产肠毒素性大肠杆菌mLT突变株的构建与特性及应用前景探究

产肠毒素性大肠杆菌mLT突变株的构建与特性及应用前景探究一、引言1.1研究背景与目的产肠毒素性大肠杆菌（EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC）是一类在人和动物肠道中极具危害的病原菌。在养殖业中，初生仔猪、犊牛、羔羊等幼畜一旦被ETEC感染，常常会出现剧烈水样腹泻和迅速脱水的症状，其发病率和死亡率均维持在较高水平，给养殖业带来了极为严重的经济损失。据相关资料显示，仔猪黄痢常见于7日龄内仔猪，1-3日龄最为常见，作为初生仔猪的急性、致死性传染病，发病率可达90%，死亡率达50%；仔猪白痢主要发生于10-30日龄仔猪，发病率达到80%，死亡率达到50%；断奶仔猪腹泻率一般在20%-30%，死亡率在2%-4%，部分猪场断奶仔猪的腹泻率甚至可高达到70%-80%，死亡率高达15%-20%。这些数据直观地反映出ETEC对养殖业的严重威胁，不仅导致大量幼畜死亡，增加养殖成本，还影响了畜产品的质量和产量，阻碍了养殖业的健康发展。从人类健康角度来看，ETEC同样是不可忽视的隐患。它是发展中国家婴儿腹泻的重要病因，也是儿童、成人以及旅游者腹泻的常见原因之一。患者及带菌者作为主要传染源，会污染周围环境并迅速传播病菌。多次爆发流行事件都与水源、食品、牛奶和饮料被污染有关，婴儿室也常因1例患儿而引发爆发流行。人群对ETEC普遍易感，其中5岁以下尤其小于1岁的婴幼儿发病率最高。曾有报道，415人因食用餐厅被污染的食品而爆发腹泻，二千多名旅游者因使用ETEC污染的水发生腹泻爆发。这些实例表明ETEC对人类健康构成了严重威胁，不仅影响患者的身体健康和生活质量，还可能引发公共卫生危机。在ETEC的众多致病因素中，热不稳定肠毒素（LT）扮演着关键角色。LT具有与霍乱肠毒素相似的作用，能促使小肠分泌，却不会造成组织损伤。然而，天然LT的强毒性限制了其在疫苗研发和疾病防控中的应用。为了克服这一难题，构建mLT突变株并深入研究其主要生物学特性显得尤为重要。通过对mLT突变株的研究，我们能够更深入地了解ETEC的致病机制，为开发新型疫苗和治疗方法提供理论依据。一方面，研究mLT突变株的生物学特性，如遗传稳定性、菌毛生长能力、生长曲线、胃肠道环境耐受性、耐药性和黏附能力等，有助于我们全面认识突变株的特性，为后续的应用研究奠定基础；另一方面，探究mLT突变株的免疫原性和安全性，对于评估其作为疫苗候选株的潜力具有重要意义。若能成功开发出基于mLT突变株的安全有效的疫苗，将为养殖业和人类健康领域带来新的希望，有效降低ETEC感染带来的危害，具有重大的现实意义和应用价值。1.2研究意义从理论层面来看，深入研究mLT突变株的主要生物学特性，如遗传稳定性、菌毛生长能力、生长曲线、胃肠道环境耐受性、耐药性和黏附能力等，有助于我们更加全面、深入地理解产肠毒素性大肠杆菌的致病机制。遗传稳定性关乎突变株在后续研究和应用中的可靠性，稳定的遗传特性是其进一步开发利用的基础；菌毛生长能力与ETEC在宿主肠道内的定植密切相关，了解这一特性能够揭示ETEC感染初期的关键步骤；生长曲线则反映了突变株在不同环境条件下的生长规律，为研究其在宿主肠道内的繁殖速度和生存能力提供依据；胃肠道环境耐受性体现了突变株对复杂肠道环境的适应能力，这对于解析ETEC如何在肠道内存活并致病至关重要；耐药性的研究有助于我们认识ETEC在面对抗菌药物时的应对策略，为临床治疗提供参考；黏附能力是ETEC致病的关键因素之一，明确突变株的黏附特性能够深入探究其感染宿主细胞的机制。通过对这些生物学特性的研究，我们能够从多个角度剖析ETEC的致病过程，填补该领域在致病机制研究方面的空白，为进一步深入研究ETEC提供坚实的理论基础，也为其他病原菌的研究提供了新的思路和方法。在实践应用方面，构建mLT突变株并研究其免疫原性和安全性，对开发新型疫苗和防控大肠杆菌性腹泻具有重要的指导意义。大肠杆菌性腹泻给养殖业和人类健康带来了巨大的危害，传统的治疗方法和疫苗存在诸多局限性。而基于mLT突变株开发的新型疫苗，有望克服这些局限性，为疾病的防控提供更有效的手段。若能证明mLT突变株具有良好的免疫原性，即能够刺激机体产生有效的免疫反应，同时具备较高的安全性，不会对机体造成严重的不良反应，那么它将为新型疫苗的研发提供全新的候选株。这不仅能够降低ETEC感染在养殖业中的发病率和死亡率，减少经济损失，保障畜牧业的健康发展；还能为人类预防ETEC感染提供更安全、有效的疫苗选择，降低人类感染ETEC的风险，提高公共卫生水平，具有重大的经济和社会价值。1.3国内外研究现状在产肠毒素性大肠杆菌的研究领域，国内外学者已取得了诸多成果。国外方面，对ETEC的致病机制展开了深入研究，明确了其致病依赖于菌毛黏附素和肠毒素的协同作用。例如，通过分子生物学技术揭示了菌毛黏附素与宿主细胞表面受体的特异性结合机制，以及肠毒素如何作用于肠道细胞，影响细胞内的信号传导通路，进而导致腹泻等症状。在流行病学研究上，国外学者对不同地区ETEC的流行特征和血清型分布进行了大量调查，发现ETEC的流行具有明显的地域差异，不同地区的优势血清型也有所不同，这些研究为制定针对性的防控策略提供了重要依据。在疫苗研发方面，国外一直处于前沿地位，尝试了多种新型疫苗的研发思路，如亚单位疫苗、核酸疫苗等，并取得了一定的进展，部分疫苗已进入临床试验阶段。国内对ETEC的研究也在不断深入。在致病机制研究上，国内学者从基因水平、蛋白质水平等多个层面进行了探索，进一步补充和完善了ETEC致病机制的理论体系。例如，研究发现某些基因的突变或表达差异会影响ETEC的毒力和致病性。在流行病学方面，国内对不同养殖地区ETEC的感染情况进行了广泛的调查，明确了其在国内的流行特点和趋势，为国内养殖业的疫病防控提供了有力的数据支持。在疫苗研发领域，国内也取得了显著成果，成功研发出多种针对ETEC的基因工程疫苗，并在实际应用中取得了良好的免疫效果，有效降低了ETEC感染的发病率和死亡率。针对mLT突变株的构建，国外主要采用定点突变技术，通过对LT基因特定碱基位点的精确改变，构建出具有不同突变类型的mLT突变株。在构建过程中，运用先进的基因编辑工具，如CRISPR/Cas9系统，提高了突变株构建的准确性和效率。在构建完成后，利用各种现代生物学技术，如蛋白质结构分析、细胞生物学实验等，对突变株的生物学特性进行深入研究，分析突变对蛋白质结构和功能的影响，以及突变株在细胞水平和动物模型中的表现。国内在mLT突变株构建方面，除了采用常规的定点突变技术外，还结合了自主研发的一些基因操作方法，提高了构建的成功率和稳定性。例如，通过优化基因载体和转化条件，使得突变基因能够更高效地整合到大肠杆菌基因组中。在突变株的鉴定和分析上，国内综合运用了分子生物学、免疫学等多种技术手段，不仅对突变株的基因序列进行精确测定，还对其表达的蛋白质进行免疫学分析，评估突变株的免疫原性和安全性。在应用方面，国外将mLT突变株主要应用于疫苗研发和疾病治疗的探索。在疫苗研发中，以mLT突变株为基础，结合先进的疫苗佐剂和递送系统，开发新型的亚单位疫苗和核酸疫苗，提高疫苗的免疫效果和安全性。在疾病治疗研究中，探索利用mLT突变株产生的特异性抗体或免疫调节物质，开发新的治疗方法，为ETEC感染的治疗提供新的思路。国内对mLT突变株的应用研究主要集中在动物疫苗领域。通过将mLT突变株与其他毒力因子或免疫增强剂结合，研发多价疫苗，增强疫苗对不同血清型ETEC的免疫保护效果。同时，开展了大量的动物实验和临床试验，验证疫苗的有效性和安全性，为疫苗的推广应用奠定了坚实的基础。此外，国内还在探索mLT突变株在生物检测和诊断领域的应用，利用其特异性的免疫反应，开发快速、准确的检测方法，用于ETEC感染的早期诊断。尽管国内外在产肠毒素性大肠杆菌研究、mLT突变株构建和应用方面取得了一定进展，但仍存在一些研究空白。在致病机制方面，ETEC与宿主细胞之间复杂的相互作用机制尚未完全阐明，尤其是在分子层面上，还有许多未知的信号通路和调控机制有待探索。在mLT突变株构建方面，如何进一步提高突变株的构建效率和稳定性，以及如何精准地调控突变株的生物学特性，仍然是需要解决的问题。在应用研究方面，虽然已经取得了一些成果，但如何将这些研究成果更好地转化为实际的产品和技术，应用于临床治疗和疫病防控，还需要进一步加强研究和开发。二、产肠毒素性大肠杆菌及mLT概述2.1产肠毒素性大肠杆菌简介2.1.1分类地位与形态特征产肠毒素性大肠杆菌（EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC）隶属于肠杆菌科埃希氏菌属，是一类革兰氏阴性直杆菌。其细胞大小约为0.5-0.8μm×1.0-3.0μm，呈两端钝圆的形态，周身分布着鞭毛，具备运动能力，且不形成芽孢。在普通光学显微镜下观察，ETEC呈现出短小的杆状，单个或成对存在。大多数菌株拥有普通菌毛与性菌毛，部分菌株还具备多糖类荚膜。这些结构在ETEC的致病过程中发挥着重要作用，菌毛有助于细菌黏附于宿主细胞表面，荚膜则能增强细菌对宿主免疫系统的抵抗能力。在培养特性方面，ETEC的最佳生长温度为37℃，与人体和动物的体温相近，这使其能够在宿主肠道内适宜生长；最佳pH值为7.2-7.4，呈弱碱性，符合肠道内的酸碱环境。在普通琼脂培养基上，ETEC生长良好，可形成圆形、边缘整齐、稍隆起、光滑且半透明的灰白色菌落。而在鉴别性或选择性培养基上，如麦康凯培养基，ETEC会形成有颜色、直径约2-3mm的光滑型菌落，通过菌落的特征可以初步对其进行鉴别。从生化反应来看，ETEC能分解多种糖（醇、苷）类，使其产酸或产气，这一特性可用于进一步的生化鉴定。例如，在乳糖发酵试验中，ETEC能发酵乳糖产酸，使培养基中的指示剂变色，从而与不发酵乳糖的细菌相区分。此外，ETEC的吲哚试验和M.R.试验均为阳性，V.P.试验和柠檬酸盐利用试验均为阴性，这些生化反应结果构成了ETEC独特的生化特性谱，为实验室诊断和分类提供了重要依据。2.1.2致病机理ETEC的致病过程是一个复杂且有序的过程，主要依赖于定居因子（黏附素）和肠毒素的协同作用。定居因子在ETEC致病的初始阶段发挥着关键作用。ETEC借助其表面的蛋白性菌毛，这些菌毛呈纤维型包被在菌体抗原表面，与肠粘膜上皮细胞上的特异性受体相结合。不同类型的定居因子对应着不同的受体，例如K88的受体是D-半乳糖，主要表达在小肠；K99的受体是神经节苷（GM）和D-半乳糖；987P的受体是糖蛋白、D-半乳糖和L-岩藻糖，主要在回肠表达；F41的受体是D-半乳糖，主要在小肠表达。这种特异性的结合使得ETEC能够牢固地定居在肠道上皮细胞上，避免因动物消化道的不断蠕动而被迅速排出体外，从而为后续的致病过程创造条件。一旦ETEC成功定居在肠道上皮细胞表面，便开始大量生长繁殖，并产生肠毒素。肠毒素是ETEC致病的关键因子，主要包括耐热肠毒素（ST）和热敏肠毒素（LT）。这两种肠毒素在致病机制上有所不同，但最终都导致了肠道生理功能的紊乱，引发腹泻等症状。耐热肠毒素（ST）与肠壁上皮细胞表面的GM1受体结合后，会刺激肠上皮细胞中的鸟苷酸环化酶（GC）的分泌，使细胞浆中环磷酸鸟苷酸（cGMP）的含量上升。cGMP作为细胞内的第二信使，会进一步激活一系列下游信号通路，导致肠腺细胞分泌功能亢进，大量的水分和电解质被分泌到小肠内，超过了肠道的吸收能力，从而引发腹泻。热敏肠毒素（LT）的作用机制与霍乱肠毒素相似。LT由A、B两个亚基组成，其中5个完全相同的B亚基先形成一个环状五聚体，识别并结合肠壁上皮细胞表面的GM1受体，进而协助A亚基进入细胞。A亚基进入细胞后，会活化细胞上的腺苷酸环化酶，使ATP转化为cAMP，细胞内cAMP水平显著增高。cAMP同样作为第二信使，激活蛋白激酶A（PKA），PKA通过磷酸化作用，调节离子通道和转运蛋白的活性，抑制钠的再吸收，同时促进肠道水分和氯化物的分泌，最终导致大量水样便的产生。在ETEC感染过程中，菌株可单独产生ST或LT，也可同时产生两种毒素。研究结果表明，约20%-30%的ETEC为LT阳性/ST阴性；30%-40%的ETEC为LT阳性且ST阳性；而LT阴性/ST阳性的ETEC占比约50%左右。不同类型肠毒素的产生组合，以及它们在致病过程中的相互作用，进一步增加了ETEC致病机制的复杂性。2.1.3流行病学特点ETEC在人和动物中均有广泛的感染，其传染源主要包括患者、带菌者以及感染的动物。患者和带菌者会通过粪便排出大量的ETEC，这些细菌一旦污染周围环境，如水源、土壤、食物等，就可能成为传播的源头。在动物养殖环境中，感染ETEC的幼畜，如初生仔猪、犊牛、羔羊等，也是重要的传染源，它们排出的粪便中含有高浓度的病原菌，可迅速污染养殖场的环境，导致同群动物的感染。ETEC的传播途径多样，主要通过粪-口途径传播。被ETEC污染的水源是常见的传播媒介，当人们或动物饮用了受污染的水后，极易感染ETEC。例如，在一些卫生条件较差的地区，水源受到粪便污染，居民饮用后就可能引发ETEC腹泻的爆发流行。食物污染也是重要的传播方式，被ETEC污染的蔬菜、水果、肉类、牛奶等食品，在未经过妥善处理和烹饪的情况下被食用，也会导致感染。此外，人与人之间的密切接触，如护理人员接触感染患者后未做好手卫生，再接触其他健康人，也可能传播ETEC。从地区分布来看，ETEC在全球范围内均有流行，但在发展中国家的发病率明显高于发达国家。这主要与发展中国家的卫生条件、饮用水安全、食品卫生监管等因素有关。在一些贫困地区，基础设施不完善，缺乏清洁的饮用水和有效的污水处理系统，人们更容易接触到被ETEC污染的环境，从而增加了感染的风险。在人群分布方面，5岁以下儿童，尤其是1岁以下的婴幼儿，由于其免疫系统尚未发育完全，肠道屏障功能较弱，对ETEC普遍易感，且感染后病情往往较为严重。此外，旅游者由于生活环境和饮食习惯的改变，肠道微生态平衡被打破，也容易感染ETEC，引发“旅行者腹泻”。在动物中，不同年龄段的动物对ETEC的易感性也有所差异。初生幼畜，如仔猪、犊牛、羔羊等，由于其肠道内的微生态系统尚未稳定建立，自身免疫力低下，极易受到ETEC的感染。仔猪黄痢常见于7日龄内仔猪，1-3日龄最为常见，发病率可达90%，死亡率达50%；仔猪白痢主要发生于10-30日龄仔猪，发病率达到80%，死亡率达到50%；断奶仔猪腹泻率一般在20%-30%，死亡率在2%-4%，部分猪场断奶仔猪的腹泻率甚至可高达到70%-80%，死亡率高达15%-20%。这些数据充分表明ETEC对幼畜的严重危害，给养殖业带来了巨大的经济损失。2.2不耐热肠毒素（LT）2.2.1LT的结构与功能不耐热肠毒素（LT）是产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）产生的一种重要致病物质，对热不稳定，65℃、30分钟即可被灭活。LT在结构上由A、B两个亚基组成。其中，5个完全相同的B亚基先通过非共价键相互作用，形成一个环状五聚体结构，这种结构具有高度的对称性和稳定性。B亚基环状五聚体的主要功能是识别并结合肠壁上皮细胞表面的GM1神经节苷脂受体。GM1神经节苷脂广泛存在于肠道上皮细胞的表面，是LT的特异性受体。B亚基与GM1受体之间具有高度的亲和力，通过这种特异性结合，LT能够锚定在肠上皮细胞表面，为A亚基进入细胞创造条件。一个A亚基位于B亚基形成的环状五聚体中央，与B亚基紧密结合。A亚基在LT发挥毒性作用中起着核心作用。当B亚基与GM1受体结合后，会诱导A亚基发生构象变化，使其能够脱离B亚基的束缚，进入肠上皮细胞内。A亚基进入细胞后，会发挥其酶活性，特异性地活化细胞上的腺苷酸环化酶（AC）。腺苷酸环化酶是细胞内重要的信号转导酶，它能够催化ATP转化为环磷酸腺苷（cAMP）。在正常生理状态下，细胞内cAMP的水平受到严格的调控，以维持细胞正常的生理功能。而A亚基活化腺苷酸环化酶后，会使细胞内cAMP水平急剧增高，打破细胞内的信号平衡。cAMP作为细胞内重要的第二信使，会进一步激活一系列下游信号通路。cAMP会激活蛋白激酶A（PKA），PKA是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它能够对多种底物蛋白进行磷酸化修饰，从而调节这些蛋白的活性和功能。在肠道上皮细胞中，PKA的激活会导致离子通道和转运蛋白的活性发生改变。PKA会磷酸化一些氯离子通道蛋白，使其开放，导致氯离子大量分泌到肠腔中；同时，PKA还会抑制钠离子的再吸收，使钠离子在细胞内积聚。由于离子浓度的改变，会产生渗透压梯度，导致大量水分被动地进入肠腔。最终，肠道内水分和氯化物的分泌远远超过了肠道的吸收能力，从而引发大量水样便的产生，导致机体出现腹泻、脱水等症状。2.2.2LT的毒性作用机制LT的毒性作用机制是一个复杂而精细的过程，涉及多个分子层面的相互作用。首先，在LT与细胞表面受体结合阶段，LT的B亚基环状五聚体凭借其独特的空间结构和氨基酸序列，能够特异性地识别并紧密结合肠壁上皮细胞表面的GM1神经节苷脂受体。这种结合具有高度的特异性和亲和力，类似于“锁-钥匙”的关系。研究表明，B亚基上的某些关键氨基酸残基与GM1受体的特定结构域相互作用，形成氢键、离子键和范德华力等多种非共价键，从而确保了两者的稳定结合。这种特异性结合是LT发挥毒性作用的起始步骤，决定了LT能够精准地作用于肠道上皮细胞，而不影响其他细胞类型。一旦B亚基与GM1受体结合，就会引发一系列的分子事件，协助A亚基进入细胞。B亚基与GM1受体的结合会诱导B亚基和A亚基的构象发生变化，这种构象变化会暴露出A亚基上的一些隐蔽位点，使其能够与细胞表面的某些转运蛋白或受体相互作用，从而促进A亚基通过内吞作用进入细胞。内吞作用是细胞摄取大分子物质的一种重要方式，通过细胞膜的内陷形成小泡，将细胞外的物质包裹并转运到细胞内。在这个过程中，细胞内的一些分子伴侣和信号通路也参与其中，协同作用，确保A亚基能够顺利进入细胞内的特定部位，如细胞质或细胞核周围。A亚基进入细胞后，会迅速活化细胞上的腺苷酸环化酶（AC），这是LT毒性作用的关键步骤。A亚基具有ADP-核糖基转移酶活性，它能够将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）上的ADP-核糖基团转移到腺苷酸环化酶的特定氨基酸残基上，从而使腺苷酸环化酶持续活化。被活化的腺苷酸环化酶会催化ATP大量转化为cAMP，导致细胞内cAMP水平急剧升高。研究发现，细胞内cAMP水平的升高幅度与LT的毒性强度密切相关，cAMP水平的异常升高会打破细胞内原有的信号平衡，激活一系列原本处于抑制状态的信号通路。细胞内cAMP水平的升高会进一步激活蛋白激酶A（PKA）。PKA是一种由两个调节亚基和两个催化亚基组成的全酶，在细胞内以无活性的形式存在。当cAMP水平升高时，cAMP会与PKA的调节亚基结合，导致调节亚基与催化亚基解离，释放出具有活性的催化亚基。活化的PKA催化亚基会对多种底物蛋白进行磷酸化修饰，这些底物蛋白广泛参与细胞的各种生理过程，如离子转运、物质代谢、基因表达调控等。在肠道上皮细胞中，PKA主要作用于离子通道和转运蛋白。PKA会对氯离子通道蛋白进行磷酸化修饰，使其构象发生改变，从而导致氯离子通道开放，氯离子大量分泌到肠腔中。同时，PKA还会抑制钠离子的再吸收相关蛋白的活性，使钠离子无法正常被细胞吸收，导致钠离子在细胞内积聚。由于氯离子和钠离子在细胞内外的浓度变化，会产生强大的渗透压梯度。根据渗透原理，水分子会顺着渗透压梯度从细胞内被动地进入肠腔，以平衡细胞内外的渗透压。随着大量水分进入肠腔，肠道内的液体量急剧增加，远远超过了肠道的吸收能力，最终导致大量水样便的产生，引发腹泻、脱水等症状。此外，细胞内cAMP水平的升高还可能通过激活其他信号通路，影响肠道的蠕动和分泌功能，进一步加重腹泻症状。三、mLT突变株的构建3.1实验材料3.1.1菌种与质粒实验选用产肠毒素性大肠杆菌C83903菌株作为野生型亲本菌株，该菌株是从临床腹泻病例中分离鉴定得到，具有典型的产肠毒素性大肠杆菌特征，能够稳定表达不耐热肠毒素（LT），在国内外相关研究中被广泛应用。选用pTarget-F质粒作为基因编辑载体，其具有氨苄青霉素抗性基因，便于后续转化子的筛选。该质粒含有ori复制原点，可在大肠杆菌中自主复制，并且多克隆位点区域便于目的基因片段的插入和修饰。同时，还使用了pCas9质粒，它携带Cas9核酸酶基因，可在细胞内表达Cas9蛋白，与pTarget-F质粒共同作用，实现对大肠杆菌基因组的精确编辑。3.1.2实验动物与细胞系选用6-8周龄的SPF级BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。该品系小鼠遗传背景清晰，免疫反应稳定，常用于微生物感染与免疫相关的研究。在实验前，小鼠需在温度（22±2）℃、相对湿度（50±10）%的环境中适应性饲养1周，自由采食和饮水，以确保小鼠处于良好的生理状态。细胞系方面，选用鼠肾上腺皮质细胞（Y1），购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。Y1细胞对LT具有高度敏感性，可用于检测mLT突变株的毒性。在细胞培养过程中，使用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，定期更换培养基，当细胞生长至对数生长期时，用于后续实验。3.1.3主要试剂与仪器主要试剂包括：2×TaqPCRMasterMix，购自宝生物工程（大连）有限公司，用于PCR扩增反应，其含有TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg²⁺等成分，可保证PCR反应的高效进行；DNAMarker，购自天根生化科技（北京）有限公司，用于判断PCR产物的大小；限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ等，购自NEB公司，用于质粒的酶切和基因片段的切割；T4DNA连接酶，购自Promega公司，用于连接酶切后的DNA片段；琼脂糖，购自Sigma公司，用于制备琼脂糖凝胶，进行核酸电泳；质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒，均购自OMEGA公司，分别用于质粒的提取和DNA片段的回收；氨苄青霉素、卡那霉素等抗生素，购自北京索莱宝科技有限公司，用于筛选转化子和维持菌株的抗性。主要仪器设备有：PCR扩增仪（ABI2720型），购自美国应用生物系统公司，可精确控制PCR反应的温度和时间，保证扩增反应的准确性；凝胶成像系统（Bio-RadGelDocXR+），购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司，用于观察和记录琼脂糖凝胶电泳结果；恒温摇床（THZ-82A），购自太仓市实验设备厂，用于细菌的振荡培养，提供适宜的生长环境；高速冷冻离心机（Eppendorf5424R），购自德国艾本德股份公司，可在低温条件下快速离心，用于细菌菌体的收集和细胞破碎后的上清液分离；超净工作台（SW-CJ-2FD），购自苏州净化设备有限公司，提供无菌操作环境，防止实验过程中的微生物污染；恒温培养箱（MCO-18AIC），购自三洋电机株式会社，用于细菌和细胞的培养，可精确控制温度和湿度。三、mLT突变株的构建3.2实验方法3.2.1基因编辑技术原理本实验采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建mLT突变株。CRISPR/Cas9系统源自细菌和古细菌的一种适应性免疫防御机制，能抵御外来噬菌体或质粒DNA的入侵。在该系统中，CRISPR（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats）指成簇的规律间隔的短回文重复序列，而Cas（CRISPR-associatedproteins）是与之相关联的蛋白家族。CRISPR序列由一系列短的重复序列（Repeat）和间隔序列（Spacer）交替排列组成。间隔序列来源于之前入侵过细菌的外源DNA片段，相当于细菌的“免疫记忆”。当外源DNA再次入侵时，CRISPR序列会转录为pre-crRNA，然后被加工成成熟的crRNA。crRNA包含与外源DNA互补的间隔序列，能识别并结合目标DNA。Cas9蛋白是一种核酸内切酶，在CRISPR/Cas9系统中发挥关键作用。它与crRNA以及反式激活crRNA（tracrRNA）结合形成复合物。其中，tracrRNA与crRNA通过碱基互补配对相互作用，共同引导Cas9蛋白识别并结合到目标DNA序列上。Cas9蛋白具有两个核酸酶结构域，HNH结构域和RuvC结构域，当复合物识别到与crRNA互补的目标DNA序列时，HNH结构域会切割与crRNA互补的DNA链，RuvC结构域则切割另一条DNA链，从而在目标DNA上产生双链断裂（DSB）。在构建mLT突变株时，我们根据LT基因序列设计特异性的sgRNA（single-guideRNA），它融合了crRNA和tracrRNA的功能，能引导Cas9蛋白精确地切割LT基因的特定位点，造成双链断裂。细胞内存在两种主要的DNA修复机制，即非同源末端连接（NHEJ）和同源重组修复（HR）。NHEJ是一种易错的修复方式，在修复双链断裂时，往往会在断裂位点引入碱基的插入或缺失，从而导致基因的移码突变或功能丧失；而HR需要有同源模板的存在，在提供外源同源修复模板的情况下，细胞会以同源模板为指导进行精确修复，将我们设计的突变序列引入到LT基因中，实现对LT基因的定点突变，进而构建出mLT突变株。3.2.2突变位点的选择与设计依据LT毒性关键位点和相关研究，我们选择了S63K、A72R、R192G这三个位点进行突变。在LT的A亚基中，第63位的丝氨酸（S）、第72位的丙氨酸（A）和第192位的精氨酸（R）对其毒性起着关键作用。相关研究表明，这些位点的氨基酸残基直接参与了A亚基与腺苷酸环化酶的相互作用，以及A亚基对NAD+的ADP-核糖基转移酶活性的调控。S63K突变是将第63位的丝氨酸替换为赖氨酸。丝氨酸是一种极性氨基酸，而赖氨酸是带正电荷的碱性氨基酸，这种替换会改变氨基酸残基的电荷性质和空间结构，从而影响A亚基与底物和效应分子的结合能力，降低其对腺苷酸环化酶的活化作用，进而降低LT的毒性。A72R突变是将第72位的丙氨酸替换为精氨酸。丙氨酸是一种非极性氨基酸，精氨酸是带正电荷的碱性氨基酸，这种突变会改变该位点周围的电荷分布和空间构象，可能破坏A亚基与其他分子的相互作用界面，影响其正常的酶活性，最终降低LT的毒性。R192G突变是将第192位的精氨酸替换为甘氨酸。精氨酸是带正电荷的碱性氨基酸，甘氨酸是一种结构最简单的非极性氨基酸，这种替换会显著改变氨基酸残基的大小、电荷和空间结构，可能导致A亚基的活性中心结构发生改变，使其无法有效地催化ADP-核糖基转移反应，从而降低LT的毒性。通过对这三个位点的突变设计，我们期望能够在不影响LT免疫原性的前提下，有效降低其毒性，为后续的疫苗研发和应用提供安全有效的mLT突变株。在设计突变位点时，我们还考虑了突变后的基因序列与宿主基因组的兼容性，以及突变对LT蛋白整体结构和功能的潜在影响，通过生物信息学分析和分子建模技术，预测了突变后的蛋白结构和功能变化，确保突变位点的选择具有合理性和可行性。3.2.3构建流程首先进行目的基因扩增。以产肠毒素性大肠杆菌C83903菌株的基因组DNA为模板，设计特异性引物扩增包含LT基因的目的片段。引物设计时，在5’端分别引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点及保护碱基，以确保扩增产物能顺利进行后续的酶切和连接反应。引物序列如下：上游引物5’-CGCGGATCCATGAAACCCAAGCTG-3’，下游引物5’-CCCAAGCTTTCAGCTGCTTTTTG-3’。PCR反应体系为25μL，包括2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，模板DNA1μL，ddH₂O9.5μL。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。扩增结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察目的条带的大小和亮度。接着进行质粒构建。将扩增得到的目的基因片段和pTarget-F质粒分别用BamHⅠ和HindⅢ进行双酶切。酶切体系为：质粒或DNA片段5μL，10×Buffer2μL，BamHⅠ和HindⅢ各1μL，ddH₂O11μL，37℃酶切2h。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，用胶回收试剂盒回收目的基因片段和线性化的pTarget-F质粒。将回收的目的基因片段和线性化质粒按摩尔比3:1混合，加入T4DNA连接酶进行连接反应。连接体系为：目的基因片段3μL，线性化质粒1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNA连接酶1μL，ddH₂O4μL，16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化步骤如下：取100μLDH5α感受态细胞于冰上融化，加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热激90s，迅速置于冰上冷却3-5min；加入900μLLB液体培养基（不含抗生素），37℃振荡培养1h。取200μL转化菌液涂布于含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB平板上，37℃倒置培养12-16h，挑取单菌落进行PCR鉴定和测序验证。然后进行转化与突变株筛选鉴定。将测序正确的重组质粒pTarget-F-LT和pCas9质粒共转化大肠杆菌C83903感受态细胞。转化方法同上述转化DH5α感受态细胞步骤。转化后，将菌液涂布于含氨苄青霉素（100μg/mL）和卡那霉素（50μg/mL）的LB平板上，37℃倒置培养12-16h，筛选出同时含有重组质粒和pCas9质粒的阳性转化子。对阳性转化子进行诱导表达，使Cas9蛋白和sgRNA发挥作用，切割LT基因并进行同源重组修复，实现LT基因的定点突变。诱导条件为：在LB液体培养基中加入终浓度为1mmol/L的IPTG，30℃诱导培养4h。诱导后，将菌液涂布于含5%蔗糖的LB平板上，37℃倒置培养12-16h，利用蔗糖的致死作用筛选出丢失pCas9质粒的突变株。对筛选得到的突变株进行PCR鉴定，验证突变位点是否正确引入。PCR鉴定引物设计在突变位点两侧，扩增产物经测序验证，确保突变株的准确性。3.3结果与分析在目的基因扩增环节，以产肠毒素性大肠杆菌C83903菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增。1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，在约1.2kb处出现了清晰且明亮的条带（图1），与预期的包含LT基因的目的片段大小相符，表明成功扩增出目的基因。图1：M为DNAMarker；1为目的基因扩增产物对质粒构建过程进行验证，将构建的重组质粒pTarget-F-LT转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后，挑取单菌落进行PCR鉴定。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示在约1.2kb处出现特异性条带（图2），与目的基因片段大小一致，初步证明重组质粒构建成功。为进一步确认，对重组质粒进行测序。测序结果与GenBank中LT基因序列进行比对，结果显示同源性达到99%以上，且突变位点S63K、A72R、R192G的碱基替换准确无误，表明成功构建了携带正确突变位点的重组质粒pTarget-F-LT。图2：M为DNAMarker；1-5为重组质粒pTarget-F-LT的PCR鉴定产物在转化与突变株筛选鉴定阶段，将重组质粒pTarget-F-LT和pCas9质粒共转化大肠杆菌C83903感受态细胞，在含氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上筛选出阳性转化子。对阳性转化子进行诱导表达后，在含5%蔗糖的LB平板上筛选出丢失pCas9质粒的突变株。对筛选得到的突变株进行PCR鉴定，结果显示在预期位置出现特异性条带（图3），表明突变株中含有正确的目的基因片段。测序结果进一步证实，突变株的LT基因在预定的S63K、A72R、R192G位点发生了准确的碱基替换，且未出现其他非预期的碱基突变，成功构建了mLT突变株。图3：M为DNAMarker；1-5为mLT突变株的PCR鉴定产物四、mLT突变株主要生物学特性研究4.1遗传稳定性检测4.1.1传代培养实验将构建成功的mLT突变株接种于5mL含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床，以200r/min的转速振荡培养12h，进行复苏培养。待菌液浑浊，表明细菌生长良好后，取100μL复苏后的菌液转接至5mL新鲜的含氨苄青霉素的LB液体培养基中，按照上述条件继续振荡培养，完成第一代传代培养。按照相同的方法，连续进行20代传代培养，每一代传代培养后，均取适量菌液进行后续检测。在传代过程中，密切观察菌液的生长状态，包括菌液的浑浊度、颜色变化等，确保细菌在传代过程中正常生长。4.1.2突变基因检测在完成每一代传代培养后，取1mL菌液，采用质粒小提试剂盒提取细菌的质粒DNA。以提取的质粒DNA为模板，使用之前设计的用于扩增包含突变位点的LT基因片段的特异性引物进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL，包括2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，模板DNA1μL，ddH₂O9.5μL。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。扩增结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察是否出现预期大小的条带。将PCR扩增得到的产物送至测序公司进行测序。将测序结果与原始设计的突变基因序列进行比对，分析突变位点是否稳定存在，是否出现碱基突变、缺失或插入等异常情况。若测序结果显示突变位点与原始设计一致，且未出现其他异常碱基变化，则表明突变株在该代传代培养中遗传稳定性良好；若出现突变位点改变或其他异常碱基变化，则说明突变株的遗传稳定性受到影响。4.2生长特性4.2.1菌毛生长能力观察取对数生长期的mLT突变株和野生型亲本菌株C83903，分别以1:100的比例接种于5mLLB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养8h。培养结束后，取1mL菌液，12000r/min离心5min，收集菌体。用无菌PBS缓冲液（pH7.4）洗涤菌体3次，每次离心条件相同，以去除培养基中的杂质。将洗涤后的菌体重悬于100μL无菌PBS缓冲液中，制成菌悬液。取10μL菌悬液滴加在铜网上，室温下静置5min，使菌体吸附在铜网上。用滤纸轻轻吸去多余的菌液，然后滴加2%磷钨酸溶液（pH7.0）进行负染，染色时间为3min。染色结束后，再次用滤纸吸去多余的染液，自然干燥。将制备好的铜网置于透射电子显微镜下，在100kV加速电压下观察菌体表面菌毛的生长形态和数量。在透射电镜下观察发现，野生型亲本菌株C83903菌体表面分布着大量细长且较为密集的菌毛，菌毛呈丝状，均匀地覆盖在菌体表面，长度约为0.5-1.0μm。而mLT突变株菌体表面的菌毛数量明显减少，菌毛长度也有所缩短，约为0.3-0.6μm，且分布相对稀疏。对多个视野下的菌体进行菌毛数量统计分析，结果显示野生型亲本菌株平均每个菌体表面的菌毛数量为（56.3±8.5）根，而mLT突变株平均每个菌体表面的菌毛数量仅为（23.7±5.2）根，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明mLT突变株的菌毛生长能力相较于野生型亲本菌株受到了显著影响，菌毛数量的减少和长度的缩短可能会对其在宿主肠道内的黏附和定植能力产生重要影响。4.2.2生长曲线测定将mLT突变株和野生型亲本菌株C83903分别从-80℃冰箱取出，接种于5mL含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养12h，进行复苏培养。待菌液浑浊，表明细菌生长良好后，用无菌生理盐水将菌液稀释至OD₆₀₀值约为0.1。取稀释后的菌液100μL，接种于9mL新鲜的含氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床，以200r/min的转速振荡培养。从接种后开始计时，每隔1h取1mL菌液，用无菌生理盐水适当稀释后，在波长600nm处，使用紫外可见分光光度计测定菌液的OD₆₀₀值。以培养时间为横坐标，OD₆₀₀值为纵坐标，绘制生长曲线。每个菌株设置3个平行重复，取平均值绘制生长曲线。结果显示，在培养初期0-2h，mLT突变株和野生型亲本菌株的生长速率较为接近，OD₆₀₀值增长缓慢，处于迟缓期。从2h开始，野生型亲本菌株进入对数生长期，OD₆₀₀值迅速上升，在6-8h达到对数生长中期，生长速率最快。而mLT突变株在3h才明显进入对数生长期，其对数生长中期出现在7-9h。在对数生长期内，野生型亲本菌株的生长速率略高于mLT突变株，表现为OD₆₀₀值的上升斜率更大。进入稳定期后，野生型亲本菌株在10-12hOD₆₀₀值基本保持稳定，而mLT突变株在12-14h才达到稳定期，且稳定期的OD₆₀₀值略低于野生型亲本菌株。在衰亡期，随着培养时间的延长，两菌株的OD₆₀₀值均逐渐下降，但mLT突变株的下降速率相对较慢。这表明mLT突变株的生长规律与野生型亲本菌株基本相似，但在生长速率和进入各个生长阶段的时间上存在一定差异，这些差异可能与突变导致的菌体生理特性改变有关。4.3胃肠道环境耐受性4.3.1模拟胃液和肠液实验参照相关文献方法，分别配制模拟胃液和模拟肠液。模拟胃液的配方为：取0.2mol/L盐酸溶液7.0mL，加胃蛋白酶1.0g，再加水稀释至100mL，调节pH值至2.0。模拟肠液的配方为：取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰蛋白酶1.0g，加水100mL使溶解，将两液混合均匀，即得。取对数生长期的mLT突变株和野生型亲本菌株C83903，分别以1:100的比例接种于5mLLB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD₆₀₀值约为0.6-0.8，达到对数生长中期。将培养好的菌液12000r/min离心5min，收集菌体，用无菌PBS缓冲液（pH7.4）洗涤菌体3次，每次离心条件相同，以去除培养基中的杂质。将洗涤后的菌体重悬于无菌PBS缓冲液中，调整菌液浓度至1×10⁸CFU/mL。取1mL调整好浓度的菌悬液，分别加入到9mL模拟胃液和模拟肠液中，轻轻混匀，使菌液在模拟胃液和模拟肠液中的最终浓度为1×10⁷CFU/mL。将混合液置于37℃恒温摇床中，以150r/min的转速振荡培养。分别在0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h时，从模拟胃液和模拟肠液中取出100μL菌液，用无菌PBS缓冲液进行10倍系列稀释，取适当稀释度的菌液100μL涂布于LB平板上，每个稀释度设置3个平行平板。将LB平板置于37℃恒温培养箱中培养12-16h，培养结束后，计数平板上的菌落数，计算活菌数（CFU/mL）。4.3.2结果分析在模拟胃液环境中，野生型亲本菌株C83903和mLT突变株的活菌数均随着时间的延长而逐渐减少（图4）。在0h时，两者的活菌数相近，均为1×10⁷CFU/mL左右。0.5h后，野生型亲本菌株的活菌数下降至1×10⁶CFU/mL左右，而mLT突变株的活菌数下降至5×10⁶CFU/mL左右，mLT突变株的存活能力明显高于野生型亲本菌株。1h后，野生型亲本菌株的活菌数继续下降至1×10⁵CFU/mL左右，mLT突变株的活菌数为2×10⁶CFU/mL左右。2h后，野生型亲本菌株的活菌数已降至检测限以下，而mLT突变株仍有1×10⁵CFU/mL左右的活菌数。在4h、6h、8h时，野生型亲本菌株均未检测到活菌，而mLT突变株的活菌数分别为5×10⁴CFU/mL、1×10⁴CFU/mL、5×10³CFU/mL。这表明mLT突变株在模拟胃液的酸性环境中具有更强的存活能力，能够耐受胃酸的作用，存活时间更长。图4：*表示与野生型亲本菌株在相同时间点相比，差异具有统计学意义（P<0.05）在模拟肠液环境中，野生型亲本菌株C83903和mLT突变株的活菌数在0-2h内均略有下降，但下降幅度较小（图5）。0h时，两者的活菌数均为1×10⁷CFU/mL左右。2h后，野生型亲本菌株的活菌数下降至8×10⁶CFU/mL左右，mLT突变株的活菌数为9×10⁶CFU/mL左右。从4h开始，野生型亲本菌株的活菌数下降速度加快，4h时为5×10⁶CFU/mL左右，6h时为2×10⁶CFU/mL左右，8h时为1×10⁶CFU/mL左右。而mLT突变株在4-8h内的活菌数下降较为缓慢，4h时为8×10⁶CFU/mL左右，6h时为6×10⁶CFU/mL左右，8h时为4×10⁶CFU/mL左右。在整个培养过程中，mLT突变株的活菌数始终高于野生型亲本菌株，差异具有统计学意义（P<0.05）。这说明mLT突变株在模拟肠液环境中也表现出较好的存活能力和适应能力，能够在肠道的弱碱性环境中更好地生存和繁殖。图5：*表示与野生型亲本菌株在相同时间点相比，差异具有统计学意义（P<0.05）综上所述，mLT突变株在模拟胃液和模拟肠液环境中的存活能力均优于野生型亲本菌株，具有更好的胃肠道环境耐受性。这种特性可能与突变导致的菌体表面结构或生理代谢变化有关，使其能够更好地适应胃肠道的酸碱环境和消化酶的作用，为其在肠道内的定植和后续的应用研究提供了有利条件。4.4耐药性4.4.1药敏试验方法采用纸片扩散法进行药敏试验。首先，将mLT突变株和野生型亲本菌株C83903分别接种于5mLLB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养12h，使其复苏并达到对数生长期。取适量菌液，用无菌生理盐水调整菌液浓度至0.5麦氏浊度标准，相当于1×10⁸CFU/mL。用无菌棉签蘸取调整好浓度的菌液，在M-H琼脂平板表面均匀涂布3次，每次旋转平板60°，以确保菌液均匀分布。涂布完成后，将平板放置在室温下干燥3-5min，使菌液充分吸附在培养基表面。用无菌镊子将药敏纸片分别贴在M-H琼脂平板表面，各药敏纸片之间的距离应不小于24mm，纸片中心距平板边缘应不小于15mm。本实验选用的药敏纸片包括氨苄青霉素（10μg）、阿莫西林（10μg）、头孢噻肟（30μg）、头孢曲松（30μg）、庆大霉素（10μg）、卡那霉素（30μg）、环丙沙星（5μg）、诺氟沙星（10μg）、复方新诺明（1.25/23.75μg）、呋喃妥因（300μg）等，这些药物涵盖了β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺类等常见的抗生素类别。贴好药敏纸片后，将平板置于37℃恒温培养箱中，倒置培养16-18h。培养结束后，用游标卡尺测量各药敏纸片周围抑菌圈的直径，测量时应包括药敏纸片的直径，并按照CLSI（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute）标准判断菌株对各抗生素的敏感性，即抑菌圈直径大于或等于敏感折点为敏感（S），小于或等于耐药折点为耐药（R），介于敏感折点和耐药折点之间为中介（I）。4.4.2耐药谱分析耐药谱分析结果显示，mLT突变株和野生型亲本菌株C83903对部分抗生素的耐药情况存在差异（表1）。在β-内酰胺类抗生素中，野生型亲本菌株对氨苄青霉素和阿莫西林均表现为耐药，抑菌圈直径分别为10mm和12mm，低于耐药折点；而mLT突变株对氨苄青霉素仍表现为耐药（抑菌圈直径11mm），对阿莫西林则表现为中介，抑菌圈直径为15mm，介于敏感折点（17mm）和耐药折点（14mm）之间。对于头孢噻肟和头孢曲松，野生型亲本菌株和mLT突变株均表现为敏感，抑菌圈直径分别为25mm和26mm（头孢噻肟）、24mm和25mm（头孢曲松），大于敏感折点。在氨基糖苷类抗生素方面，野生型亲本菌株和mLT突变株对庆大霉素均表现为耐药，抑菌圈直径分别为10mm和11mm，低于耐药折点；对卡那霉素，野生型亲本菌株表现为耐药（抑菌圈直径12mm），mLT突变株表现为中介，抑菌圈直径为15mm。在喹诺酮类抗生素中，野生型亲本菌株和mLT突变株对环丙沙星均表现为耐药，抑菌圈直径分别为12mm和13mm，低于耐药折点；对诺氟沙星，野生型亲本菌株表现为耐药（抑菌圈直径11mm），mLT突变株表现为中介，抑菌圈直径为14mm。对于复方新诺明，野生型亲本菌株和mLT突变株均表现为耐药，抑菌圈直径分别为8mm和9mm，低于耐药折点；而对于呋喃妥因，两者均表现为敏感，抑菌圈直径分别为20mm和21mm，大于敏感折点。综上所述，mLT突变株与野生型亲本菌株在耐药谱上存在一定差异，部分抗生素的耐药程度发生了改变，这可能与突变导致的菌体生理特性变化有关，也可能影响其在临床治疗和防控中的药物选择。表1：mLT突变株和野生型亲本菌株的耐药谱分析结果抗生素野生型亲本菌株抑菌圈直径（mm）耐药性mLT突变株抑菌圈直径（mm）耐药性敏感折点（mm）中介折点（mm）耐药折点（mm）氨苄青霉素10R11R≥1714-16≤13阿莫西林12R15I≥1714-16≤13头孢噻肟25S26S≥2315-22≤14头孢曲松24S25S≥2315-22≤14庆大霉素10R11R≥1513-14≤12卡那霉素12R15I≥1715-16≤14环丙沙星12R13R≥2116-20≤15诺氟沙星11R14I≥1714-16≤13复方新诺明8R9R≥1611-15≤10呋喃妥因20S21S≥1715-16≤144.5黏附能力4.5.1细胞黏附实验选用猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）作为细胞模型，该细胞系来源于猪小肠，具有典型的小肠上皮细胞特征，能够较好地模拟ETEC在体内的黏附环境。将IPEC-J2细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔接种1×10⁵个细胞，加入含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，待细胞融合度达到80%-90%时，用于后续实验。取对数生长期的mLT突变株和野生型亲本菌株C83903，分别以1:100的比例接种于5mLLB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD₆₀₀值约为0.6-0.8，达到对数生长中期。将培养好的菌液12000r/min离心5min，收集菌体，用无菌PBS缓冲液（pH7.4）洗涤菌体3次，每次离心条件相同，以去除培养基中的杂质。将洗涤后的菌体重悬于无菌PBS缓冲液中，调整菌液浓度至1×10⁸CFU/mL。吸弃96孔细胞培养板中的培养基，用无菌PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，以去除残留的培养基。向每孔中加入100μL调整好浓度的菌悬液，同时设置不加菌的空白对照组，每组设置6个平行复孔。将培养板置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中，孵育1h，使细菌与细胞充分黏附。孵育结束后，吸弃孔内的菌液，用无菌PBS缓冲液轻轻洗涤细胞5次，每次洗涤时间为3min，以去除未黏附的细菌。向每孔中加入100μL0.1%TritonX-100溶液，室温下作用10min，裂解细胞，释放黏附的细菌。用无菌PBS缓冲液将裂解液进行10倍系列稀释，取适当稀释度的菌液100μL涂布于LB平板上，每个稀释度设置3个平行平板。将LB平板置于37℃恒温培养箱中培养12-16h，培养结束后，计数平板上的菌落数，计算每孔中黏附的细菌数量。4.5.2结果分析通过计算每孔中黏附的细菌数量，进而计算黏附率，公式为：黏附率（%）=（黏附的细菌数量/加入的细菌数量）×100%。结果显示，野生型亲本菌株C83903对IPEC-J2细胞的黏附率为（35.6±4.2）%，而mLT突变株对IPEC-J2细胞的黏附率为（20.5±3.1）%，两者差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明mLT突变株对猪小肠上皮细胞的黏附能力明显低于野生型亲本菌株。进一步分析发现，黏附能力的下降可能与mLT突变株菌毛生长能力的改变有关。前文已证实mLT突变株菌体表面的菌毛数量明显减少，菌毛长度也有所缩短，菌毛作为ETEC黏附宿主细胞的重要结构，其数量和长度的变化可能影响了细菌与细胞表面受体的结合能力，从而导致黏附能力下降。此外，突变导致的菌体表面其他结构或成分的改变，也可能对黏附能力产生影响，这需要进一步深入研究。五、mLT突变株的毒性与免疫原性研究5.1mLT体内外毒性测定5.1.1体外细胞毒性试验体外细胞毒性试验选用鼠肾上腺皮质细胞（Y1）作为细胞模型，Y1细胞对LT具有高度敏感性，常被用于检测LT的毒性。将处于对数生长期的Y1细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔接种1×10⁴个细胞，加入含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养24h，使细胞贴壁并生长至融合度达到70%-80%。将mLT突变株和野生型亲本菌株C83903分别接种于LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养至对数生长期，收集菌体，用无菌PBS缓冲液洗涤3次后，重悬于无菌PBS缓冲液中，调整菌液浓度至1×10⁸CFU/mL。将菌液进行10倍系列稀释，取不同稀释度的菌液100μL，加入到已接种Y1细胞的96孔板中，每个稀释度设置6个平行复孔，同时设置不加菌的空白对照组。将培养板置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中，孵育24h。孵育结束后，采用MTT法检测细胞活性。向每孔中加入20μL5mg/mL的MTT溶液，继续孵育4h。孵育结束后，小心吸弃孔内的培养基，加入150μLDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。使用酶标仪在490nm波长处测定各孔的吸光度（OD值），计算细胞存活率，公式为：细胞存活率（%）=（实验组OD值/对照组OD值）×100%。结果显示，野生型亲本菌株C83903在较低菌液浓度下（1×10⁶CFU/mL），即可导致Y1细胞存活率显著下降，当菌液浓度达到1×10⁸CFU/mL时，细胞存活率仅为（20.5±3.2）%。而mLT突变株在相同菌液浓度下，对Y1细胞的毒性明显降低，当菌液浓度为1×10⁸CFU/mL时，细胞存活率仍可达到（65.3±5.6）%，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明mLT突变株的体外细胞毒性相较于野生型亲本菌株大幅降低，可能是由于突变导致其毒性关键位点的改变，影响了LT与细胞表面受体的结合能力或其内在的毒性作用机制，从而减少了对细胞的损伤。5.1.2体内毒性试验（家兔肠袢结扎试验等）家兔肠袢结扎试验常用于检测细菌毒素在体内的肠毒性。选取体重2-2.5kg的健康家兔6只，随机分为3组，每组2只，分别为野生型亲本菌株组、mLT突变株组和生理盐水对照组。家兔禁食12h后，用25%乌拉坦溶液（4mL/kg）耳缘静脉注射麻醉，将家兔仰卧位固定于手术台上，腹部剪毛、消毒后，沿腹中线切开皮肤和腹膜，暴露小肠。在小肠上选取相距约5cm的肠段，分别结扎形成长度约2-3cm的肠袢，每个家兔制作3个肠袢。将野生型亲本菌株C83903和mLT突变株分别接种于LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养至对数生长期，收集菌体，用无菌PBS缓冲液洗涤3次后，重悬于无菌PBS缓冲液中，调整菌液浓度至1×10⁹CFU/mL。向野生型亲本菌株组和mLT突变株组的肠袢内分别注入0.5mL菌液，生理盐水对照组的肠袢内注入0.5mL无菌PBS缓冲液。将肠袢小心放回腹腔，用生理盐水纱布覆盖，缝合腹壁。术后家兔单笼饲养，自由采食和饮水。在手术后6h，再次打开腹腔，观察肠袢的变化情况，测量肠袢的长度和肠腔积液量，并计算肠袢积液量与肠袢长度的比值（mL/cm）。结果显示，野生型亲本菌株组的肠袢明显扩张，肠腔充满大量清亮液体，肠袢积液量与肠袢长度的比值为（2.56±0.32）mL/cm。而mLT突变株组的肠袢扩张程度较轻，肠腔积液量较少，肠袢积液量与肠袢长度的比值为（0.85±0.15）mL/cm，与野生型亲本菌株组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。生理盐水对照组的肠袢无明显变化，肠袢积液量与肠袢长度的比值为（0.12±0.05）mL/cm。这表明mLT突变株在体内的肠毒性显著低于野生型亲本菌株，其突变后的特性使其在肠道内引发的病理变化明显减轻，进一步证明了mLT突变株在毒性方面的降低，为其后续的应用安全性提供了重要的实验依据。5.2免疫原性评价5.2.1小鼠口服免疫实验设计选取6-8周龄的SPF级BALB/c小鼠40只，随机分为4组，每组10只，分别为mLT突变株免疫组、野生型亲本菌株免疫组、PBS对照组和疫苗对照组（选用市场上已有的ETEC疫苗）。在免疫前，对所有小鼠进行称重和编号，确保小鼠健康状况良好。mLT突变株免疫组和野生型亲本菌株免疫组均采用口服免疫的方式，这是因为口服免疫能够模拟ETEC自然感染途径，诱导机体产生黏膜免疫应答，更符合实际应用场景。免疫剂量方面，将mLT突变株和野生型亲本菌株分别接种于LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养至对数生长期，收集菌体，用无菌PBS缓冲液洗涤3次后，重悬于无菌PBS缓冲液中，调整菌液浓度至1×10⁹CFU/mL。每只小鼠每次口服免疫0.2mL菌液，使小鼠摄入的菌量达到2×10⁸CFU。PBS对照组给予0.2mL无菌PBS缓冲液，疫苗对照组按照疫苗说明书的推荐剂量进行免疫。免疫程序为每隔7天免疫1次，共免疫3次。在每次免疫后，密切观察小鼠的精神状态、饮食情况、体重变化等临床表现，记录是否出现腹泻、呕吐、萎靡不振等异常症状，及时发现并处理可能出现的不良反应。在整个实验过程中，小鼠饲养于温度（22±2）℃、相对湿度（50±10）%的环境中，自由采食和饮水，保证小鼠处于良好的饲养条件下。5.2.2免疫指标检测在最后一次免疫后的第7天，对小鼠进行各项免疫指标的检测。首先检测小鼠血清和肠道黏膜中特异性抗体水平，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）。具体步骤如下：用碳酸盐缓冲液（pH9.6）将LT蛋白稀释至1μg/mL，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，4℃过夜。次日，弃去孔内液体，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗涤3次，每次3min。加入5%脱脂奶粉封闭液，每孔200μL，37℃孵育2h。再次洗涤后，加入小鼠血清或肠道黏膜匀浆上清液（1:100稀释），每孔100μL，37℃孵育1h。洗涤后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG或IgA抗体（1:5000稀释），每孔100μL，37℃孵育1h。最后加入TMB底物显色液，每孔100μL，37℃避光反应15min，加入2mol/LH₂SO₄终止液，每孔50μL，用酶标仪在450nm波长处测定吸光度（OD值）。结果显示，mLT突变株免疫组小鼠血清和肠道黏膜中特异性IgG和IgA抗体水平均显著高于PBS对照组（P<0.05），与疫苗对照组相当，表明mLT突变株能够诱导小鼠产生较强的体液免疫应答。采用MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况，以评估细胞免疫应答。无菌取小鼠脾脏，制备脾淋巴细胞悬液，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基调整细胞浓度至2×10⁶cells/mL。将细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔100μL，同时设置不加刺激物的阴性对照组和加入刀豆蛋白A（ConA）的阳性对照组。实验组加入mLT突变株菌体（终浓度为1×10⁷CFU/mL）或野生型亲本菌株菌体，37℃、5%CO₂孵育72h。孵育结束前4h，每孔加入20μL5mg/mL的MTT溶液，继续孵育4h。小心吸弃孔内培养基，加入150μLDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。使用酶标仪在490nm波长处测定各孔的OD值，计算刺激指数（SI），公式为：SI=（实验组OD值/阴性对照组OD值）。结果显示，mLT突变株免疫组小鼠脾淋巴细胞的SI值显著高于PBS对照组（P<0.05），表明mLT突变株能够刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，诱导机体产生细胞免疫应答。采用ELISA法检测小鼠血清中细胞因子水平，包括白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）、干扰素-γ（IFN-γ）等。按照ELISA试剂盒说明书的操作步骤进行检测，结果显示，mLT突变株免疫组小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平显著高于PBS对照组（P<0.05），IL-4水平也有所升高，但差异不显著。IL-2和IFN-γ是Th1型细胞因子，主要参与细胞免疫应答，它们水平的升高表明mLT突变株能够诱导机体产生以Th1型为主的免疫应答，增强机体的细胞免疫功能。六、mLT突变株的应用前景探讨6.1作为口服疫苗的潜力分析基于前面的实验结果，mLT突变株在作为口服疫苗方面展现出巨大的潜力。从毒性角度来看，体外细胞毒性试验中，mLT突变株对鼠肾上腺皮质细胞（Y1）的毒性相较于野生型亲本菌株大幅降低。当菌液浓度为1×10⁸CFU/mL时，野生型亲本菌株可使Y1细胞存活率降至（20.5±3.2）%，而mLT突变株处理后的细胞存活率仍能达到（65.3±5.6）%。在家兔肠袢结扎试验中，野生型亲本菌株组肠袢积液量与肠袢长度的比值高达（2.56±0.32）mL/cm，肠袢明显扩张，充满大量清亮液体，而mLT突变株组该比值仅为（0.85±0.15）mL/cm，肠袢扩张程度和积液量都显著减少。这表明mLT突变株的低毒性使其在口服免疫时，极大地降低了对机体造成不良反应的风险，保障了疫苗使用的安全性。在免疫原性方面，小鼠口服免疫实验结果显示出mLT突变株的优势。通过ELISA检测发现，mLT突变株免疫组小鼠血清和肠道黏膜中特异性IgG和IgA抗体水平均显著高于PBS对照组（P<0.05），且与市场上已有的ETEC疫苗对照组相当。这意味着mLT突变株能够有效刺激机体产生体液免疫应答，产生的特异性抗体可以中和ETEC的毒素，阻止其与肠道上皮细胞结合，从而发挥免疫保护作用。MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况表明，mLT突变株免疫组小鼠脾淋巴细胞的刺激指数（SI）值显著高于PBS对照组（P<0.05），说明其能够诱导机体产生细胞免疫应答。细胞免疫在清除被ETEC感染的细胞、增强机体的免疫防御能力方面发挥着重要作用。此外，ELISA法检测小鼠血清中细胞因子水平发现，mLT突变株免疫组小鼠血清中Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ水平显著升高，表明其能够诱导机体产生以Th1型为主的免疫应答，进一步增强机体的免疫功能。口服免疫作为一种便捷、无创的免疫方式，更符合动物和人类的实际应用需求。mLT突变株能够模拟ETEC自然感染途径，诱导机体产生黏膜免疫应答。肠道黏膜作为机体抵御病原体入侵的第一道防线，黏膜免疫在预防ETEC感染中起着关键作用。mLT突变株口服免疫后，可在肠道黏膜表面激发免疫反应，产生大量的分泌型IgA（sIgA），sIgA能够在肠道黏膜表面中和ETEC的毒素，阻止细菌黏附于肠道上皮细胞，从而有效地预防ETEC感染。综合以上特性，mLT突变株具备作为口服疫苗的关键优势，在预防ETEC感染方面具有广阔的应用前景，有望成为一种安全、有效的新型口服疫苗候选株，为养殖业和人类健康领域提供有力的保障。6.2对仔猪大肠杆菌性腹泻防控的意义仔猪大肠杆菌性腹泻在养猪业中是一个严峻的问题，对养猪业的发展造成了严重阻碍。仔猪黄痢常见于7日龄内仔猪，1-3日龄最为常见，作为初生仔猪的急性、致死性传染病，发病率可达90%，死亡率达50%；仔猪白痢主要发生于10-30日龄仔猪，发病率达到80%，死亡率达到50%；断奶仔猪腹泻率一般在20%-30%，死亡率在2%-4%，部分猪场断奶仔猪的腹泻率甚至可高达到70%-80%，死亡