DB44∕T 868-2011 《灵芝(赤芝)菌种》

备案号：31332—2011灵芝(赤芝)菌种本标准编制依据GB/T1.1-2009《标准化工作导则第一部分：标准的结构和编写》规则起草。本标准的附录A、附录B和附录C均为资料性附录。本标准由广东省食用菌行业协会提出。本标准由广东省质量技术监督局归口。本标准起草单位：广东省食用菌行业协会、广东省微生物研究所、广东粤微食用菌技术有限公司。本标准起草人：杨小兵、吴清平、朱少琼、胡惠萍、李森柱、廖世煌、张一帆、黄龙花、邵满超、周洁莹。本标准为首次发布。灵芝(赤芝)菌种本标准适用于灵芝(赤芝)固体菌种。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T191包装储运图示标志(GB/T191,ISO780:1997,MOD)GB/T4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂完整，无损，无色透明试管总容积的五分之一至四分之一接种块大小(接种量)菌种外观菌丝体特征2表1(续)菌种外观均匀、平展、无角变、无高温抑制线菌丝分泌物无浓密、丰满、旺健，长速正常、整齐，菌丝有较多锁状联合。不得检出在CPDA(综合马铃薯葡萄糖琼脂)培养基(见附录A.1.2)上，在避光、适温(25℃±1℃)条件下，供种单位所供母种需经出菇试验确认农艺性状和商品性状等种性合格后，方可用于扩大繁殖或出售。产量性状在正常条件下，以采用附录B中提供的栽培培养基为例，总生物学效率应不低于10%。供试菌株基因组的ITS(内部转录间隔区)序列与参照菌株的ITS序列(Genbank登录号：GU213485)进行比对，相似性应达98%或以上。完整，无损接种量(每支母种接原种数，接种物大小)4瓶(袋)～6瓶(袋),≥(12mm×15mm)3表3(续)均匀、平展、无角变、无高温抑制线、均匀紧贴瓶(袋)壁、无干缩无无无无在适宜培养基上、适宜培养容器里(以附录A.2.1为配方、使用13cm×26量每袋200g干料为例),在避光、适温(25℃±1℃)条件下，菌丝长速为8.0mm/d±0.8mm/d,菌丝长满容器的时间为16d～22d。完整，无损接种量[每瓶(袋)原种接栽培种数]30瓶(袋)～50瓶(袋)菌种外观菌丝体特征生长齐整，色泽一致，无角变，无高温抑制线紧贴瓶(袋)壁、无干缩无无无4在适宜培养基上、适宜培养容器里(以附录A.2.3为配方、使量每袋400g干料为例),在避光、适温(25℃±1℃)条件下，菌丝长速为6.7mm/d±0.8mm/d,菌丝按表5逐项进行检验项目检验项目肉眼观察母种、原种肉眼观察、测量栽培种肉眼观察培养基上表面距瓶(袋)口的肉眼观察菌种外观各项(杂菌菌落除外)肉眼观察肉眼观察，必要时用5×放大肉眼观察用放大倍数不低于400倍的光学显微镜对培养物的水封片进行观察，每一检样应观察不少于50个视℃~38℃避光震荡培养1d,观察培养液是否混浊。培养液混浊，为有细菌污染；培养液澄清，为无细取少量疑有霉菌污染的培养物或菌块，按无菌操作接种于PDA培养基(见附录A中A.1.1)中，25℃~28℃避光培养3d～4d,出现白色以外色泽的菌落或非灵芝菌丝形态菌落的，或出现异味者为霉菌污染5参考附录A中A.1的配方，可任选其一，25℃±1℃避光培养，以划线记录法每隔24h在容器表面记录菌丝前沿位置，换算出菌丝生长速度。记录菌丝长满培养基表面所需天数(d)。参考附录A中A.2的配方，可任选其一，25℃±1℃避光培养，以划线记录法每隔24h在容器表面记将被检母种制成原种，再制成栽培种。参考附录B规定的培养基配方，采用熟料袋栽栽培方法，制作三组(每组平均不少于50袋)合共不少于150袋菇包，菇包大小按NY/T528相关规定执行。三组在同一菇房内进行栽培。接种后进行符合灵芝生长条件的常规管理。在首潮灵摘30个子实体测定生物学效率。根据表6所列项目，做好栽培记录，统计检验结果。同时将该母种的出间较对照菌株推迟5d以上(含5d)者，为不合格；产量显著低于对照菌株者，为不合格；子实体外观检验项目检验项目母种长满所需时间(d)原种长满所需时间(d)菌丝长满培养基料面所需时间(d)总生物学效率(%)出第一潮菇所需时间(d)第一潮菇生物学效率(%)芝形平均单产(g/袋)芝盖尺寸(mm)各级菌种都要留样备查，留样的数量应每个批号菌种3支(瓶、袋)～5支(瓶、袋),于避光、4℃~6℃下储存，储存期母种为3个月，原种为2个月，栽培种为1个月。菌种量的10%、5%、1%。但每批抽样数量不得少于10支(瓶、袋);若一级抽样超过100支(瓶、袋)66.2判定规则每支(瓶、袋)菌种应贴(印)有清晰注明以下内容的标签：a)产品名称(如：灵芝母种);b)品种名称(如：赤芝02);c)生产单位(如：××菌种厂);每箱(或其它包装单位)菌种必须贴有清晰注明以下要素的包装标签：7DB44/T868—2011外包装可采用洁净、干燥的塑料箱、编织袋或有足够强度的纸箱，7.3.1不得与有毒品混装、混运。7.3.2气温达30℃或以上时，需用4℃~15℃冷藏车运输，运输时间不得超过7d。7.3.3运输中必须有防震、防晒、防尘、防雨淋、防冻、防杂菌污染的措施。用于转管保藏的母种，在4℃~6℃避光保藏不超过6个月；母种至使用时，在4℃~6℃避光保藏不超过90d;至销售时，在4℃~6℃避光保藏不超过80d。原种应尽快使用，在温度不超过30℃、清洁、干燥、通风(空气相对湿度50%～70%)、避光的室内存放不超过7d,在4℃~6℃下贮存时，贮存期不超过30d。栽培种应尽快使用，在温度不超过30℃、清洁、干燥、通风(空气相对湿度50%～70%)、避光的室内存放不超过7d,在4℃~6℃下贮存时，贮存期不超过30d。8(资料性附录)A.1.1PDA培养基(1000mL)马铃薯(去皮)200g,葡萄糖20g,琼脂20g,水1000mL,pH自然。马铃薯(去皮)200g,葡萄糖20g,磷酸二氢钾2g,硫酸镁0.5g,琼脂20g,维生素B₁20μg,水A.2.1颗粒培养基高粱80%、小米19%、轻质碳酸钙1%。高粱用水煮熟至掰开无白心，沥去多余水分；小米使用前浸泡12小时，沥去多余水分；高粱、小米和轻质碳酸棉籽壳80%、麦麸19%、轻质碳酸钙1%。三者混合拌匀，加水至培养料含水量达60%～65%,pH阔叶木杂木屑78%、麸皮20%、轻质碳酸钙2%。三者混合拌匀，加水至培养料含水量达60%～65%,9(资料性附录)灵芝栽培常用培养基B.1阔叶木杂木屑培养基阔叶木杂木屑78%、麸皮20%、轻质碳酸钙2%。三者混合拌匀，加水至培养料含水量达60%～65%,(资料性附录)灵芝菌种ITS序列分析法待测菌种CYM液体培养基配方：蛋白胨2g,酵母膏2g,葡萄糖20g,硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5g,磷酸氢二钾(K₂HPO₄)1g,磷酸二氢钾(KH₂PO₄)1g,纯水1000mL,pH自然。培养基分装至三个500mL角瓶后灭菌，冷却，接种，置于25℃130r/min摇床培养至菌丝生长平台期。菌丝真空抽滤，无菌水洗涤，低温干燥，-CTAB(CetylTrimethylAmma)2倍CTAB提取液在65℃在水浴锅中预热。烯基吡咯烷酮(PVP)防氧化，将菌丝体充分研磨成c)样品转入1.5ml离心管中，管内先加入600μL2倍CTAB提取液在65℃水浴锅中预热(用少量提取液洗下研钵上残留的粉末样品，轻轻混匀，在65℃中水浴30min～60min,其间每隔d)冷却2min后，加入等体积(约600μL)的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),充分摇动混匀。e)以约11000×g,离心10min,取上清液移入另一新1.5ml离心管，重复步骤d)操作，用氯仿/异戊醇(24:1)再抽提离心一次。同时将2/3体积的异丙醇(或2倍体积的无水乙醇)预冷。f)两次抽提后的上清液转入新离心管，加入2/3体积的预冷异丙醇(或2倍体积的预冷无水乙醇),再加入约1/10体积的乙酸钠(约30μL～50μL),缓慢翻转混匀，沉淀DNA。g)以约18000×g,离心15min,弃上清液。70%酒精(400μL)漂洗沉淀2次(快速翻转振荡几分钟),以约7000×g,离心5min,弃上清液，沉淀用纸巾吸取剩余乙醇，自然晾干或低温烘干(电风筒吹干)。h)加1倍TE缓冲液(Tris10mmol/L+EDTA1mmol/L)溶解(约50μL)。-20℃保存备用。采用真菌核糖体基因间隔区通用引物对ITS1/ITS4(ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG;ITS4:反应体系：PCRTaqmix(2×)25μL,DNA模板5μg,通用引物(10μM)各4μL,以无菌双蒸反应条件：94℃预变性5min;94℃1min→55℃1min→72℃1min,30C.2.4序列测定DB44/T868—2011扩增产物回收纯化后，以PCR引物为测序引物，分别从正反链双向测序，该操作由生物公司双向序列拼接后在GenBank上进行比对(Blast),若发现序列与GenBank上已知序列方向相反，则列相似性达98%以上时，则可判定待测菌与GenBank上该已知菌是同一个种。取赤芝(Gl-YW)为灵芝的参照种，其ITS序列登录号为GU213485,其碱基序列如下：TCGAGTTTTGACCGGGTTGTAGCTGGCCTTCCGAGGCATGTGCACGCACACCTGTGCACTTACTGTGGGCTTCAGATTGCGAGGCACGCTCTTTACCGGGCTTCTGTGCCTGCGTTTATCACAAACTCTATAAAGTAACAGAATGTGTATTGCTATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGAGTAATGTGAATTGCAGA