医学生物实验常用技术

医学生物实验常用技术日期:演讲人：目录01细胞培养技术02分子生物学技术03免疫学实验方法04显微镜与成像技术05生物信息学分析06动物模型实验细胞培养技术01无菌操作规范实验环境消毒细胞培养需在超净工作台或生物安全柜中进行，实验前需用75%乙醇擦拭台面及器械，并开启紫外线照射30分钟以上以灭菌。个人防护措施操作者需穿戴无菌手套、口罩及实验服，避免说话或咳嗽污染样本，所有操作需在酒精灯火焰旁进行以减少空气污染风险。器械灭菌管理金属器械（如镊子、剪刀）需高温高压灭菌，塑料耗材（如移液管、培养皿）需使用一次性无菌包装产品，避免交叉污染。培养基配制方法基础培养基选择过滤与分装添加剂与缓冲液根据细胞类型选择DMEM、RPMI-1640或MEM等培养基，添加10-20%胎牛血清（FBS）以提供生长因子和营养物质。补充1%青霉素-链霉素双抗溶液防止细菌污染，加入HEPES缓冲液（10-25mM）维持pH稳定性，必要时添加L-谷氨酰胺（2-4mM）支持细胞代谢。配制完成的培养基需通过0.22μm滤膜过滤除菌，分装至无菌瓶中并于4℃保存，使用前需预热至37℃以避免温度应激。细胞传代与冻存流程传代操作步骤弃旧培养基后用PBS清洗细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化1-5分钟，终止消化后离心收集细胞，按1:2至1:4比例分装至新培养瓶。冻存液配制使用含10%DMSO和90%FBS的冻存保护液，缓慢降温至-80℃过夜后转移至液氮罐长期保存，避免冰晶损伤细胞。复苏注意事项从液氮中取出冻存管后迅速置于37℃水浴中融化，离心去除冻存液后重悬于新鲜培养基，接种后观察24小时确认细胞活性。分子生物学技术02PCR原理与应用场景基本原理PCR（聚合酶链式反应）通过变性、退火、延伸三个步骤循环扩增目标DNA片段，依赖DNA聚合酶、引物和dNTPs完成指数级复制。诊断应用用于病原体检测（如新冠病毒、HIV）、遗传病筛查（如地中海贫血基因突变）和法医学DNA鉴定。科研应用在基因克隆、突变分析、表达量检测（qPCR）及二代测序文库构建中发挥核心作用。工业应用应用于转基因作物检测、食品安全监测（如食源性致病菌鉴定）和生物制药质控。DNA/RNA提取步骤使用含SDS的裂解液破坏膜结构，配合蛋白酶K消化蛋白质，RNA提取需额外加入RNase抑制剂。裂解阶段分离纯化质量检测组织需匀浆处理，细胞培养物需离心收集，血液样本需红细胞裂解，确保释放核酸物质。通过苯酚-氯仿抽提去除蛋白质，乙醇/异丙醇沉淀核酸，或采用硅胶膜吸附柱特异性结合核酸。用Nanodrop测定A260/A280比值评估纯度，凝胶电泳或生物分析仪检测完整性（如RNA的RIN值）。样本预处理蛋白质电泳技术SDS原理染色方法应用场景特殊电泳技术十二烷基硫酸钠使蛋白质变性并均匀带负电，聚丙烯酰胺凝胶按分子量大小分离蛋白条带。考马斯亮蓝染色适用于常规检测（灵敏度~100ng），银染色提高至1ng级，荧光染色兼容下游质谱分析。用于蛋白纯度鉴定（如抗体纯化）、分子量测定、WesternBlot前处理及差异蛋白筛选。双向电泳（2D）结合等电聚焦和SDS，可分离复杂样本中的数千种蛋白质。免疫学实验方法03ELISA检测流程包被抗原或抗体将特异性抗原或抗体固定在微孔板表面，通常使用碳酸盐缓冲液（pH9.6）进行包被，并在4℃过夜或37℃孵育2小时，以确保充分吸附。封闭非特异性结合位点使用含5%脱脂奶粉或1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS缓冲液封闭微孔板，防止后续步骤中非特异性结合导致的假阳性结果，封闭时间通常为1-2小时。加入待测样本和标准品将稀释后的待测样本和标准品加入微孔板中，孵育1小时，使目标分子与包被的抗原或抗体特异性结合，随后洗涤去除未结合物质。加入酶标二抗和底物加入与目标分子结合的酶标二抗（如HRP标记的二抗），孵育后洗涤，再加入TMB或OPD等显色底物，通过酶促反应产生颜色变化，最后用终止液终止反应并测定吸光度值。流式细胞术操作要点样本制备将细胞悬液用PBS洗涤后，调整细胞浓度至1×10^6/mL，并用70%乙醇或4%多聚甲醛固定，以保持细胞形态和抗原表位的完整性，同时避免细胞聚集影响检测结果。01抗体标记根据实验需求选择荧光标记的一抗或二抗，孵育时间通常为30分钟至1小时，避光条件下进行，以防止荧光淬灭，孵育后需用PBS充分洗涤去除未结合抗体。流式细胞仪校准在检测前需使用标准荧光微球校准仪器，调整PMT电压和补偿参数，确保各荧光通道的信号分离和检测灵敏度，避免光谱重叠导致的假阳性或假阴性。数据分析和解读使用FlowJo或BDFACSDiva等专业软件分析数据，通过设门策略区分目标细胞群，统计荧光阳性细胞比例和平均荧光强度（MFI），并结合生物学重复验证结果的可靠性。020304免疫组化染色技术组织切片制备：将石蜡包埋的组织切成4-5μm厚度的切片，贴附于防脱载玻片上，60℃烘烤2小时使组织牢固附着，随后进行脱蜡和水化处理以恢复组织形态。抗原修复：采用热诱导抗原修复（HIER）或酶消化法（如胰蛋白酶消化）暴露被掩蔽的抗原表位，常用柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）或EDTA缓冲液（pH8.0）进行高压修复或微波修复。阻断内源性过氧化物酶和非特异性结合：使用3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶活性，再用5%正常血清（如山羊血清）封闭非特异性结合位点，减少背景染色干扰。抗体孵育和显色：滴加一抗（如抗Ki-67或抗CD20抗体）4℃过夜或室温孵育1小时，洗涤后加入HRP标记的二抗，DAB显色后苏木素复染细胞核，最后脱水封片并在显微镜下观察结果。显微镜与成像技术04光学显微镜基础应用样本制备与观察光学显微镜适用于观察染色或未染色的生物样本，需通过切片、固定、染色等步骤优化样本对比度，如苏木精-伊红（H&E）染色用于组织学分析。相差与微分干涉（DIC）技术相差显微镜通过光程差转换相位差，可视化透明细胞结构；DIC利用偏振光干涉生成三维浮雕效果图像，常用于活细胞动态研究。明场与暗场成像明场模式下光线直接穿透样本，适合高对比度结构观察；暗场模式通过斜射光增强透明样本边缘散射光，适用于活细胞或未染色微生物观察。荧光显微镜操作规范荧光标记选择根据目标分子特性选择特异性荧光染料或抗体（如FITC、TRITC），需考虑激发/发射波长匹配、光稳定性及背景干扰控制。多色荧光成像需严格校准滤光片组和激光强度，避免通道间串扰，例如使用DAPI（蓝色）、GFP（绿色）和mCherry（红色）同步标记细胞核、胞质及特定蛋白。光漂白与光毒性管理限制曝光时间和激光功率，添加抗淬灭剂（如DABCO），并采用快速成像模式（如转盘共聚焦）以减少样本损伤。共聚焦显微镜成像原理点扫描与光学切片通过激光逐点扫描样本，结合针孔滤除离焦光信号，获取高分辨率Z轴光学切片，实现三维重构（如神经元突触结构解析）。多光子激发技术利用长波长红外激光激发深层组织荧光，减少散射和光毒性，适用于活体组织成像（如小鼠脑皮层血管动态观测）。超分辨率扩展应用结合STED（受激发射损耗）或PALM（光激活定位显微术），突破衍射极限，实现纳米级分辨率（如线粒体嵴膜结构解析）。生物信息学分析05序列比对工具使用BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）用于快速比对核酸或蛋白质序列，支持局部比对和全局比对，广泛应用于基因功能注释和进化分析。可通过调整参数（如E值、打分矩阵）优化比对结果。ClustalOmega多序列比对工具，适用于构建系统发育树和保守区域分析。支持大规模数据集处理，采用渐进比对算法提高准确性和效率。Bowtie与HISAT2专为高通量测序数据设计的短序列比对工具，适用于RNA-seq和ChIP-seq分析。通过索引参考基因组实现快速定位，支持多种输出格式（如SAM/BAM）。高通量数据解析方法RNA-seq差异表达分析单细胞测序数据聚类ChIP-seq峰值检测利用DESeq2或edgeR软件包对转录组数据进行标准化和统计检验，识别差异表达基因。需考虑批次效应校正和多重假设检验控制（如FDR）。采用MACS2或HOMER算法识别蛋白质-DNA结合位点，结合motif分析预测转录因子结合模式。需评估信号噪声比和峰值富集显著性。使用Seurat或Scanpy工具进行降维（PCA/t-SNE）和细胞亚群划分，整合Marker基因注释细胞类型。需处理稀疏数据和技术偏差。数据库检索与管理综合型生物数据库，提供GenBank、UniProt等子库，支持关键词、序列或ID检索。需掌握高级查询语法（如布尔运算符）和批量下载技巧。NCBI与EMBL-EBIKEGG与GO功能注释本地数据库构建通过通路富集分析（超几何检验）关联基因列表与生物学功能，使用DAVID或clusterProfiler工具实现可视化。需注意版本更新和物种特异性。利用MySQL或SQLite搭建定制化数据库，整合公共数据与实验数据。需设计规范化表结构并优化查询性能，配合Biopython脚本实现自动化更新。动物模型实验06动物选择与伦理准则物种匹配性原则根据实验目的选择生理结构、代谢特征与人类高度相似的动物模型，如啮齿类动物（小鼠、大鼠）用于基础研究，非人灵长类动物用于复杂疾病机制探索。伦理审查与3R原则实验方案需通过机构动物伦理委员会审批，严格遵守替代（Replacement）、减少（Reduction）和优化（Refinement）原则，确保动物福利最大化。遗传背景标准化优先选用近交系或基因编辑动物，确保遗传一致性，减少个体差异对实验结果的影响，同时需明确记录品系来源和基因型信息。手术操作与给药技术无菌操作规范手术器械需高温高压灭菌，操作环境达到百级洁净标准，术中使用抗生素冲洗液降低感染风险，术后监测切口愈合情况。精准给药方法静脉注射需控制流速避免血栓形成，腹腔注射注意避开脏器，脑内给药需通过立体定位仪确定靶区坐标，确保药物递送准确性。术中生命体征监测实时记录心率、血氧饱和度、体温等参数，采用加热垫维持动物体温，必要时使用呼吸机辅助通气，确保手术安全性