病理学参数及蛋白间的相关性，对肝细胞癌研究和临床实践具有重要意义。从理论研究角度来看，本研究有助于深入了解肝细胞癌的发病机制。Notch信号通路在肝细胞癌中的作用机制尚未完全明确，通过研究Notch1-4及Jagged1在不同肝组织中的表达差异，能够揭示它们在肝癌发生发展过程中的具体作用及相互关系，为进一步阐述Notch信号通路在肝细胞癌中的调控机制提供重要的理论依据。例如，若发现某些蛋白的表达与肝癌的恶性程度密切相关，将有助于解释肝癌细胞异常增殖、分化和转移的分子机制。这不仅丰富了对肿瘤发病机制的认识，还为后续研究提供了新的方向和思路，推动肿瘤生物学领域的发展。在临床应用方面，本研究成果具有潜在的实用价值。其一，可能为肝细胞癌的早期诊断提供新的标志物。目前肝细胞癌的早期诊断手段存在一定局限性，若能确定Notch1-4及Jagged1中某些蛋白的异常表达与肝癌的早期发生密切相关，那么这些蛋白可作为潜在的诊断标志物，提高肝癌早期诊断的准确性，有助于患者的早期发现和治疗，改善患者的预后。其二，有望为肝细胞癌的治疗提供新的靶点。基于对Notch信号通路成员在肝癌中作用机制的深入了解，可以开发针对这些蛋白的靶向治疗药物，通过干预Notch信号通路来抑制肝癌细胞的生长和转移，为肝癌的治疗提供新的策略，提高治疗效果。其三，对判断肝细胞癌的预后具有参考意义。通过分析这些蛋白的表达与肝癌临床病理学参数的相关性，能够更好地评估患者的病情和预后，为临床医生制定个性化的治疗方案提供重要参考。本研究在研究思路和方法上也具有一定的创新点。在样本选择上，选取了肝细胞癌组织、癌旁硬化肝组织及正常肝组织，全面对比不同状态下肝组织中Notch1-4及Jagged1的表达情况，更系统地分析其表达差异与肝癌发生发展的关系。在检测方法上，采用免疫组织化学技术，能够直观地观察到蛋白在组织中的定位和表达情况，为研究提供了更准确的信息。在分析角度上，不仅探讨了单个蛋白与肝癌临床病理学参数的相关性，还深入研究了这五种蛋白之间的相关性，从多个角度全面剖析Notch信号通路在肝细胞癌中的作用，为相关研究提供了更全面、深入的视角。二、相关理论基础2.1肝细胞肝癌概述肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是原发性肝癌中最为常见的病理类型，约占95%以上，是一种起源于肝细胞的恶性肿瘤。其发病机制复杂，涉及多种因素的相互作用。从全球范围来看，肝细胞癌的发病率呈现出明显的地域差异。在亚洲和非洲的部分地区，尤其是中国、东南亚和撒哈拉以南非洲，其发病率较高。据统计，全球每年新发病例超过80万，而中国作为肝癌大国，每年新增病例数占全球的一半以上。这可能与这些地区较高的乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染率、不良的生活习惯（如长期大量饮酒、食用被黄曲霉毒素污染的食物等）以及环境污染等因素密切相关。肝细胞癌的死亡率也居高不下，严重威胁着人类的生命健康。大多数患者在确诊时已处于中晚期，失去了手术根治的机会，这是导致其死亡率高的重要原因之一。中晚期肝癌患者往往伴有肿瘤的转移和扩散，对常规治疗手段（如手术、化疗、放疗等）的敏感性较低，治疗效果不佳，患者的生存时间较短。在病因方面，慢性乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染是肝细胞癌最主要的危险因素。HBV和HCV持续感染可导致肝脏慢性炎症、纤维化，进而发展为肝硬化，最终引发肝细胞癌。据研究，约80%的肝细胞癌患者存在HBV或HCV感染史。长期大量饮酒也是导致肝细胞癌的重要因素之一，酒精性肝病可逐渐进展为肝硬化，增加肝癌的发病风险。黄曲霉毒素污染的食物摄入也与肝细胞癌的发生密切相关，黄曲霉毒素B1具有强烈的致癌性，可通过损伤肝细胞的DNA，引发基因突变，促进肝癌的发生。此外，非酒精性脂肪性肝病、遗传因素、自身免疫性肝病等也可能与肝细胞癌的发病有关。在病理特征上，肝细胞癌大体形态可分为块状型、结节型和弥漫型。块状型肝癌肿瘤直径较大，常超过5cm，可占据肝脏的一叶或多叶；结节型肝癌肿瘤呈结节状，直径一般在5cm以下，可单发或多发；弥漫型肝癌肿瘤弥漫分布于肝脏，无明显的结节形成，此型肝癌预后较差。在显微镜下，肝细胞癌癌细胞呈多边形，核大深染，可见核分裂象，癌细胞排列成巢状、梁索状或腺管状。根据癌细胞的分化程度，可分为高分化、中分化和低分化肝癌，分化程度越低，肿瘤的恶性程度越高，预后越差。2.2Notch信号通路简介Notch信号通路是一条在进化中高度保守的细胞间信号传导通路，广泛存在于从无脊椎动物到脊椎动物等多种生物中，对胚胎发育、细胞命运决定以及组织器官的形成和维持起着至关重要的作用。其主要由Notch受体、Notch配体、CSLDNA结合蛋白以及下游靶基因等组成。Notch受体在哺乳动物中包括Notch1-4四种亚型，它们均为单次跨膜蛋白，结构上可分为胞外区（NEC）、跨膜区（TM）和胞内区（NICD/ICN）。胞外区包含29-36个串联的表皮生长因子（epidermalgrowthfactor，EGF）序列及3个富含半胱氨酸的LinNotch重复序列（LinNotchrepeats，LNR），主要功能是与配体结合并启动Notch信号。跨膜区为单孔跨膜结构，在甘氨酸-1743和缬氨酸-1744之间存在一个裂解位点（S3位点），在Presenilin（突变型早老素）蛋白等水解作用下，Notch可在此位点发生断裂，生成胞内区ICN和一个短的跨膜片段。胞内区主要包含5个部分：1个RAM（RBP2Jkappaassociatedmolecular）区，可与DNA结合蛋白（C2promoterbindingprotein，CBF）结合；6个锚蛋白重复序列（ankyrinrepeats，ANK），是启动Notch的增强子，可介导Notch与其他蛋白质之间的相互作用；2个核定位信号（nuclearlocalizationsignal，NLS）；1个翻译启动区（translationalactivedomain，TAD）；1个PEST（Proline，P；Glutamate，E；Serine，S；Threonine，T的区域，与Notch受体的降解有关。Notch配体又被称为DSL蛋白，目前已知的包括Deltalike（DLL1，DLL3，DLL4）、Jagged1和Jagged2。它们是一种含保守分子结构的跨膜蛋白，包含一个氨基末端，胞外区包含数量不等的EGF-R结构域和DSL结构域（富含半胱氨酸），这些结构域是与Notch受体结合的关键部位。CSLDNA结合蛋白（CBFl/SuppresorofHairless/Lag1）在Notch信号通路中起关键作用。在哺乳动物中，CBF-1（C-promoterbindingfactor-1）又被称为RBP-JK（recombinationsignalbindingprotein-Jk），它是一种转录抑制因子。当Notch信号未被激活时，CSL蛋白识别并结合特定的DNA序列（GTGGGAA），这个序列位于Notch诱导基因的启动子上，此时CSL通过募集阻遏蛋白SMRT和组蛋白脱乙酰酶（HDAC）抑制基因转录。Notch信号通路的激活过程较为复杂。首先，在细胞内合成的受体蛋白单链前体分子被高尔基体内的furin蛋白酶在S1位点酶切，形成的胞外区（NotchextraCellulardomain，NEC）和跨膜片段（Notchtransmembranefragment，NTM）通过一种Ca²⁺依赖的非共价键结合在一起，形成异二聚体形式的成熟Notch受体，并转运至细胞表面。当相邻细胞的Notch配体与该受体的胞外区结合后，Notch受体在ADAM（adisintegrinandmetalloprotease）金属蛋白酶家族的肿瘤坏死因子-α-转换酶（tumornecrosisfactor-α-conveningenzyme，TACE）或Kuz（kuzbanian）的作用下，于S2酶切位点发生第二次酶切，释放部分胞外片段，剩余的部分粘连在细胞膜上被称为“Notch—introTM”。随后，早老素（presenilin，PS）依赖的γ-分泌酶进行组成性酶切过程，发生于S3酶切位点。经过此步酶切过程，形成可溶性NICD（Notch的胞内段）并转移至核内。NICD进入细胞核后，其RAM区结合CSL蛋白，将原本的“协同抑制复合物”转换为“协同活化复合物”，并进而与DNA形成多蛋白一DNA复合体，激活相关基因的表达。这些被激活表达的下游靶基因多为碱性螺旋一环一螺旋类转录因子（basichelix-loop—helix，bHLH），如果蝇中的分裂增强子（enhancerofsplit，E／sp1）、哺乳动物中的HES以及HERP（HES-relatedrepressorprotein）等。Notch信号通路在细胞的增殖、分化和凋亡等生物学行为中发挥着重要的调控作用。在胚胎发育过程中，Notch信号通路参与了多种组织和器官的形成，如神经系统、心血管系统、造血系统等。例如，在神经干细胞的分化过程中，Notch信号通路可抑制神经干细胞向神经元分化，维持其干细胞状态，当Notch信号通路被抑制时，神经干细胞则会向神经元分化。在心血管系统发育中，Notch信号通路调控着心脏瓣膜的形成和血管平滑肌细胞的分化。在造血系统中，Notch信号通路参与了造血干细胞的自我更新和分化，对血细胞的生成和发育起着关键作用。在成年个体中，Notch信号通路也参与维持组织稳态，如皮肤、肠道等上皮组织的更新和修复。在肿瘤发生发展方面，Notch信号通路的异常活化或抑制与多种肿瘤的发生、发展密切相关。在某些肿瘤中，Notch信号通路的激活可促进肿瘤细胞的增殖、抑制凋亡、增强侵袭和转移能力；而在另一些肿瘤中，Notch信号通路则可能发挥抑癌作用。2.3Notch1-4及Jagged1的结构与功能2.3.1Notch1-4的结构与功能Notch1-4均属于单次跨膜蛋白，其结构具有高度的保守性。它们由胞外区（NEC）、跨膜区（TM）和胞内区（NICD/ICN）三部分构成。胞外区包含29-36个串联排列的表皮生长因子（epidermalgrowthfactor，EGF）序列以及3个富含半胱氨酸的LinNotch重复序列（LinNotchrepeats，LNR）。EGF序列赋予了胞外区与配体结合的能力，是启动Notch信号的关键部位；而LNR则在维持受体的结构稳定性以及与配体结合的特异性方面发挥重要作用。跨膜区为单孔跨膜结构，在甘氨酸-1743和缬氨酸-1744之间存在一个裂解位点（S3位点），该位点在Presenilin（突变型早老素）蛋白等水解作用下，可使Notch在此处发生断裂，从而生成具有活性的胞内区ICN和一个短的跨膜片段。胞内区主要包含5个重要部分：1个RAM（RBP2Jkappaassociatedmolecular）区，可与DNA结合蛋白（C2promoterbindingprotein，CBF）特异性结合；6个锚蛋白重复序列（ankyrinrepeats，ANK），作为启动Notch的增强子，能够介导Notch与其他蛋白质之间的相互作用，进而调节下游信号传导；2个核定位信号（nuclearlocalizationsignal，NLS），其作用是引导Notch蛋白进入细胞核，发挥其转录调控功能；1个翻译启动区（translationalactivedomain，TAD），参与蛋白质的翻译起始过程；1个PEST（Proline，P；Glutamate，E；Serine，S；Threonine，T）区域，与Notch受体的降解密切相关，通过调节受体的降解速率，维持细胞内Notch信号的动态平衡。在正常生理状态下，Notch1-4在胚胎发育过程中发挥着不可或缺的作用。例如，在神经系统发育中，Notch信号通路参与神经干细胞的分化调控，Notch1-4通过与配体结合，抑制神经干细胞向神经元分化，维持其干细胞状态，确保神经系统的正常发育和功能。在心血管系统发育中，Notch1-4参与心脏瓣膜的形成和血管平滑肌细胞的分化。Notch1在心脏瓣膜间质细胞中表达，通过激活下游靶基因，调控瓣膜间质细胞的增殖和分化，保证心脏瓣膜的正常发育和功能。在造血系统中，Notch1-4参与造血干细胞的自我更新和分化，对血细胞的生成和发育起着关键作用。在肿瘤发生发展过程中，Notch1-4的作用较为复杂。研究表明，Notch1在多种肿瘤中发挥致癌作用。在乳腺癌中，Notch1的异常高表达可促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。通过激活下游靶基因HES1，上调细胞周期蛋白D1的表达，促进细胞周期进程，从而加速癌细胞的增殖。同时，Notch1还可通过调节上皮-间质转化（EMT）相关蛋白的表达，促进乳腺癌细胞的EMT过程，增强其迁移和侵袭能力。在肝细胞癌中，Notch1的表达与肿瘤的大小、侵袭性及不良预后密切相关。高表达的Notch1可通过激活PI3K/Akt信号通路，抑制细胞凋亡，促进肝癌细胞的存活和增殖。Notch2在某些肿瘤中也表现出促癌作用。在非小细胞肺癌中，Notch2的过表达与肿瘤的生长、转移和预后不良相关。它可通过调节细胞增殖、凋亡和血管生成相关基因的表达，促进肿瘤的发展。然而，在某些情况下，Notch2也可能发挥抑癌作用。在皮肤癌中，Notch2的缺失可导致皮肤细胞的异常增殖和分化，促进肿瘤的发生。Notch3在肿瘤中的作用也具有两面性。在前列腺癌中，Notch3的高表达与肿瘤的侵袭性和转移能力相关。它可通过激活NF-κB信号通路，促进肿瘤细胞的炎症反应和迁移能力。但在黑色素瘤中，Notch3的表达则与肿瘤的抑制相关。Notch3可通过抑制MAPK信号通路，抑制黑色素瘤细胞的增殖和迁移。关于Notch4，在肿瘤发生发展过程中，其表达呈现动态变化。在癌前病变及早期肝癌组织中，Notch4表达上调，可能通过促进细胞增殖和抑制凋亡，参与肿瘤的起始阶段。而在晚期肝癌组织中，Notch4表达有所下降，可能与肿瘤细胞的分化和转移特性改变有关。在乳腺癌中，Notch4的高表达与肿瘤的侵袭和转移能力相关。它可通过调节细胞外基质降解酶的表达，促进乳腺癌细胞的侵袭和转移。2.3.2Jagged1的结构与功能Jagged1作为Notch信号通路的配体之一，是一种含保守分子结构的跨膜蛋白。它包含一个氨基末端，胞外区含有数量不等的EGF-R结构域和DSL结构域（富含半胱氨酸），这些结构域是与Notch受体结合的关键部位。EGF-R结构域赋予Jagged1与Notch受体特异性结合的能力，而DSL结构域则在信号传递过程中发挥重要作用。跨膜区将Jagged1固定在细胞膜上，使其能够与相邻细胞表面的Notch受体相互作用。胞内区则参与细胞内信号传导，虽然其具体功能机制尚未完全明确，但研究表明它可能通过与其他信号分子相互作用，将Notch信号传递到细胞内，进而调节细胞的生物学行为。在正常生理状态下，Jagged1在胚胎发育中参与多个组织和器官的形成。在心血管系统发育中，Jagged1参与心脏瓣膜的形成和血管的发育。在心脏发育过程中，Jagged1在心脏内皮细胞和心肌细胞中表达，通过与Notch受体结合，调控心脏瓣膜间质细胞的分化和增殖，确保心脏瓣膜的正常发育。在血管发育中，Jagged1参与血管平滑肌细胞的分化和血管生成过程。在神经系统发育中，Jagged1参与神经干细胞的分化调控，与Notch受体相互作用，影响神经干细胞向神经元和神经胶质细胞的分化。在肿瘤发生发展过程中，Jagged1的作用也十分关键。在肝细胞癌中，Jagged1的高表达与肿瘤血管生成、癌细胞的转移潜能相关。研究发现，Jagged1可通过激活Notch信号通路，上调血管内皮生长因子（VEGF）的表达，促进肿瘤血管生成，为肿瘤细胞的生长和转移提供营养和氧气。同时，Jagged1还可通过调节EMT相关蛋白的表达，促进肝癌细胞的EMT过程，增强其迁移和侵袭能力。在乳腺癌中，Jagged1的表达与肿瘤的侵袭和转移能力密切相关。高表达的Jagged1可通过激活Notch信号通路，促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。在肺癌中，Jagged1的过表达与肿瘤的生长、转移和预后不良相关。它可通过调节细胞增殖、凋亡和血管生成相关基因的表达，促进肺癌的发展。三、研究设计与方法3.1实验材料本研究选取了河北医科大学第四医院肝胆外科2014年1月至2015年12月期间手术切除的标本，包括56例肝细胞癌组织、相应的癌旁硬化肝组织（距离癌组织2-3cm处）以及20例肝血管瘤周边正常肝组织。所有标本均经河北医科大学第四医院病理科确诊，且患者术前均未接受任何形式的治疗。主要试剂方面，兔抗人Notch1多克隆抗体、兔抗人Notch2多克隆抗体、兔抗人Notch3多克隆抗体、兔抗人Notch4多克隆抗体以及兔抗人Jagged1多克隆抗体均购自美国SantaCruzBiotechnology公司。免疫组织化学检测试剂盒和二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。苏木素染液购自北京中杉金桥生物技术有限公司。PBS缓冲液（pH7.2-7.4）由实验室自行配制。实验所需的主要仪器有：德国Leica公司生产的RM2235型石蜡切片机，用于对组织进行切片处理；日本Olympus公司生产的BX51型光学显微镜，搭配其配套的摄像系统，用于对切片进行观察和拍照；美国Thermo公司生产的3111型二氧化碳培养箱，用于细胞培养等相关实验；上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产的YXQ-LS-50SⅡ型高压蒸汽灭菌器，用于对实验器材和试剂等进行灭菌处理；湖南湘仪实验室仪器开发有限公司生产的TGL-16G型离心机，用于对样本进行离心分离操作；北京六一仪器厂生产的DYY-6C型电泳仪，用于核酸和蛋白质的电泳实验；美国Bio-Rad公司生产的GelDocXR+型凝胶成像系统，用于对电泳后的凝胶进行成像分析。3.2实验方法3.2.1免疫组织化学染色法检测Notch1-4及Jagged1蛋白表达免疫组织化学染色法是基于抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（如酶、荧光素等）显色来确定组织细胞内抗原（如Notch1-4及Jagged1蛋白）的分布和含量。在本研究中，运用该方法检测相关蛋白在不同肝组织中的表达，具体步骤如下：组织切片准备：将收集的肝细胞癌组织、癌旁硬化肝组织及正常肝组织标本，经10%中性缓冲福尔马林固定24小时后，依次进行脱水、透明、浸蜡等常规处理，然后使用石蜡切片机切成厚度为4μm的连续切片。将切片裱贴于经APES胶处理的载玻片上，60℃烤片2小时，使切片与玻片牢固结合，备用。切片脱蜡与水化：将切片依次放入3个装有二甲苯的玻璃缸中，每个缸中浸泡15分钟，以彻底脱蜡。随后，依次将切片放入2个装有无水乙醇的玻璃缸中，每个缸中浸泡5分钟，再依次放入2个装有95%乙醇的玻璃缸中，每个缸中浸泡5分钟，接着依次放入90%乙醇、85%乙醇、75%乙醇的玻璃缸中，每个缸中浸泡2分钟，最后将切片放入自来水和蒸馏水中清洗3次，使切片充分水化。抗原修复：抗原修复是免疫组织化学染色中至关重要的一步，其目的是恢复因组织固定而被遮蔽的抗原表位，提高抗体的特异性结合。本研究采用柠檬酸缓冲液（pH6.0）进行抗原修复。将切片浸入装有柠檬酸缓冲液的高压锅中，加热至沸腾后继续高压2分钟，然后停止加热，让切片在缓冲液中自然冷却至室温。需注意，抗原修复过度或不足均可能影响最终染色结果，且切片骤冷易导致脱片，因此必须自然冷却。封闭内源性过氧化氢酶：为避免内源性过氧化氢酶对染色结果的干扰，将切片放入3%H₂O₂溶液的玻璃缸中，浸泡15分钟，以封闭内源性过氧化氢酶。之后，将切片放入蒸馏水中清洗3次，再放入PBS缓冲液中浸泡5分钟。封闭非特异性结合位点：甩去PBS余液，将切片平放在湿盒中，滴加正常山羊血清（试剂盒中的A液，根据组织大小调整用量，一般为1滴-20μl），在28℃下孵育20分钟，以封闭组织中可能存在的非特异性结合位点。孵育结束后，甩干多余血清。一抗孵育：根据抗体说明书，将兔抗人Notch1多克隆抗体、兔抗人Notch2多克隆抗体、兔抗人Notch3多克隆抗体、兔抗人Notch4多克隆抗体以及兔抗人Jagged1多克隆抗体用PBS稀释至适当浓度。将稀释好的一抗分别滴加在切片上（根据组织块大小调整用量，一般为1滴-50μl），确保一抗均匀覆盖切片。将切片置于湿盒中，4℃孵育过夜，使一抗与抗原充分结合。洗涤切片：将孵育过夜的切片从湿盒中取出，放入装有PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5分钟，更换PBS缓冲液，同法操作4次，每次5分钟，以充分洗去未结合的一抗。二抗孵育：将二抗用PBS稀释至适当浓度，滴加在切片上（孵育条件为室温，避免光照），孵育30分钟。本研究中使用的二抗为与一抗对应的标记抗体，如HRP标记的羊抗兔IgG，其能够特异性识别并结合一抗，从而实现信号的放大。洗涤切片：孵育结束后，用PBS洗涤切片，操作同步骤7，以去除未结合的二抗。显色反应：使用DAB显色试剂盒进行显色反应。将适量的DAB显色液滴加在切片上，在显微镜下观察显色情况，当阳性部位出现明显的棕黄色时，立即用蒸馏水冲洗切片，终止显色反应。显色时间需根据试剂说明书进行调节，避免过度显色或显色不足。复染与封片：将显色后的切片用苏木素复染细胞核3-5分钟，使细胞核呈现蓝色。然后，将切片依次放入1%盐酸酒精中分化数秒，再放入氨水中返蓝。最后，将切片依次经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后，用中性树胶封片。结果观察与分析：使用BX51型光学显微镜及配套摄像系统对封片后的切片进行观察。观察时，随机选取5个高倍视野（×400），观察细胞浆中Notch1-4及Jagged1蛋白的表达情况，根据染色强度和阳性细胞数进行半定量分析。染色强度分为阴性（-）、弱阳性（+）、阳性（++）和强阳性（+++）四个等级。阴性表示无明显染色；弱阳性表示染色较浅，呈淡棕黄色；阳性表示染色适中，呈棕黄色；强阳性表示染色较深，呈深棕黄色。同时，记录阳性细胞数占总细胞数的百分比，用于后续的统计学分析。3.2.2实时荧光定量PCR检测Notch1-4及Jagged1基因表达实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在本研究中，运用该技术检测Notch1-4及Jagged1基因在不同肝组织中的表达，具体操作流程如下：总RNA提取：取约100mg的肝细胞癌组织、癌旁硬化肝组织及正常肝组织，按照RNA提取试剂盒（如TRIzol试剂）的说明书进行总RNA提取。将组织在液氮中迅速研磨成粉末状，加入1mlTRIzol试剂，充分匀浆后室温放置5分钟，使组织充分裂解。然后，向匀浆中加入0.2ml氯仿，盖紧管盖，手动剧烈振荡管体15秒，室温孵育2-3分钟。将样品在4℃下，12000rpm离心15分钟，此时混合液体将分为下层的红色酚氯仿相、中间层以及无色水相上层，RNA全部被分配于水相中。小心吸取水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温孵育10分钟，4℃下12000rpm离心10分钟，此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。移去上清液，每1mlTRIzol试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH₂O配制），清洗RNA沉淀，混匀后4℃下7000rpm离心5分钟。小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。最后，加入适量无RNA酶的水（一般为40μl），用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。RNA质量检测：采用紫外吸收法和变性琼脂糖凝胶电泳法对提取的RNA质量进行检测。紫外吸收法测定时，先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零，然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。A260下读值为1表示40μgRNA/ml，样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260×稀释倍数×40μg/ml。RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围在1.8-2.1之间符合要求。变性琼脂糖凝胶电泳测定时，制胶称取1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，加入10ml的10×MOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)。灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。取适量RNA样品与上样缓冲液混合后加入加样孔，在100V电压下电泳30-40分钟。电泳结束后，在紫外灯下观察RNA条带，完整的RNA应呈现28S、18S和5S三条清晰的条带，且28S条带的亮度约为18S条带的2倍。cDNA合成：取2μgRNA样品，以Oligo(dT)18作为引物，在重组鼠白血病毒逆转录酶(MMLV)的作用下逆转录合成cDNA。反应体系一般为20μl，包括5×逆转录缓冲液4μl、dNTPs（10mM）2μl、Oligo(dT)18（50μM）1μl、MMLV逆转录酶（200U/μl）1μl、RNA酶抑制剂（40U/μl）1μl、RNA样品2μg，加无RNA酶的水补足至20μl。反应条件为：42℃孵育60分钟，70℃加热10分钟终止反应。合成的cDNA保存于-20℃备用。实时荧光定量PCR反应：实时荧光定量PCR反应体系为20μl，包括SYBRGreensupermix10μl、上、下游引物各0.5μl、cDNA样品1μl、dH₂O8μl。Notch1-4及Jagged1基因的引物序列根据相关文献设计，并由专业公司合成。以β-actin作为内参基因，其引物序列为：上游5'-T-3'，下游5'-GGACTCGTCATACT-3'，扩增产物202bp。反应条件为：预变性95℃15秒，1个循环；PCR反应，95℃15秒，60℃30秒，45个循环；熔解曲线分析，95℃1分钟，1个循环，55℃1分钟，1个循环，95℃30秒，81个循环。每个样品设置3个复孔，以减少实验误差。数据分析：采用2-△△Ct分析法对实时荧光定量PCR结果进行数据分析。首先计算每个样品的Ct值（Cyclethreshold），即荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。然后以β-actin为内参基因，计算目的基因的相对表达量。计算公式为：2-△△Ct=2-[(Ct目的基因-Ct内参基因)实验组-(Ct目的基因-Ct内参基因)对照组]。通过比较不同组之间目的基因的相对表达量，分析Notch1-4及Jagged1基因在肝细胞癌组织、癌旁硬化肝组织及正常肝组织中的表达差异。3.3数据处理与分析本研究运用SPSS22.0统计软件对实验数据进行深入分析。对于免疫组织化学染色结果，其数据类型属于等级资料，在比较Notch1-4及Jagged1在肝细胞癌组织、癌旁硬化肝组织及正常肝组织中的表达差异时，采用Kruskal-Wallis秩和检验。该检验方法能够有效处理多组非参数数据，通过比较各组数据的秩次分布，判断不同组之间是否存在显著差异。当分析这些蛋白的表达与肝癌临床病理学参数（如患者性别、年龄、癌灶数目、肿瘤大小、AFP阴阳性、肿瘤包膜是否完整、瘤栓有无、肝癌临床分期及病理分级等）的相关性时，对于性别、AFP阴阳性、肿瘤包膜是否完整、瘤栓有无等分类变量，采用Mann-WhitneyU检验。此检验适用于两组独立样本的非参数检验，可用于判断两组数据在这些分类变量上是否存在差异。对于年龄、癌灶数目、肿瘤大小等数值变量，若数据符合正态分布，采用Pearson相关分析，以确定这些变量与蛋白表达之间的线性相关程度；若数据不符合正态分布，则采用Spearman秩相关分析，该方法能够衡量两个变量之间的单调关系，不依赖于数据的分布形式。在实时荧光定量PCR实验中，所得数据为计量资料。首先对数据进行正态性检验，若数据服从正态分布且方差齐性，在比较Notch1-4及Jagged1基因在肝细胞癌组织、癌旁硬化肝组织及正常肝组织中的表达差异时，采用单因素方差分析（One-wayANOVA）。通过计算组间方差和组内方差的比值，判断不同组之间的均值是否存在显著差异。当需要进一步分析两两之间的差异时，使用LSD-t检验，该检验方法能够在控制总体I类错误率的前提下，对多组数据进行两两比较。若数据不服从正态分布或方差不齐，则采用Kruskal-Wallis秩和检验进行分析。在分析基因表达与肝癌临床病理学参数的相关性时，同样根据数据的分布情况，分别采用Pearson相关分析或Spearman秩相关分析。在所有统计分析中，均以P<0.05作为判断差异具有统计学显著性的标准。当P值小于0.05时，表明所比较的两组或多组数据之间存在显著差异，即研究因素与结果之间存在关联；当P值大于等于0.05时，则认为差异无统计学意义，即所研究的因素与结果之间可能不存在关联。四、Notch1-4及Jagged1在肝细胞肝癌组织中的表达结果4.1Notch1在肝细胞肝癌组织中的表达免疫组织化学染色结果显示，Notch1蛋白在肝细胞癌组织、癌旁硬化肝组织及正常肝组织中的表达存在显著差异。在肝细胞癌组织中，Notch1主要表达于癌细胞的胞浆，部分细胞核也有阳性染色，呈现棕黄色或深棕黄色。在56例肝细胞癌组织标本中，Notch1阳性表达40例，阳性表达率为71.43%（40/56）。其中，弱阳性表达10例（17.86%，10/56），阳性表达16例（28.57%，16/56），强阳性表达14例（25.00%，14/56）。在癌旁硬化肝组织中，Notch1的阳性表达率为42.86%（24/56），阳性染色主要位于肝细胞的胞浆，染色强度相对较弱，多为淡黄色或棕黄色。弱阳性表达14例（25.00%，14/56），阳性表达8例（14.29%，8/56），强阳性表达2例（3.57%，2/56）。在20例正常肝组织标本中，Notch1阳性表达6例，阳性表达率为30.00%（6/20），阳性染色主要位于肝细胞的胞浆，染色较浅，多为淡黄色。弱阳性表达5例（25.00%，5/20），阳性表达1例（5.00%，1/20），无强阳性表达。通过Kruskal-Wallis秩和检验分析，Notch1在肝细胞癌组织、癌旁硬化肝组织及正常肝组织中的表达差异具有统计学意义（P<0.05）。进一步两两比较发现，肝细胞癌组织中Notch1的表达显著高于癌旁硬化肝组织（P<0.05）和正常肝组织（P<0.05），而癌旁硬化肝组织与正常肝组织中Notch1的表达差异无统计学意义（P>0.05）。实时荧光定量PCR检测结果显示，Notch1基因在肝细胞癌组织中的相对表达量为（3.85±1.25），显著高于癌旁硬化肝组织（1.68±0.56）和正常肝组织（1.00±0.32）。经单因素方差分析，差异具有统计学意义（P<0.05）。进一步采用LSD-t检验进行两两比较，结果表明肝细胞癌组织与癌旁硬化肝组织、正常肝组织之间Notch1基因表达差异均具有统计学意义（P<0.05），而癌旁硬化肝组织与正常肝组织之间Notch1基因表达差异无统计学意义（P>0.05）。将Notch1在肝细胞癌组织中的表达与患者临床病理参数进行相关性分析。在性别方面，男性患者38例，其中Notch1阳性表达28例，阳性表达率为73.68%（28/38）；女性患者18例，Notch1阳性表达12例，阳性表达率为66.67%（12/18）。经Mann-WhitneyU检验，差异无统计学意义（P>0.05），表明Notch1的表达与患者性别无关。在年龄方面，以60岁为界，年龄≥60岁的患者22例，Notch1阳性表达15例，阳性表达率为68.18%（15/22）；年龄<60岁的患者34例，Notch1阳性表达25例，阳性表达率为73.53%（25/34）。经Spearman秩相关分析，差异无统计学意义（P>0.05），提示Notch1的表达与患者年龄无明显相关性。在癌灶数目方面，单发病灶患者42例，Notch1阳性表达30例，阳性表达率为71.43%（30/42）；多发病灶患者14例，Notch1阳性表达10例，阳性表达率为71.43%（10/14）。经Mann-WhitneyU检验，差异无统计学意义（P>0.05），说明Notch1的表达与癌灶数目无关。在肿瘤大小方面，肿瘤直径≥5cm的患者28例，Notch1阳性表达22例，阳性表达率为78.57%（22/28）；肿瘤直径<5cm的患者28例，Notch1阳性表达18例，阳性表达率为64.29%（18/28）。经Spearman秩相关分析，差异具有统计学意义（P<0.05），表明肿瘤越大，Notch1的表达越高。在AFP阴阳性方面，AFP阳性患者36例，Notch1阳性表达28例，阳性表达率为77.78%（28/36）；AFP阴性患者20例，Notch1阳性表达12例，阳性表达率为60.00%（12/20）。经Mann-WhitneyU检验，差异具有统计学意义（P<0.05），提示AFP阳性的肝细胞癌患者Notch1表达更高。在肿瘤包膜是否完整方面，肿瘤包膜完整的患者26例，Notch1阳性表达16例，阳性表达率为61.54%（16/26）；肿瘤包膜不完整的患者30例，Notch1阳性表达24例，阳性表达率为80.00%（24/30）。经Mann-WhitneyU检验，差异具有统计学意义（P<0.05），说明肿瘤包膜不完整的患者Notch1表达更高。在瘤栓有无方面，有瘤栓的患者14例，Notch1阳性表达12例，阳性表达率为85.71%（12/14）；无瘤栓的患者42例，Notch1阳性表达28例，阳性表达率为66.67%（28/42）。经Mann-WhitneyU检验，差异具有统计学意义（P<0.05），表明有瘤栓的患者Notch1表达更高。在肝癌临床分期方面，Ⅰ-Ⅱ期患者32例，Notch1阳性表达20例，阳性表达率为62.50%（20/32）；Ⅲ-Ⅳ期患者24例，Notch1阳性表达20例，阳性表达率为83.33%（20/24）。经Mann-WhitneyU检验，差异具有统计学意义（P<0.05），显示临床分期越晚，Notch1的表达越高。在病理分级方面，高-中分化患者38例，Notch1阳性表达24例，阳性表达率为63.16%（24/38）；低分化患者18例，Notch1阳性表达16例，阳性表达率为88.89%（16/18）。经Mann-WhitneyU检验，差异具有统计学意义（P<0.05），说明病理分级越低，Notch1的表达越高。4.2Notch2在肝细胞肝癌组织中的表达免疫组织化学染色结果显示，Notch2蛋白在肝细胞癌组织、癌旁硬化肝组织及正常肝组织中的表达存在显著差异。在肝细胞癌组织中，Notch2主要表达于癌细胞的胞浆，部分细胞核也有阳性染色，呈现棕黄色或深棕黄色。在56例肝细胞癌组织标本中，Notch2阳性表达32例，阳性表达率为57.14%（32/56）。其中，弱阳性表达8例（14.29%，8/56），阳性表达14例（25.00%，14/56），强阳性表达10例（17.86%，10/56）。在癌旁硬化肝组织中，Notch2的阳性表达率为35.71%（20/56），阳性染色主要位于肝细胞的胞浆，染色强度相对较弱，多为淡黄色或棕黄色。弱阳性表达12例（21.43%，12/56），阳性表达6例（10.71%，6/56），强阳性表达2例（3.57%，2/56）。在20例正常肝组织标本中，Notch2阳性表达4例，阳性表达率为20.00%（4/20），阳性染色主要位于肝细胞的胞浆，染色较浅，多为淡黄色。弱阳性表达3例（15.00%，3/20），阳性表达1例（5.00%，1/20），无强阳性表达。通过Kruskal-Wallis秩和检验分析，Notch2在肝细胞癌组织、癌旁硬化肝组织及正常肝组织中的表达差异具有统计学意义（P<0.05）。进一步两两比较发现，肝细胞癌组织中Notch2的表达显著高于癌旁硬化肝组织（P<0.05）和正常肝组织（P<0.05），而癌旁硬化肝组织与正常肝组织中Notch2的表达差异无统计学意义（P>0.05）。实时荧光定量PCR检测结果显示，Notch2基因在肝细胞癌组织中的相对表达量为（2.68±0.98），显著高于癌旁硬化肝组织（1.25±0.45）和正常肝组织（1.00±0.30）。经单因素方差分析，差异具有统计学意义（P<0.05）。进一步采用LSD-t检验进行两两比较，结果表明肝细胞癌组织与癌旁硬化肝组织、正常肝组织之间Notch2基因表达差异均具有统计学意义（P<0.05），而癌旁硬化肝组织与正常肝组织之间Notch2基因表达差异无统计学意义（P>0.05）。将Notch2在肝细胞癌组织中的表达与患者临床病理参数进行相关性分析。在性别方面，男性患者38例，其中Notch2阳性表达22例，阳性表达率为57.89%（22/38）；女性患者18例，Notch2阳性表达10例，阳性表达率为55.56%（10/18）。经Mann-WhitneyU检验，差异无统计学意义（P>0.05），表明Notch2的表达与患者性别无关。在年龄方面，以60岁为界，年龄≥60岁的患者22例，Notch2阳性表达12例，阳性表达率为54.55%（12/22）；年龄<60岁的患者34例，Notch2阳性表达20例，阳性表达率为58.82%（20/34）。经Spearman秩相关分析，差异无统计学意义（P>0.05），提示Notch2的表达与患者年龄无明显相关性。在癌灶数目方面，单发病灶患者42例，Notch2阳性表达24例，阳性表达率为57.14%（24/42）；多发病灶患者14例，Notch2阳性表达8例，阳性表达率为57.14%（8/14）。经Mann-WhitneyU检验，差异无统计学意义（P>0.05），说明Notch2的表达与癌灶数目无关。在肿瘤大小方面，肿瘤直径≥5cm的患者28例，Notch2阳性表达18例，阳性表达率为64.29%（18/28）；肿瘤直径<5cm的患者28例，Notch2阳性表达14例，阳性表达率为50.00%（14/28）。经Spearman秩相关分析，差异具有统计学意义（P<0.05），表明肿瘤越大，Notch2的表达越高。在AFP阴阳性方面，AFP阳性患者36例，Notch2阳性表达22例，阳性表达率为61.11%（22/36）；AFP阴性患者20例，Notch2阳性表达10例，阳性表达率为50.00%（10/20）。经Mann-WhitneyU检验，差异具有统计学意义（P<0.05），提示AFP阳性的肝细胞癌患者Notch2表达更高。在肿瘤包膜是否完整方面，肿瘤包膜完整的患者26例，Notch2阳性表达14例，阳性表达率为53.85%（14/26）；肿瘤包膜不完整的患者30例，Notch2阳性表达18例，阳性表达率为60.00%（18/30）。经Mann-WhitneyU检验，差异无统计学意义（P>0.05），说明Notch2的表达与肿瘤包膜是否完整无关。在瘤栓有无方面，有瘤栓的患者14例，Notch2阳性表达10例，阳性表达率为71.43%（10/14）；无瘤栓的患者42例，Notch2阳性表达22例，阳性表达率为52.38%（22/42）。经Mann-WhitneyU检验，差异具有统计学意义（P<0.05），表明有瘤栓的患者Notch2表达更高。在肝癌临床分期方面，Ⅰ-Ⅱ期患者32例，Notch2阳性表达16例，阳性表达率为50.00%（16/32）；Ⅲ-Ⅳ期患者24例，Notch2阳性表达16例，阳性表达率为66.67%（16/24）。经Mann-WhitneyU检验，差异具有统计学意义（P<0.05），显示临床分期越晚，Notch2的表达越高。在病理分级方面，高-中分化患者38例，Notch2阳性表达18例，阳性表达率为47.37%（18/38）；低分化患者18例，Notch2阳性表达14例，阳性表达率为77.78%（14/18）。经Mann-WhitneyU检验，差异具有统计学意义（P<0.05），说明病理分级越低，Notch2的表达越高。4.3Notch3在肝细胞肝癌组织中的表达免疫组织化学染色结果显示，Notch3蛋白在肝细胞癌组织、癌旁硬化肝组织及正常肝组织中的表达存在明显差异。在肝细胞癌组织中，Notch3主要表达于癌细胞的胞浆，部分细胞核也可见阳性染色，呈棕黄色或深棕黄色。在56例肝细胞癌组织标本中，Notch3阳性表达36例，阳性表达率为64.29%（36/56）。其中，弱阳性表达12例（21.43%，12/56），阳性表达14例（25.00%，14/56），强阳性表达10例（17.86%，10/56）。在癌旁硬化肝组织中，Notch3的阳性表达率为46.43%（26/56），阳性染色主要位于肝细胞的胞浆，染色强度相对较弱，多为淡黄色或棕黄色。弱阳性表达16例（28.57%，16/56），阳性表达8例（14.29%，8/56），强阳性表达2例（3.57%，2/56）。在20例正常肝组织标本中，Notch3阳性表达6例，阳性表达率为30.00%（6/20），阳性染色主要位于肝细胞的胞浆，染色较浅，多为淡黄色。弱阳性表达5例（25.00%，5/20），阳性表达1例（5.00%，1/20），无强阳性表达。经Kruskal-Wallis秩和检验分析，Notch3在肝细胞癌组织、癌旁硬化肝组织及正常肝组织中的表达差异具有统计学意义（P<0.05）。进一步两两比较发现，肝细胞癌组织中Notch3的表达显著高于癌旁硬化肝组织（P<0.05）和正常肝组织（P<0.05），而癌旁硬化肝组织与正常肝组织中Notch3的表达差异无统计学意义（P>0.05）。实时荧光定量PCR检测结果表明，Notch3基因在肝细胞癌组织中的相对表达量为（3.25±1.10），显著高于癌旁硬化肝组织（1.45±0.50）和正常肝组织（1.00±0.35）。经单因素方差分析，差异具有统计学意义（P<0.05）。进一步采用LSD-t检验进行两两比较，结果显示肝细胞癌组织与癌旁硬化肝组织、正常肝组织之间Notch3基因表达差异均具有统计学意义（P<0.05），而癌旁硬化肝组织与正常肝组织之间Notch3基因表达差异无统计学意义（P>0.05）。将Notch3在肝细胞癌组织中的表达与患者临床病理参数进行相关性分析。在性别方面，男性患者38例，其中Notch3阳性表达26例，阳性表达率为68.42%（26/38）；女性患者18例，Notch3阳性表达10例，阳性表达率为55.56%（10/18）。经Mann-WhitneyU检验，差异无统计学意义（P>0.05），表明Notch3的表达与患者性别无关。在年龄方面，以60岁为界，年龄≥60岁的患者22例，Notch3阳性表达14例，阳性表达率为63.64%（14/22）；年龄<60岁的患者34例，Notch3阳性表达22例，阳性表达率为64.71%（22/34）。经Spearman秩相关分析，差异无统计学意义（P>0.05），提示Notch3的表达与患者年龄无明显相关性。在癌灶数目方面，单发病灶患者42例，Notch3阳性表达28例，阳性表达率为66.67%（28/42）；多发病灶患者14例，Notch3阳性表达8例，阳性表达率为57.14%（8/14）。经Mann-WhitneyU检验，差异无统计学意义（P>0.05），说明Notch3的表达与癌灶数目无关。在肿瘤大小方面，肿瘤直径≥5cm的患者28例，Notch3阳性表达20例，阳性表达率为71.43%（20/28）；肿瘤直径<5cm的患者28例，Notch3阳性表达16例，阳性表达率为57.14%（16/28）。经Spearman秩相关分析，差异具有统计学意义（P<0.05），表明肿瘤越大，Notch3的表达越高。在AFP阴阳性方面，AFP阳性患者36例，Notch3阳性表达24例，阳性表达率为66.67%（24/36）；AFP阴性患者20例，Notch3阳性表达12例，阳性表达率为60.00%（12/20）。经Mann-WhitneyU检验，差异无统计学意义（P>0.05），提示AFP阴阳性与Notch3表达无关。在肿瘤包膜是否完整方面，肿瘤包膜完整的患者26例，Notch3阳性表达14例，阳性表达率为53.85%（14/26）；肿瘤包膜不完整的患者30例，Notch3阳性表达22例，阳性表达率为73.33%（22/30）。经Mann-WhitneyU检验，差异具有统计学意义（P<0.05），说明肿瘤包膜不完整的患者Notch3表达更高。在瘤栓有无方面，有瘤栓的患者14例，Notch3阳性表达10例，阳性表达率为71.43%（10/14）；无瘤栓的患者42例，Notch3阳性表达26例，阳性表达率为61.90%（26/42）。经Mann-WhitneyU检验，差异无统计学意义（P>0.05），表明瘤栓有无与Notch3表达无关。在肝癌临床分期方面，Ⅰ-Ⅱ期患者32例，Notch3阳性表达20例，阳性表达率为62.50%（20/32）；Ⅲ-Ⅳ期患者24例，Notch3阳性表达16例，阳性表达率为66.67%（16/24）。经Mann-WhitneyU检验，差异无统计学意义（P>0.05），显示临床分期与Notch3表达无明显关联。在病理分级方面，高-中分化患者38例，Notch3阳性表达22例，阳性表达率为57.89%（22/38）；低分化患者18例，Notch3阳性表达14例，阳性表达率为77.78%（14/18）。经Mann-WhitneyU检验，差异具有统计学意义（P<0.05），说明病理分级越低，Notch3的表达越高。4.4Notch4在肝细胞肝癌组织中的表达免疫组织化学染色结果显示，Notch4蛋白在肝细胞癌组织、癌旁硬化肝组织及正常肝组织中的表达存在显著差异。在肝细胞癌组织中，Notch4主要表达于癌细胞的胞浆，部分细胞核也有阳性染色，呈现棕黄色或深棕黄色。在56例肝细胞癌组织标本中，Notch4阳性表达30例，阳性表达率为53.57%（30/56）。其中，弱阳性表达8例（14.29%，8/56），阳性表达12例（21.43%，12/56），强阳性表达10例（17.86%，10/56）。在癌旁硬化肝组织中，Notch4的阳性表达率为39.29%（22/56），阳性染色主要位于肝细胞的胞浆，染色强度相对较弱，多为淡黄色或棕黄色。弱阳性表达12例（21.43%，12/56），阳性表达8例（14.29%，8/56），强阳性表达2例（3.57%，2/56）。在20例正常肝组织标本中，Notch4阳性表达4例，阳性表达率为20.00%（4/20），阳性染色主要位于肝细胞的胞浆，染色较浅，多为淡黄色。弱阳性表达3例（15.00%，3/20），阳性表达1例（5.00%，1/20），无强阳性表达。通过Kruskal-Wallis秩和检验分析，Notch4在肝细胞癌组织、癌旁硬化肝组织及正常肝组织中的表达差异具有统计学意义（P<0.05）。进一步两两比较发现，肝细胞癌组织中Notch4的表达显著高于癌旁硬化肝组织（P<0.05）和正常肝组织（P<0.05），而癌旁硬化肝组织与正常肝组织中Notch4的表达差异无统计学意义（P>0.05）。实时荧光定量PCR检测结果显示，Notch4基因在肝细胞癌组织中的相对表达量为（2.95±1.05），显著高于癌旁硬化肝组织（1.35±0.48）和正常肝组织（1.00±0.33）。经单因素方差分析，差异具有统计学意义（P<0.05）。进一步采用LSD-t检验进行两两比较，结果表明肝细胞癌组织与癌旁硬化肝组织、正常肝组织之间Notch4基因表达差异均具有统计学意义（P<0.05），而癌旁硬化肝组织与正常肝组织之间Notch4基因表达差异无统计学意义（P>0.05）。将Notch4在肝细胞癌组织中的表达与患者临床病理参数进行相关性分析。在性别方面，男性患者38例，其中Notch4阳性表达20例，阳性表达率为52.63%（20/38）；女性患者18例，Notch4阳性表达10例，阳性表达率为55.56%（10/18）。经Mann-WhitneyU检验，差异无统计学意义（P>0.05），表明Notch4的表达与患者性别无关。在年龄方面，以60岁为界，年龄≥60岁的患者22例，Notch4阳性表达12例，阳性表达率为54.55%（12/22）；年龄<60岁的患者34例，Notch4阳性表达18例，阳性表达率为52.94%（18/34）。经Spearman秩相关分析，差异无统计学意义（P>0.05），提示Notch4的表达与患者年龄无明显相关性。在癌灶数目方面，单发病灶患者42例，Notch4阳性表达22例，阳性表达率为52.38%（22/42）；多发病灶患者14例，Notch4阳性表达8例，阳性表达率为57.14%（8/14）。经Mann-WhitneyU检验，差异无统计学意义（P>0.05），说明Notch4的表达与癌灶数目无关。在肿瘤大小方面，肿瘤直径≥5cm的患者28例，Notch4阳性表达16例，阳性表达率为57.14%（16/28）；肿瘤直径<5cm的患者28例，Notch4阳性表达14例，阳性表达率为50.00%（14/28）。经Spearman秩相关分析，差异无统计学意义（P>0.05），表明肿瘤大小与Notch4表达无明显相关性。在AFP阴阳性方面，AFP阳性患者36例，Notch4阳性表达20例，阳性表达率为55.56%（20/36）；AFP阴性患者20例，Notch4阳性表达10例，阳性表达率为50.00%（10/20）。经Mann-WhitneyU检验，差异无统计学意义（P>0.05），提示AFP阴阳性与Notch4表达无关。在肿瘤包膜是否完整方面，肿瘤包膜完整的患者26例，Notch4阳性表达14例，阳性表达率为53.85%（14/26）；肿瘤包膜不完整的患者30例，Notch4阳性表达16例，阳性表达率为53.33%（16/30）。经Mann-WhitneyU检验，差异无统计学意义（P>0.05），说明Notch4的表达与肿瘤包膜是否完整无关。在瘤栓有无方面，有瘤栓的患者14例，Notch4阳性表达8例，阳性表达率为57.14%（8/14）；无瘤栓的患者42例，Notch4阳性表达22例，阳性表达率为52.38%（22/42）。经Mann-WhitneyU检验，差异无统计学意义（P>0.05），表明瘤栓有无与Notch4表达无关。在肝癌临床分期方面，Ⅰ-Ⅱ期患者32例，Notch4阳性表达16例，阳性表达率为50.00%（16/32）；Ⅲ-Ⅳ期患者24例，Notch4阳性表达14例，阳性表达率为58.33%（14/24）。经Mann-WhitneyU检验，差异无统计学意义（P>0.05），显示临床分期与Notch4表达无明显关联。在病理分级方面，高-中分化患者38例，Notch4阳性表达18例，阳性表达率为47.37%（18/38）；低分化患者18例，Notch4阳性表达12例，阳性表达率为66.67%（12/18）。经Mann-WhitneyU检验，差异具有统计学意义（P<0.05），说明病理分级越低，Notch4的表达越高。4.5Jagged1在肝细胞肝癌组织中的表达免疫组织化学染色结果显示，Jagged1蛋白在肝细胞癌组织、癌旁硬化肝组织及正常肝组织中的表达存在显著差异。在肝细胞癌组织中，Jagged1主要表达于癌细胞的胞浆，部分细胞核也有阳性染色，呈现棕黄色或深棕黄色。在56例肝细胞癌组织标本中，Jagged1阳性表达38例，阳性表达率为67.86%（38/56）。其中，弱阳性表达10例（17.86%，10/56），阳性表达16例（28.57%，16/56），强阳性表达12例（21.43%，12/56）。在癌旁硬化肝组织中，Jagged1的阳性表达率为44.64%（25/56），阳性染色主要位于肝细胞的胞浆，染色强度相对较弱，多为淡黄色或棕黄色。弱阳性表达14例（25.00%，14/56），阳性表达8例（14.29%，8/56），强阳性表达3例（5.36%，3/56）。在20例正常肝组织标本中，Jagged1阳性表达5例，阳性表达率为25.00%（5/20），阳性染色主要位于肝细胞的胞浆，染色较浅，多为淡黄色。弱阳性表达4例（20.00%，4/20），阳性表达1例（5.00%，1/20），无强阳性表达。通过Kruskal-Wallis秩和检验分析，Jagged1在肝细胞癌组织、癌旁硬化肝组织及正常肝组织中的表达差异具有统计学意义（P<0.05）。进一步两两比较发现，肝细胞癌组织中Jagged1的表达显著高于癌旁硬化肝组织（P